葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)檢測塑化劑對尖細(xì)柵藻的毒性效應(yīng)

劉常青謝 慕趙 劍周香君付陶然陳蘭洲（.武漢大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430072； 2.孝感市中心醫(yī)院，孝感 432000）

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)檢測塑化劑對尖細(xì)柵藻的毒性效應(yīng)

劉常青1，2謝 慕1趙 劍1周香君1付陶然1陳蘭洲1
（1.武漢大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430072； 2.孝感市中心醫(yī)院，孝感 432000）

摘要：以漢江水華藻類尖細(xì)柵藻Scenedesmus acuminatus為材料，研究了塑化劑（鄰苯二甲酸二異辛酯，DEHP）對其光合系統(tǒng)的毒性效應(yīng)。以不同濃度的DEHP處理S.acuminatus，分析其光合系統(tǒng)電子傳遞特征及相關(guān)參數(shù)，以及快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力曲線，發(fā)現(xiàn)低濃度的DEHP（10 mg/L）對S.acuminatus活性反應(yīng)中心的電子傳遞鏈中?的還原有促進(jìn)作用，而高濃度（50—100 mg/L）則顯著抑制； 光合活性則與DEHP濃度呈效應(yīng)-劑量關(guān)系，最大光化學(xué)效率降低； 同時DEHP顯著降低SOD活性，增加MDA含量，而且隨DEHP濃度升高，處理時間的延長，效果越明顯。研究結(jié)果表明，DEHP處理對S.acuminatus的光合系統(tǒng)傳遞鏈和抗氧化系統(tǒng)有一定的影響，說明快速熒光動力方法能夠應(yīng)用于DEHP毒性效應(yīng)的快速檢測。

關(guān)鍵詞：尖細(xì)柵藻； 塑化劑； 毒性效應(yīng)； 快速熒光動力曲線； 光合系統(tǒng)

鄰苯二甲酸二異辛酯（di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）作為增塑劑，應(yīng)用于塑料薄膜（特別是聚氯乙烯PVC）的生產(chǎn)加工過程中［1］。DEHP在PVC中用量為30%，其主要作用為可使塑料軟化。DEHP在環(huán)境中比較穩(wěn)定且難以降解，如室溫條件下進(jìn)入土壤的DEHP在6個月后仍有75%—90%的殘留［2，3］。DEHP在動物體內(nèi)，首先是在脂肪酶作用下水解為水溶性代謝產(chǎn)物，而MEHP及其他代謝產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，將血液保存于含DEHP的塑料血袋內(nèi)后，因紅細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致血細(xì)胞溶血加劇。小鼠和藻細(xì)胞中DEHP誘導(dǎo)活性氧（ROS）以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，可能是造成毒性作用的主要原因［5—7］。

隨著經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展加快，DEHP的使用量逐年上升，導(dǎo)致水體和土壤中塑化劑污染也日益增強(qiáng)。作為在眾多水體中均存在的典型污染物，鄰苯二甲酸酯（PAEs）在漢江中檢出多達(dá)53種［8］。作為水生生態(tài)系統(tǒng)第一營養(yǎng)級的藻類，漢江水華藻類尖細(xì)柵藻（Scenedesmus acuminatus）往往直接暴露在水體中塑化劑的毒性作用下。由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，對毒性作用敏感，研究其生理效應(yīng)對水體中塑化劑濃度的響應(yīng)，特別是藻體葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力（OJIP-test）及電子傳遞鏈等快速變化反應(yīng)［9］，對于評估塑化劑的毒害作用，有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)及DEHP處理

尖細(xì)柵藻（Scenedesmus acuminatus）為漢江水華優(yōu)勢藻類，由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻類典型培養(yǎng)物保藏中心（編號：FACHB-1221）提供。采用BG-11培養(yǎng)基，于光照培養(yǎng)箱中恒溫（25±1）℃，24h持續(xù)光照，光強(qiáng)50 μE/（m2·s），通氣培養(yǎng)。取50 mL對數(shù)期尖細(xì)柵藻的藻液，4500 r/min的速度下離心10min，離心后藻培養(yǎng)物待用。

取4個盛有50 mL滅菌BG-11培養(yǎng)液的三角燒瓶，分別加入0、10、50和100 mg/L鄰苯二甲酸二異辛酯（DEHP，98%+）及25 μL二甲亞砜（DMSO），然后于25℃、100 W功率進(jìn)行超聲振蕩，并快速搖勻，直至培養(yǎng)基呈乳化狀并無油狀DEHP漂浮在液體表面。隨后將離心后的藻培養(yǎng)物加入DEHP培養(yǎng)基中，充分混勻，震蕩培養(yǎng)，分別處理1—4d。

