大前庭水管綜合征家系特征與SLC26A4基因分析

李伍高嚴提珍曾定元唐寧李哲濤唐向榮覃文華羅世強楊艷柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室（廣西柳州5500）2柳州市婦幼保健院醫(yī)學遺傳科（廣西柳州5500）柳州市婦幼保健院聽力診斷中心（廣西柳州5500）柳州市婦幼保健院放射科（廣西柳州5500）

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大前庭水管綜合征家系特征與SLC26A4基因分析

李伍高1，2嚴提珍1，2曾定元1唐寧1，2李哲濤1，2唐向榮3覃文華4羅世強1，2楊艷3
1柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室（廣西柳州545001）
2柳州市婦幼保健院醫(yī)學遺傳科（廣西柳州545001）
3柳州市婦幼保健院聽力診斷中心（廣西柳州545001）
4柳州市婦幼保健院放射科（廣西柳州545001）

【摘要】目的分析一個大前庭水管綜合征家系的臨床特征和SLC26A4基因檢測特點。方法對一個大前庭水管綜合征家系進行病史采集和聽力學檢測，繪制耳聾家系系譜圖，提取受檢者的基因組DNA，對所有家系成員進行耳聾基因芯片分析和SLC26A4基因全外顯子及外顯子側(cè)翼序列的檢測。結(jié)果該家系共5代合計30人（男17人，女13人），現(xiàn)存26人，其中第四代7人為耳聾患者，6人均為語前感音神經(jīng)性聾。1人為語后感音神經(jīng)性聾，顳骨CT顯示均為前庭水管擴大，第五代1人為耳聾患者，表現(xiàn)為前庭水管擴大合并語前感音神經(jīng)性聾。在家系中共發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因c.754C＞T、c.919-2A＞G、c.1264-12T＞A和c.1548_1549insC四種已知致病突變類型。耳聾患者均為復合雜合突變。10人為SLC26A4基因攜帶者。結(jié)論該家系的8例耳聾患者由SLC26A4基因復合雜合突變導致前庭水管擴大，病因?qū)W分析可為患者提供預見性的臨床措施，并為該家系的后代遺傳咨詢與婚育指導提供理論依據(jù)及科學手段，有效地防止聾兒后代出生。

【關鍵詞】前庭導水管擴大綜合征；SLC26A4基因；基因芯片；Sanger測序；基因突變

Funding:This work was funded by a grant from the National Natural Science Fund of China（NSFC，No.81360159），a grant from the Technology Research and Development program of Guangxi（No.14124004-1-20），a grant from Liuzhou Science and Technology Development Funds（No.2014J030401）and a grant from the Technology Research and Development program of Liuzhou（No.2014G020404）.

Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.

大前庭水管綜合征（large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）是上世紀70年代末隨CT問世而發(fā)現(xiàn)的遺傳性耳聾患兒中最常見的一種內(nèi)耳發(fā)育畸形性疾病，也是一種常染色體隱性遺傳性聽力障礙性疾?。?］。主要表現(xiàn)為前庭水管擴大合并感音神經(jīng)性或混合性耳聾，一般不伴有其他內(nèi)耳發(fā)育異常和其他器官系統(tǒng)的異常。LVAS的致病基因定位在人類染色體7q31的SLC26A4基因上，該基因編碼Pendrin蛋白，可導致Pendred綜合征［2，3］。本研究應用耳聾基因芯片技術聯(lián)合Sanger測序法對一個非綜合征性大前庭水管綜合征家系進行SLC26A4基因檢測，分析SLC26A基因的遺傳特征。

1　資料與方法

1.1家系調(diào)查方法

本研究家系的調(diào)查分析已獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會的倫理認證及認可。家系（編號E40 和E44）位于廣西柳州市柳城縣東泉鎮(zhèn)，兩個家系有親屬關系，因此合并為大家系進行分析。先證者1和先證者2于2013年8月就診于柳州市婦幼保健院聽力診斷中心，分別進行了純音測聽、聲導抗、聽性腦干反應、DPOAE及顳骨CT掃描檢查，該家系成員無明確的耳毒性藥物應用史及噪聲接觸史，不伴其他器官系統(tǒng)異常。2013年9月對該家系所有受檢者進行了詳細的病史詢問、嚴格的專科檢查及聽力學檢測。耳聾的表型判斷標準依據(jù)王秋菊［4］編譯的《關于非綜合征型遺傳性聽損傷家系遺傳學及聽力學描述術語建議案》。根據(jù)Valvassori等［1］的顳骨CT診斷標準：前庭水管的外口與總腳或峽部間中點處直徑大于1.5 mm即為前庭水管擴大。

