食蚊魚CYP19b基因克隆及環(huán)境激素暴露對(duì)其表達(dá)的影響

賴靜萍閆月明溫茹淑方展強(qiáng)（.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 5063；.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州 5405）

食蚊魚CYP19b基因克隆及環(huán)境激素暴露對(duì)其表達(dá)的影響

賴靜萍1閆月明1溫茹淑2方展強(qiáng)1
（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631；2.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州 514015）

摘要：為探討17β-雌二醇（E2）、17α-甲基睪酮（MT）和雄烯二酮（AED）暴露對(duì)食蚊魚腦組織CYP19b表達(dá)的影響，首次克隆和分析了食蚊魚（Gambusia affinis）CYP19b cDNA的全系列。采用靜水暴露方法，分別設(shè)置2、10、50和100 ng/L E2、MT和AED各4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置對(duì)照組和平行組，定量測(cè)定了1、3、5和7d腦組織中的CYP19b mRNA表達(dá)水平的變化。成功克隆了食蚊魚CYP19b基因全長(zhǎng)，獲得基因片段總長(zhǎng)1670 bp，ORF（Open Reading Frame）是從52 bp到1554 bp，共編碼501個(gè)氨基酸。通過與其他相關(guān)魚類CYP19b基因編碼的氨基酸序列相似性作比較，食蚊魚CYP19b基因氨基酸序列的同源性很高。結(jié)果顯示，短時(shí)間的暴露，E2較低濃度組（2和10 ng/L）對(duì)食蚊魚作用不明顯，但E2相對(duì)較高濃度組（50和100 ng/L）能顯著地上調(diào)食蚊魚CYP19b基因的表達(dá)（P<0.01）。暴露早期MT對(duì)CYP19b表達(dá)無明顯影響，隨著暴露時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，除了MT較高濃度組（50 ng/L）外，其他各濃度組MT對(duì)CYP19b的表達(dá)有顯著的抑制作用（P<0.01），并呈一定的劑量相關(guān)關(guān)系。AED作為雄激素類似物與MT的作用效果相似，相對(duì)較高濃度（50和100 ng/L）的AED抑制CYP19b的表達(dá)（P<0.01）。研究結(jié)果初步表明，3種典型環(huán)境激素對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響十分顯著，但不同的暴露濃度及不同的取樣時(shí)間點(diǎn)可能表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制CYP19b基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：環(huán)境激素； CYP19b基因； mRNA表達(dá)； 雌二醇； 甲基睪酮； 雄烯二酮； 食蚊魚

細(xì)胞色素P450芳香化酶簡(jiǎn)稱P450arom或CYP19，能夠催化17α-甲基睪酮（17α-methytestosterone，MT）和雄烯二酮（Androstenedione，AED）不可逆的轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合成中的關(guān)鍵酶和限速酶［1—4］。P450arom由CYP19基因編碼，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道克隆了雄性黑頭呆魚（Fathead minnow）［5］、青鳉（Oryzias latipes）［6］和斑馬魚（Danio rerio）［7］等魚類的CYP19基因，并用其作為生物標(biāo)志物來探究與環(huán)境污染，尤其是環(huán)境激素（Environmental hormone）污染的關(guān)系，但目前未見有關(guān)食蚊魚（Gambusia affinis）CYP19被克隆的報(bào)道。

環(huán)境激素對(duì)生物體生殖發(fā)育以及分子層面的影響已成為環(huán)境科學(xué)和生物科學(xué)的熱點(diǎn)之一，尤其是水生環(huán)境中的魚類作為良好的實(shí)驗(yàn)材料用以研究環(huán)境中的激素效應(yīng)［8，9］。近年主要集中在以雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究環(huán)境雄激素的效應(yīng)，以雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究環(huán)境雌激素的效應(yīng)。閆月明［10］的研究顯示，長(zhǎng)時(shí)間的暴露，食蚊魚能適應(yīng)低濃度的環(huán)境激素，相對(duì)較高濃度的強(qiáng)雌激素17β-estradiol（E2）上調(diào)食蚊魚CYP19a基因的表達(dá)，相對(duì)較高濃度的強(qiáng)雄激素17α-methyl testosterone（MT）則下調(diào)食蚊魚CYP19a基因的表達(dá)。而CYP19基因家族中除了CYP19a以外，還有在腦組織中表達(dá)相對(duì)較高的CYP19b目前尚沒有相關(guān)的數(shù)據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)以雌性食蚊魚為材料，首次克隆和分析了G.affinis CYP>19b cDNA的全系列； 研究強(qiáng)雄激素MT和強(qiáng)雌激素E2暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響。由于細(xì)胞色素P450芳香化酶能將androstendione（AED）轉(zhuǎn)化成雌激素，本實(shí)驗(yàn)也設(shè)計(jì)了不同濃度的AED暴露對(duì)CYP19b基因表達(dá)的影響，探索幾種外源環(huán)境激素暴露對(duì)生活在當(dāng)?shù)厮蚴澄敏~CYP19基因表達(dá)水平的影響，以評(píng)價(jià)其對(duì)食蚊魚的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