1.2 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)測定

取不同濃度塑化劑處理藻液，以變攜式植物效率分析儀（PEA，Hansatech，U.K.）測定葉綠素a熒光。激發(fā)光強(qiáng)為最大光強(qiáng)的50%［約1500 μE/（m2·s）］，暗適應(yīng)時間不少于10min，記錄時間為5s。連續(xù)激發(fā)式熒光儀（PEA）主要是通過短時間照光后熒光信號的瞬時變化反映暗反應(yīng)活化前PSⅡ的光化學(xué)變化，記錄從10μs 最長到300s（Handy-PEA）內(nèi)不同時間的熒光信號，并根據(jù)等方法計(jì)算光合電子傳遞參數(shù)變化［9］。

1.3 葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

取不同濃度塑化劑處理后藻液，7000 r/min離心10min，棄去上清液，加入80%的丙酮充分研磨，在4℃下黑暗抽提24h，7000r/min離心10min，測定750、663、645和630 nm處的吸光度值，以傅若農(nóng)等［10］方法計(jì)算葉綠素a、b含量。

另取2 mL藻液，以硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量［11］； 取藻液10 mL，以氮藍(lán)四唑（NBT）法測定其超氧化物歧化酶（SOD）活性［11］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)分析采用 oneway analysis of variance（ANOVA），結(jié)果為多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（n≥3）。

2 結(jié)果

2.1 DEHP脅迫下快速葉綠素?zé)晒鈩恿η€

如圖 1所示，以0、10、50和100 mg/L DEHP處理1d后，尖細(xì)柵藻熒光強(qiáng)度隨濃度O、J、I、P相變化正常，但低濃度的DEHP（10 mg/L）對S.acuminatus活性反應(yīng)中心的電子傳遞鏈中的還原有促進(jìn)作用，而高濃度（100 mg/L）則變化不顯著； 處理2d后，不同濃度DEHP處理的熒光強(qiáng)度值均低于對照組，但O、J、I、P相形狀保持正常； 處理3d后，各濃度熒光動力學(xué)曲線的熒光強(qiáng)度顯著低于對照組，并隨濃度繼續(xù)增加熒光產(chǎn)量下降； 處理4d后，熒光強(qiáng)度均顯著低于對照組，并隨濃度增加熒光產(chǎn)量顯著下降，J相變化顯著，表明反應(yīng)中心的熒光產(chǎn)量有顯著影響。

2.2 DEHP脅迫下電子傳遞鏈參數(shù)變化

圖 1 不同濃度DEHP處理下尖細(xì)柵藻的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線變化

根據(jù)不同濃度的DEHP脅迫下尖細(xì)柵藻的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的參數(shù)變化情況（表 1），單位面積內(nèi)反應(yīng)中心數(shù)量（RC-CSM）減小，但100 mg/L處理4d時差別顯著（P<0.05）； 而單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）隨處理時間而增加，但高濃度在3—4d差別顯著（P<0.05），而單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量（ET0/RC）變化不大，對藻細(xì)胞吸收的光能無明顯變化，同時也增加了用于氧化態(tài)接受電子被還原的能量。

表 1 不同濃度DEHP脅迫下尖細(xì)柵藻的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)變化Tab.1 The parameters of chlorophyll fluorescence induction kinetics under different levels of DEHP concentrations in S.acuminatus.

由圖 2可發(fā)現(xiàn)，DEHP對于尖細(xì)柵藻光合作用效率的影響，隨時間的增加，其最大光化學(xué)效率逐漸降低，且DEHP濃度越大，降低速率越快，在處理3d后，100 mg/L處理組的Fv/Fm下降明顯（P<0.05）。表明DEHP與光合效率在一定范圍內(nèi)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 DEHP脅迫對葉綠素含量的影響

圖 2 不同濃度DEHP對尖細(xì)柵藻最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的影響

如圖 3所示，處理1d后，各濃度下細(xì)胞葉綠素a和b含量均增加，10 mg/L處理組增加值最高； 隨處理時間的延長，葉綠素含量逐漸下降，但仍高于對照組； 50 mg/L處理2d時，葉綠素a含量基本恢復(fù)到原有水平，3d時有顯著回升，較對照組增加；100 mg/L處理組在最初受到DEHP時小幅度增加，但隨后隨時間增加，葉綠素a和b含量顯著減少?？傮w上，葉綠素b對DEHP的敏感程度要強(qiáng)于葉綠素a，變化更明顯； 濃度越大，DEHP脅迫對尖細(xì)柵藻葉綠素含量的影響越大，但破壞作用不明顯。

2.4 丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性變化

丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。如圖 4所示，在加入DEHP后MDA含量明顯高于對照組，隨時間累積，MDA含量增加； 并且DEHP濃度越大，其增加速率越快，100 mg/L 處理4d后MDA含量已為對照組的4.3倍，證明藻細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了嚴(yán)重的膜脂質(zhì)過氧化。