1.2DNA提取和濃度測定

采取受檢對象及家系成員的外周靜脈血3～5 ml（EDTA.K2抗凝）。利用試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA，提取步驟參照試劑盒使用說明進行。利用ASP-2680微量分光光度計（美國ACTGene公司）對樣本的基因組DNA的提取質(zhì)量和濃度進行檢測。DNA樣本的OD260nm/ OD280nm比值應在1.6～2.0之間，OD260nm/ OD230nm比值需≥2.0，濃度需≥50 ng/L。

1.3耳聾基因芯片檢測

應用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒（北京博奧生物有限公司）對GJB2基因的c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299delAT，GJB3基因的c.538C＞T，SLC26A4基因的c.919-2 A＞G、c.2168A＞G，線粒體12S rRNA基因的m.1494C＞T、m.1555A＞G等4個耳聾基因共9個突變位點進行檢測。設備為晶芯LuxS-canTM10K-A微陣列芯片掃描儀及配套軟件。

1.4DNA測序檢測

采用Sanger測序針對SLC26A4進行序列分析。引物序列見參考文獻［5］，PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，選取PCR擴增產(chǎn)物純化，測序標本外送廣州立菲測序有限公司進行檢測。

1.5序列比對分析

Sanger測序結(jié)果用DNAStar軟件包中的Seqman軟件與NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的SLC26A4標準序列（NC_000007.13）進行序列比對分析。

2　結(jié)果

2.1家系系譜圖和聽力學特征

家系系譜圖見圖1，該家系共5代合計30人（男17人，女13人），現(xiàn)存26人，年齡介于4～77歲之間，共8人患雙耳感音神經(jīng)性耳聾。先證者1（Ⅳ:3）4歲，先證者2（V:1）2歲，均于出生時進行了聽力篩查，初篩和復篩結(jié)果均未通過，純音聽閾測試顯示雙耳對稱性極重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線呈下降型，顳骨CT掃描結(jié)果顯示前庭水管擴大（見圖2A和2B）。先證者1（Ⅳ:3）的父母聽力正常，先證者2（V:1）的父母均為前庭水管擴大合并雙耳對稱性極重度感音神經(jīng)性耳聾患者（Ⅳ:8和Ⅳ:9）?；颊撸á?1、Ⅳ:2、Ⅳ:7、Ⅳ:8、Ⅳ:9）均于出生時發(fā)病，均表現(xiàn)為雙耳對稱性極重度感音神經(jīng)性耳聾，聽閾曲線雙耳對稱均為下降型，顳骨CT掃描結(jié)果均顯示前庭水管擴大。患者（Ⅳ:10）于14歲出現(xiàn)聽力下降，隨后表現(xiàn)為雙耳對稱性進行性加重的重度感音神經(jīng)性耳聾，CT掃描結(jié)果也顯示前庭水管擴大。其他家庭成員聽力正常。從系譜圖可見，該家系符合常染色體隱性遺傳性耳聾特征。

圖1　耳聾家系系譜圖Fig.1 Pedigree of deafness family

圖2　大前庭水管顳骨CT示意圖A：患者IV:3顳骨CT示意圖（右側(cè)）；B：先證者V:1顳骨CT示意圖（右側(cè)）。Fig.2 The CT scaning of LVAS Patients.A:The CT diagram of patient IV:3；B:The CT diagram of proband V:1.

2.2耳聾基因芯片的檢測結(jié)果

基因芯片法檢出患者（Ⅳ:9）攜帶SLC26A4基因c.919-2A＞G單雜合突變，先證者和其他家系成員未發(fā)現(xiàn)突變?；颊撸á?9）的基因芯片圖譜見圖3。

圖3　患者（Ⅳ:9）的基因芯片結(jié)果A：c.919-2A＞G/WT；B：正常對照；C：空白對照（SBC）Fig.3 Gene chip profiling in a deafness patient（Ⅳ:9）.A:c.919-2A＞G carrier；B:Normal control；C:Sample Blank Control（SBC）.