暴露試劑 17β-雌二醇（E2）（Sigma公司，美國），純度99%； 甲基睪酮（MT）（Dr.Ehtenstorfer公司，德國漢堡），純度98%；雄烯二酮（AED）（Dr.Ehtenstorfer公司，德國漢堡），純度98%； 分別使用純度99.8%的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，sigma）將E2、MT和AED進(jìn)行溶解，配成保存液。二甲基亞砜（DMSO）在本實(shí)驗(yàn)中作為溶劑對(duì)照，DMSO的劑量為50 μL/L，在先前的預(yù)實(shí)驗(yàn)中證明其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響。

分子試劑 RNAiso Plus（TAKARA，Dalian，China）、Fastquant RT Kit（With gDNase）（TIANGEN，China）2×Taq PCR MasterMix（含染料）（TIANGRN，China）、5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0（Invitrogen，Carlsbad，CA）、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech，Palo Alto，CA），其他生化試劑盒化合物均為符合實(shí)驗(yàn)要求的國產(chǎn)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

食蚊魚購自廣州市花鳥蟲魚市場(chǎng)。捕撈回實(shí)驗(yàn)室后，放入魚缸進(jìn)行飼養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)室水族箱內(nèi)馴養(yǎng)兩周，待死亡率小于2%后選取形態(tài)發(fā)育良好、反應(yīng)靈敏、大小均一健康的雄性個(gè)體用于暴露實(shí)驗(yàn)。食蚊魚正常的雌雄個(gè)體鑒別及其性成熟的鑒定參照Leusch等［11］的描述：A.未成年雄性，臀鰭的第3鰭條長(zhǎng)度有延長(zhǎng)，基部寬度加寬，但是生殖足尚未發(fā)育完全； B.成年雄性，鰭條生殖足端部出現(xiàn)鉤和肘； C.未成年雌性，體長(zhǎng)<20 mm，第3鰭條長(zhǎng)度未見加長(zhǎng)，基部寬度未見加寬； D.成年雌性，體長(zhǎng)≥20 mm，第3鰭條長(zhǎng)度未見加長(zhǎng)，基部寬度未見加寬； E.懷孕雌魚，通過腹部下端所出現(xiàn)的黑色孕斑來識(shí)別。所挑選的雄魚體長(zhǎng)25—30 mm，具有生殖鰭（第3 鰭條明顯延長(zhǎng)），且鰭上具鉤的為性成熟的雄魚個(gè)體，在魚缸中暫養(yǎng)。

1.3 染毒與制樣

將食蚊魚轉(zhuǎn)移到10 L的魚缸中進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所用水10 L，為曝氣24h的自來水，硬度為2.4度（德國度），pH（6.8—7.2），水溫控制在（26±1）℃，光周期控制在約14∶10（light∶dark），采用靜水更新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。?shí)驗(yàn)設(shè)置DMSO溶劑對(duì)照組，E2、MT 和AED濃度設(shè)置分別為2、10、50和100 ng/L，每個(gè)濃度組投入食蚊魚數(shù)量為35條，并設(shè)置平行組。由于激素類物質(zhì)會(huì)降解，加之魚類的自身排泄物釋放到魚缸中會(huì)對(duì)魚類活動(dòng)造成影響，每隔2天將魚缸中的水換掉，并清理魚缸，然后重新加激素。每天喂食紅蟲1次，并在相同的時(shí)間段（早上10點(diǎn)）進(jìn)行。在第1、第3、第5和第7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取樣，每個(gè)濃度每次至少取4條食蚊魚的腦組織，并迅速裝入離心管中，然后快速投入液氮中進(jìn)行速凍，進(jìn)行食蚊魚CYP19b Quantitative Realtime PCR檢測(cè)。

1.4 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

按照Trizol說明書，夾取食蚊魚腦組織進(jìn)行總RNA提取，對(duì)所提取的總RNA進(jìn)行非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性；使用Nanodro-1000 型分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，確保OD值在1.8—2.0。使用DNA Purification System:GLASSMAX DNA isolation spin cartridges對(duì)經(jīng)RNAase處理過的cDNA進(jìn)行純化。按照逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV說明書，以總RNA為模板，并以O(shè)ligodT18為引物合成第一鏈cDNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增CYP19b cDNA片段