如圖 5所示，在加入DEHP后，藻細(xì)胞內(nèi)SOD的活性均下降?？傮w來說，其濃度越大，SOD的下降幅度也越大，且這種變化隨時間的增加而持續(xù)進(jìn)行。10 mg/L 處理組在3d后SOD酶僅為對照組的85.6%，而100 mg/L處理組在3d后SOD值下降到對照組的62%。

3 討論

藻類在遭遇外源污染物處理時，其光合系統(tǒng)PSII往往首先受到影響。而單細(xì)胞藻類由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，對外源污染物導(dǎo)致的脅迫往往很靈敏，其葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量及電子傳遞鏈速率等參數(shù)也很容易發(fā)生變化，因而快速葉綠素?zé)晒猓∣JIP-test）作為光合作用能量轉(zhuǎn)換的天然探針，含有極其豐富的光合作用信息，被廣泛應(yīng)用于研究和探測逆境對植物光合作用生理的影響［9，12］。在遭受DEHP脅迫后，通過快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力曲線及獲得的參數(shù)可知，低濃度的DEHP（10 mg/L）對尖細(xì)柵藻，活性反應(yīng)中心的電子傳遞鏈中的還原有促進(jìn)作用，而高濃度（100 mg/L）則相反； 對柵藻最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）有顯著影響，與DEHP濃度呈效應(yīng)-劑量關(guān)系；此外，DEHP還會提高吸收光能后熱耗散部分的能量占吸收能量的消耗比例。因此，DEHP對尖細(xì)柵藻的影響主要在于對QA氧化還原過程的干擾，而對具活性反應(yīng)中心的其他機(jī)能未見明顯作用。說明能夠快速熒光動力法能夠靈敏的檢測DEHP造成的傷害。

圖 3 不同濃度DEHP對尖細(xì)柵藻葉綠素a（A）和b（B）含量的影響

圖 4 各濃度DEHP脅迫下尖細(xì)柵藻的MDA變化情況

圖 5 各濃度DEHP脅迫下尖細(xì)柵藻SOD活性變化

藻細(xì)胞易受到脅迫時易產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)。對裸短甲藻的毒性效應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，DBP誘導(dǎo)ROS的積累，隨其濃度增加，·OH、H2O2積累［5］。因此藻細(xì)胞中DEHP誘導(dǎo)活性氧（ROS）以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，可能是造成毒性作用的主要原因［6］。DEHP對尖細(xì)柵藻細(xì)胞的處理顯著降低了SOD活性，所產(chǎn)生的MDA含量隨時間和DEHP的濃度增加而增大，證明DEHP促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，增加了胞內(nèi)各組分的氧化壓力。由于SOD是清除藻細(xì)胞內(nèi)超氧化物的酶，它的活性降低，一方面可能是短時間產(chǎn)生了大量的ROS（活性氧），為了清除由ROS導(dǎo)致的超氧化物而消耗，另一方面也可能是藻細(xì)胞受到DEHP的損傷，使SOD的合成或者活性受阻［14］。并且SOD活性降低的幅度與加入DEHP的濃度有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此，DEHP對藻類造成的是活性氧傷害，其毒性效應(yīng)，通過快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)方法可快速檢測出來。

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］Baun S J A.Toxicity of mono- and diesters of o-phthalic esters to a crustacean，a green alga，and a bacterium［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，2003，22（12）:3037—3043

［2］Jiang P P，Zhang S Y，Qi D G，et al.Plasticizer storm andthe countermeasures of plasticizer industry［J］.Plastics Additives，2011，88（4）:1—5［蔣平平，張書源，祁丹耿，等.塑化劑風(fēng)波與增塑劑行業(yè)對策.塑料助劑，2011，88（4）:1—5］

［3］Abdel-Kawi S H，Hashem K S，Abd-Allah S，et al.Mechanism of diethylhexylphthalate（DEHP）induced testicular damage and of grape seed extract-induced protection in the rat［J］.Food and Chemical Toxicology，2016，90:64—75

［4］Mu X，Liao X，Chen X，et al.DEHP exposure impairs mouse oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly through estrogen receptor-dependent and independent mechanisms［J］.Journal of Hazardous Materials，2015，298:232—240

［5］Venturelli A C，F(xiàn)ischer S V，de Morais R N，et al.Effects of exposure to Di-（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）during lactation and puberty on sexual maturation and glycemic homeostasis in males rats［J］.Clinical Nutrition ESPEN，2015，10:5—12