2.3SLC26A4基因Sanger測序結(jié)果

因先證者和其他患者顳骨CT結(jié)果均顯示為前庭水管擴大綜合征患者，基因芯片篩查常見的SLC26A4基因c.919-2 A＞G和c.2168A＞G突變，僅在患者（Ⅳ:9）發(fā)現(xiàn)單雜合突變，為明確病因，本研究設計引物，通過PCR擴增及Sanger測序?qū)LC26A4基因全外顯子進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者1（Ⅳ:3）為c.1264-12T＞A和c.1548_1549insC復合雜合突變，其哥哥和姐姐均為耳聾患者，其基因型與Ⅳ:3相同。Ⅱ:2、Ⅲ:2、Ⅲ:3、Ⅲ:6、Ⅲ7、Ⅳ:5和Ⅳ:6為SLC26A4基因突變攜帶者，Ⅱ:1、Ⅱ:4、Ⅱ:5、Ⅲ:1、Ⅲ:8、Ⅳ:4基因型正常。先證者2（V:1）為c.754T＞C和c.1548_1549insC復合雜合突變，其父親（IV:7）基因型與V:1相同，其母親（Ⅳ:8）為c.919-2A＞G和c.1548_1549insC復合雜合突變。Ⅳ:7、Ⅳ:10的基因型與Ⅳ:8相同。Ⅱ:5、Ⅲ:9、Ⅲ:10均為SLC26A4基因突變攜帶者，Ⅱ:6和Ⅲ:11基因型正常。家系各成員基因檢測結(jié)果見表1，基因突變的測序結(jié)果見圖4。

圖4　SLC26A4基因Sanger測序圖譜Fig.4 Sanger sequencing chromatograms of the SLC26A4 gene.WT represents wild type.Arrow indicates the position of mutation.

3　討論

大前庭水管綜合征的聽力學特點多表現(xiàn)為雙側(cè)進行性感音神經(jīng)性耳聾，CT或MRI提示前庭水管或內(nèi)淋巴囊擴大［6］，不同個體在出生時聽力損傷程度具有較大差別，從聽力完全正常至極重度聽力障礙，頭部外傷、劇烈體育活動、頭部倒立、感冒、用力擤鼻或咳嗽等可造成明顯聽力下降。早期診斷并采取正確防護措施，有助于保留患者的殘余聽力，維持生活質(zhì)量。對于本研究家系發(fā)現(xiàn)的8例耳聾患者，其中7例患者自出生后即對聲音反應差，表現(xiàn)為言語障礙，純音測聽及聽性腦干反應檢測結(jié)果提示極重度感音神經(jīng)性耳聾；1例（Ⅳ:10）出生至14歲前聽力正常，14歲加入學?；@球隊參加訓練后，發(fā)現(xiàn)聽力逐漸下降，隨后發(fā)展為雙耳進行性極重度感音神經(jīng)性耳聾。全部患者高分辨率顳骨CT顯示前庭水管擴大，未合并其它內(nèi)耳畸形。體格檢查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)頸部腫大，甲狀腺功能均正常。對于Ⅳ:10患者若在其出生時、入學前或最初發(fā)生聽力損失的時候進行耳聾基因診斷或影像學檢查，早期確診，就可能通過改變生活模式，加強聽覺防護等措施延緩或防止聽力下降，獲得更好的生活質(zhì)量。

表1　家系成員臨床表型和基因型Table 1 Clinical phenotype and genotype of family members

1999年，Usami等［5］把大前庭水管綜合征的基因定位在7q31（即SLC26A4基因），其包括21個外顯子（1號外顯子不參與編碼），mRNA全長為4930 bp，開放閱讀框架為2343 bp。SLC26A4基因編碼的蛋白為Pendrin蛋白，由780個氨基酸組成，主要表達于內(nèi)耳的內(nèi)淋巴囊和淋巴管，介導Cl-、HCO3-、I-的轉(zhuǎn)運，維持內(nèi)淋巴液的離子平衡，對內(nèi)耳內(nèi)淋巴液的再吸收具有重要的作用［7］。SLC26A4基因突變可導致Pendred綜合征和呈常染色體隱性遺傳的非綜合征性聾DFNB4。目前報道的SLC26A4基因的突變位點已超過240個（http://www.healthcare.uiowa.edu/labs/pendredandbor/slcMutations.htm），其中絕大部分是錯義突變（占86％左右），另外還有剪接位點突變和移碼突變等。這些突變在mRNA鏈上的分布無明顯聚集現(xiàn)象。SLC26A4基因的突變在LVAS病人中檢出率我國為92.1～95.4％［7］。SLC26A4基因具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，研究發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因在中國正常人群中有較高的攜帶率為3％，在中國耳聾人群中c.919-2A＞G和c.2168A＞G是熱點突變［8］。