表 1 食蚊魚CYP19b基因克隆引物Tab.1 Primers used for cloning mosquitofish CYP19b gene

根據(jù)已報(bào)道的青鳉（Oryzias latipes）、底鳉（Fundulus heteroclitus）、斑馬魚（Danio rerio）、金魚（Carassius auratus）、鯉（Cyprinus carpio）等大腦CYP19b基因cDNA保守區(qū)域，登陸NCBI，獲取前述幾種魚的cDNA序列，用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件在靠近5′和3′端的位置分別設(shè)計(jì)引物（表 1），由華大基因（Shenzhen，China）公司合成。然后以第一鏈cDNA為模板，完成對(duì)食蚊魚CYP19b cDNA的中間片段進(jìn)行克隆。PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠并純化回收后，通過鑒定將陽性克隆測(cè)序。

1.6 引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

設(shè)計(jì)食蚊魚CYP19b基因的熒光定量PCR引物，通過熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，完成PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行溶解曲線分析，檢測(cè)PCR質(zhì)量。使用β-actin作為管家基因，以校正實(shí)驗(yàn)的誤差，運(yùn)用2-ΔΔCt方法［ΔΔCt =（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對(duì)照組］計(jì)算目的基因的表達(dá)倍數(shù)。采用SPSS 16.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。所有結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 食蚊魚CYP19b基因的序列分析

測(cè)序工作由生工（上海）公司完成。5′ & 3′RACE產(chǎn)物拼接結(jié)果顯示是一段中間跨960 bp左右的序列。將得到的序列進(jìn)行BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）序列分析，結(jié)果證明是CYP19b基因序列。用BioXM2.6軟件進(jìn)行序列翻譯，此cDNA序列全長(zhǎng)1670 bp，ORF（Open Reading Frame）是從52 bp到1554 bp，共編碼501個(gè)氨基酸，5′端有51 bp的非編碼區(qū)，3′末端有116 bp的非編碼區(qū)。該食蚊魚CYP19b基因cDNA序列已經(jīng)提交Genbank（GenBank Accession Number:正在提交）。

通過用DNAMAN軟件對(duì)8個(gè)不同物種（食蚊魚、斑馬魚、鯽、鯉、底鳉、鯔、青鳉、平鯛）CYP19b基因進(jìn)行氨基酸比對(duì)和氨基酸相似性分析。對(duì)比以上8個(gè)物種的CYP19b基因發(fā)現(xiàn)，其中有35個(gè)氨基酸是較為保守的，其相似性為26.30%。食蚊魚與底鳉的CYP19b 基因其同源性是最高的，達(dá)到85.9%； 其次與青鳉、平鯛的同源性也很高，分別達(dá)到79.2%和79.0%； 食蚊魚與鯽、鯉的相似性最低，分別為10.1%和10.0%。

使用DNAMAN軟件對(duì)8個(gè)物種的CYP19b基因進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹比較食蚊魚CYP19b基因與其他物種之間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示：食蚊魚的CYP19b基因與底鳉的同源性最高。結(jié)合氨基酸同源性的分析數(shù)據(jù)表明，CYP19b基因在魚類中具有的保守區(qū)段，在不同物種生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 雌二醇（E2）、甲基睪酮（MT）和雄烯二酮（AED）暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

在克隆得到的食蚊魚CYP19b基因的中間片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Quantitative Realtime PCR檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用SYBR GreenI熒光嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反應(yīng)。E2、MT、AED各濃度組和對(duì)照組在暴露實(shí)驗(yàn)期間都未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚的死亡現(xiàn)象，也未發(fā)現(xiàn)行為異常，這表明在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)E2、MT和AED對(duì)食蚊魚尚無可觀測(cè)的急性毒性作用。