［6］Hu Q Q，Xiong L，Tian P X Z，et al.Toxic effects of Dibutyl Phthalate（DBP）on Scenedesmus obliquus［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2008，3（1）:87—92［胡芹芹，熊麗，田裴秀子等.鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）對斜生柵藻的致毒效應(yīng)研究.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2008，3（1）:87—92］

［7］Sui H X，Zhang L，Wu P G，et al.Concentration of di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）in foods and its dietary exposure in China［J］.International Journal of Hygiene and Environmental Health，2014，217:695—701

［8］Peng X L.Detection of organics in Hanjiang tap water and research on the combined effect of their nonpolar Components with Microcystins［D］.Huazhong University of Science & Technology，Master Dissertation.2008［彭曉琳.漢江水源末梢水中有機(jī)物檢測及其非極性成分與藻毒素聯(lián)合作用的研究.華中科技大學(xué)，碩士論文.2008］

［9］Chen L Z，Xie M，Bi Y H，et al.The combined effects of UV-B radiation and herbicides on photosynthesis，antioxidant enzymes and DNA damage in two bloom-forming cyanobacteria［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，80:224—230

［10］Fu R N，Dai R J，Huang C，et al.Determination of algal chlorophylls and their degradation products［J］.Journal of the CUN（Natural Sciences Edition），2004，13（1）:75—80［傅若農(nóng)，戴繼榮，黃春，等.藻類葉綠素及其降解產(chǎn)物的測定方法.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，13（1）:75—80］

［11］Chen L，Deng S，De Philippis R，et al.UV-B resistance as a criterion for the selection of desert microalgae to be utilized for inoculating desert soils［J］.Journal of applied Phycology，2013，25:1009—1015

［12］Martínez-Pe?alver A，Reigosa M J，Sánchez-Moreiras A M.Imaging chlorophyll a fluorescence reveals specific spatial distributions under different stress conditions［J］.Flora，2011，206:836—844

［13］Wang Z Y，Bie C C，Li F M，et al.Effects of allelochemical dibutyl phthalate on Gymnodinium breve reactive oxygen species［J］.Environmental Science，33（2）:442—447［王震宇，別聰聰，李峰民，等.鄰苯二甲酸二丁酯對短裸甲藻活性氧自由基的影響.環(huán)境科學(xué)，2012，33（2）:44—447］

［14］Yang X L，Deng S Q，De Philippis R，et al.Chemical composition of volatile oil from Artemisia ordosica and its allelopathic effects on desert soil microalgae，Palmellococcus miniatus［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2012，51:153—158

USE OF CHLOROPHYLL FLUORESCENCE TRANSITS TO ANALYSIS DEHP ON THE TOXICOLOGICAL EFFECTS OF SCENEDESMUS ACUMINATUS

LIU Chang-Qing1，2，XIE Mu1，ZHAO Jian1，ZHOU Xiang-Jun1，F(xiàn)U Tao-Ran1and CHEN Lan-Zhou1
（1.School of Resource & Environmental Science，Wuhan University，Wuhan 430072，China； 2.The Central Hospital of Xiaogan，Xiaogan 432000，China）

Abstract:To investigate the toxicological effects of DEHP on Scenedesmus acuminatus，a green algae isolated from Han River，chlorophyll fluorescence induction kinetics curve and the parameters and antioxidatant system were utilized.The results indicated that DEHP significantly decreased SOD activity but increased MDA content in a concentration and treatment time-dependent pattern，and that DEHP increased Chlorophyll contents at low concentration.Chlorophyll fluorescence induction kinetics curve and the parameters analysis showed that 10 mg/L DEHP promoted deoxidation of?in the electron transport chain，and 100 mg/L DEHP reduced the deoxidation of?.DEHP decreased Fv/Fmwith the increased concentration and the duration time.The results revealed that DEHP has an obvious damage on the photosynthetic system and antioxidant system of S.acuminatus，and fast chlorophyll fluorescence induction kinetics（OJIP-test）can be effectively used to detect detrimental damage.

Key words:Scenedesmus acuminatus； DEHP； Toxicological effects； Fast chlorophyll fluorescence induction kinetics；Photosynthetic activity

中圖分類號：Q949.25

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0552-05

doi:10.7541/2016.74

收稿日期：2015-05-20；

修訂日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：國家重大水專項(xiàng)（2013ZX07503001）； 國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金《武漢大學(xué)地理科學(xué)理科基地》科研能力訓(xùn)練項(xiàng)目（J1103409）資助［Supported by the National Water Pollution Control and Treatment Science and Technology Major Project（2013ZX07503001）；the Project for National Basic Science Personnel Training Fund（J1103409）］

作者簡介：劉常青（1974—），女，湖北大悟人，本科，主要從事于生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail:lcq201010@126.com

通信作者：陳蘭洲，教授，E-mail:chenlzwhu@163.com