本研究利用基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術通過對一個大家系中8例耳聾患者及18例正常聽力家系成員進行SLC26A4基因檢測，發(fā)現(xiàn)c.1548_1549insC、c.1264-12T＞A、c.919-2A＞G、c.754T＞C四種突變。這四種突變在既往文獻中已有報道，其致病性明確，且c.919-2A＞G（ⅣS7-2A＞G）為中國人群中的熱點突變，其它三種為非熱點突變。c.1548_1549insC（p.S517fs）移碼突變使終止密碼子提前出現(xiàn)，產(chǎn)生僅有525個氨基酸的截短蛋白，影響pendrin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［9］；2007年國內(nèi)學者Hu等［10］首次報道了c.1264-12T＞A（ⅣS10-12T＞A）突變，該突變導致11號外顯子的丟失，使外顯子10和12直接相連，隨后相繼有研究團隊在湖南地區(qū)大前庭水管綜合征患者中也發(fā)現(xiàn)該突變［11］，目前該突變只在中國人群中報道過，其他人群尚未見報道；c.919-2A＞G突變位點位于外顯子8剪接位點的位置（即內(nèi)含子7的3'末端），它的突變使前體mRNA無法正常剪接，整個外顯子8丟失，外顯子7和9直接相連，從而導致pendrin的翻譯發(fā)生移碼或提前終止，影響pendrin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［9］；中國解放軍總醫(yī)院戴樸研究團隊在全國耳聾分子流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)c.919-2 A＞G在耳聾患者中的檢出率高達12.69％，該突變頻率占該基因總突變的57.63％［8］；c.754T＞C（p.S252P）為錯義突變，導致絲氨酸改變?yōu)楦彼?，最終影響pendrin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)8名患者攜帶SLC26A4雙等位基因的復合雜合突變，經(jīng)顳骨高分辨CT診斷均為LVAS患者；10名成員攜帶SLC26A4單個等位基因突變，均為聽力正常者。家系遺傳圖譜顯示，第四代（Ⅳ:1、Ⅳ:2和Ⅳ:3）基因檢測結(jié)果均為c.1264-12T＞A和c.1548_ 1549insC的復合雜合突變，其父母（Ⅲ:2和Ⅲ:3）聽力正常，但分別是c.1548_1549insC和c.1264-12T＞A的突變攜帶者；第四代（Ⅳ:7、Ⅳ:8和Ⅳ:10）基因檢測結(jié)果均為c.754T＞C和c.1548_1549insC的復合雜合突變，其父母（Ⅲ:9和Ⅲ:10）聽力正常，但分別是c.754T＞C和c.1548_1549insC的突變攜帶者。第五代（V:1）基因檢測結(jié)果為c.754T＞C和c.1548_1549insC復合雜合突變，其父母均為耳聾患者，父親是c.754T＞C和c.1548_1549insC復合雜合突變，母親為c.919-2A＞G 和c.1548_1549insC復合雜合突變，V:1的c.754T＞C突變等位基因來自父親，c.1548_1549insC突變等位基因來自母親。由此可見，SLC26A4突變的等位基因會穩(wěn)定地由親代向子代傳遞。

目前大部分基層醫(yī)療機構(gòu)和醫(yī)務人員尚未充分認識防聾治聾工作的緊迫性和重要性，聾啞人之間婚配比例較高，婚配生育缺少醫(yī)療機構(gòu)的系統(tǒng)有效的指導和干預；同時由于感音神經(jīng)性耳聾的不可逆性及治療的高成本性，目前臨床醫(yī)務人員的工作重點為如何實現(xiàn)耳聾的預防及早期干預。SLC26A4基因突變是LVAS的根本性致病因子，遵循常染色體隱性遺傳規(guī)律，這為臨床開展LVAS的基因診斷和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)［12］。產(chǎn)前診斷對于已生育過大前庭水管綜合征聾兒的家庭來說，超過70％的家庭可以通過基因診斷明確病因，并將再次生育聾兒的風險由25％降低到1～3‰，從而避免因聾兒出生而帶來沉重的負擔。為達到對耳聾的一級預防，需要對家系中聽力正常成員進行SLC26A4基因的篩查，對于篩查查出的攜帶者（如Ⅳ:5和Ⅳ:6），婚育前需要進一步對其配偶進行SLC26A4基因的篩查。本家系患者（Ⅳ:1、Ⅳ:2、Ⅳ:3、Ⅳ:7、Ⅳ:10和V:1）在婚育前，需對其配偶進行耳聾基因診斷，以避免因后者也攜帶SLC26A4基因突變，而使他們生育聾兒的幾率高達50％以上。值得注意的是先證者（V:1）的父親為LVAS患者（基因型為c.754T＞C/c.1548_1549insC），選擇了同為LVAS患者的女性（基因型為c.919-2A＞G/c.1548_1549insC）結(jié)婚，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，該家庭生出大前庭水管綜合征患兒的風險率為100％，無法通過產(chǎn)前診斷或植入前產(chǎn)前診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）再生育一個聽力正常的小孩，只能通過早干預、早治療來提高患者的生活質(zhì)量。此外，基因診斷可先于影像學檢查診斷LVAS患者，減少嬰幼兒患者早期暴露子CT檢查放射線輻射的風險。目前，使重度感音神經(jīng)性耳聾患者回到有聲世界的最好辦法是人工耳蝸植入術，由于SLC26A4突變主要影響內(nèi)耳的功能，這提示LVAS患者將會有良好的人工耳蝸康復效果。

至今發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變具有明顯的異質(zhì)性。其突變的種類眾多，且不同種族人群的SLC26A4基因突變圖譜不相同，不同的種族找到SLC26A4雙等位基因的比率亦不相同。研究發(fā)現(xiàn)約有10～20％的LVAS患者只能篩查到SLC26A4單等位基因突變或未發(fā)現(xiàn)任何突變，可能的原因是SLC26A4基因的啟動子區(qū)域或者具有潛在剪接位點的內(nèi)含子區(qū)存在突變，也可能與該基因拷貝數(shù)變異有關［13，14］。隨著檢測技術的普及和檢測成本的下降，高通量測序是未來檢測遺傳性耳聾基因的必然趨勢。

綜上所述，耳聾基因診斷可以在分子水平明確大前庭水管綜合征的病因，開展遺傳咨詢、婚育指導、耳聾預測及出生缺陷的干預。隨著測序分析準確性高，靈敏性強，且成本越來越低，自動化程度越來越高，通量越來越大，可實現(xiàn)對先證者及其家系成員的SLC26A4基因突變位點的快速篩查，確診患者及攜帶者，為該家系及其同類事件的發(fā)生提供正確而準確的臨床醫(yī)學指導。在患者將來婚配時對其配偶進行相應位點基因檢測，通過產(chǎn)前耳聾基因檢測來指導生育，以預防其生育耳聾后代，達到耳聾的一級預防，減輕社會及家庭的負擔。

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Clinical features and gene analysis in a large Chinese family with large vestibular aqueduct syndrome

LI Wugao1，2，YAN Tizhen1，2，Zeng Dingyuan1，TANG Ning1，2，LI Zhetao1，2，TANG Xiangrong3，QIN Wenhua4，LUO Shiqiang1，2，YANG Yan3
1 Liuzhou Key Laboratory for Birth Defects Prevention and Control，Liuzhou，545001，China
2 Department of Medical Genetics，Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，545001，China
3 Hearing Diagnosis Center，Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，545001，China
4 Department of Radiology，Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，545001，China
Corresponding author:YAN TizhenEmail:439078813@qq.com

【Abstract】Objective To report clinical and SLC26A4 assessment results of a large Chinese family with large vestibular aqueduct syndrome（LVAS）.Methods The family tree was drawn based on medical history and audiological findings.Gene microarray and Sanger sequencing were performed using the genome DNA of the probands and other patients.The sequencing data were analyzed.Results There were 30 people（17 males and 13 females）in this family of 5 generations.Twenty-six were alive.There were 7 deaf patients in the fourth generation and 1 in the fifth generation.The clinical characteristics included pre- and post-lingual severe sensorineural hearing loss and enlarged vestibular aqueduct.A total of 4 known types of SLC26A4 mutations（c.754C＞T，c.919-2A＞G，c.1264-12T＞A and c.1548_1549insC）were identified.Conclusion Hearing loss in the eight patients in this family is probably caused by various biallelic mutations of the SLC26A4 gene.Etiology analysis can predict clinical therapies required in these patients and provide a basis for marriage and repro-duction counseling.

【Key words】Large vestibular aqueduct syndrome（LVAS）；SLC26A4 gene；Gene microarray；Sanger sequencing；Gene mutationidentified in the large family.

【中圖分類號】R764

【文獻標識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-234-6

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.022

基金項目：國家自然科學資金項目（81360159）、廣西科技攻關項目（桂科攻14124004-1-20）、柳州市科技攻關項目（2014J030401）、柳州市科學研究與技術開發(fā)計劃項目研究成果資助（2014G020404）

作者簡介：李伍高，本科，技師，研究方向:遺傳病的分子基礎和基因診斷

通訊作者：嚴提珍，Email:439078813@qq.com

收稿日期：（2015-10-09審核人：冰丹）