圖 1 雌二醇暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

雌二醇暴露對(duì)食蚊魚CYP19b的表達(dá)水平影響如圖 1所示。暴露1d后，與對(duì)照組比較，E2最低濃度組（2 ng/L）對(duì)CYP19b的表達(dá)水平下降，但結(jié)果不顯著（P>0.05），暴露3d后，2 ng/L組對(duì)CYP19b的表達(dá)起促進(jìn)作用（P<0.01），但隨后至第5和第7天時(shí)CYP19b表達(dá)分別受到明顯抑制（P<0.01或P<0.05）。E2較低濃度組（10 ng/L）暴露1d后，對(duì)CYP19b的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，暴露3d、5d和7d后對(duì)CYP19b的表達(dá)水平與對(duì)照組相持平，沒有明顯變化（P>0.05）。E2較高濃度組（50 ng/L）暴露1d后，對(duì)CYP19b表達(dá)呈十分顯著的提升（P<0.01），但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)至第3天后CYP19b表達(dá)出現(xiàn)下滑趨勢(shì)，至第5天后受抑制明顯（P<0.05），至第7天后其表達(dá)量又呈提升趨勢(shì)。與50 ng/L 濃度組相似，E2高濃度組（100 ng/L）在暴露1d后，對(duì)CYP19b表達(dá)水平呈提升趨勢(shì)，隨后至第3天后迅速下降，至第5天后CYP19b表達(dá)受抑制十分顯著（P<0.01），但在7d后對(duì)CYP19b的表達(dá)提升十分顯著性（P<0.01）。

結(jié)果顯示，相對(duì)較低E2濃度組（2和10 ng/L）暴露對(duì)CYP19b的表達(dá)表現(xiàn)為初始的抑制、隨后促進(jìn)的趨勢(shì)。相對(duì)較高E2濃度組（50和100 ng/L）暴露對(duì)CYP19b的表達(dá)表現(xiàn)為初始的促進(jìn)、隨后抑制后再促進(jìn)的趨勢(shì)。

甲基睪酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響如圖 2所示。MT暴露1d后，與對(duì)照組比較，MT各濃度組對(duì)CYP19b基因的表達(dá)均呈現(xiàn)抑制的趨勢(shì)，并且隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，MT各濃度組對(duì)CYP19b的表達(dá)明顯出現(xiàn)抑制的作用。MT最低濃度組（2 ng/L）暴露3d后，對(duì)CYP19b表達(dá)的抑制更為明顯（P<0.05），隨后至5d和7d后，對(duì)CYP19b的表達(dá)仍呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。MT較低濃度組（10 ng/L）暴露3d后，CYP19b的表達(dá)與對(duì)照組持平，但至5d后對(duì)CYP19b的表達(dá)抑制作用十分顯著（P<0.01），而至7d后則略為上升。MT較高濃度組（50 ng/L）暴露至3d和5d后，對(duì)CYP19b的表達(dá)抑制十分明顯（分別P<0.01和P<0.05），但至7d后，卻出現(xiàn)顯著性提升（P<0.01）。MT最高濃度組（100 ng/L）暴露至3d、5d和7d后，CYP19b的表達(dá)一直受到明顯抑制，尤其在第5天后表達(dá)的下降十分顯著（P<0.01）。

圖 2 甲基睪酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，從總體上看，除了較高濃度組（50 ng/ L）外，其他不同濃度MT暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因的表達(dá)呈明顯地抑制作用。

雄烯二酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響如圖 3所示。AED最低濃度組和較低濃度組（2和10 ng/L）暴露初始（1d）對(duì)CYP19b的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，隨后至第3天后其表達(dá)水平與對(duì)照組基本持平；至第5天后兩個(gè)濃度組對(duì)CYP19b的表達(dá)抑制作用則十分顯著（P<0.01）；至第7天最低濃度組（2 ng/L）對(duì)CYP19b的表達(dá)抑制作用仍十分顯著（P<0.01），但較低濃度組（10 ng/L）對(duì)CYP19b的表達(dá)抑制作用出現(xiàn)反彈，上升十分顯著（P<0.01）。較高濃度組和最高濃度組（50和100 ng/L）暴露1d后CYP19b的表達(dá)出現(xiàn)抑制趨勢(shì)，至第3天后，較高濃度組（50 ng/L）CYP19b的表達(dá)受抑制作用十分顯著（P<0.01）；隨后至第5和第7天，兩個(gè)濃度組暴露對(duì)CYP19b的表達(dá)持續(xù)抑制作用都十分顯著（P<0.01）。

結(jié)果顯示，除了較低濃度組（10 ng/L）在第7天的表達(dá)出現(xiàn)上升外，AED各濃度組暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響十分明顯，并隨時(shí)間的推移抑制作用加強(qiáng)。

圖 3 雄烯二酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

3 討論

3.1 食蚊魚CYP19b基因的存在形式及芳香化酶保守區(qū)的討論分析

食蚊魚與許多硬骨魚類一樣，芳香化酶存在性腺芳香化酶基因（CYP19a）和腦芳香化酶基因（CYP19b）兩種基因編碼。食蚊魚CYP19a基因已由本實(shí)驗(yàn)室閆月明［8］克隆出部分片段，并由甘為［12］完成全基因克?。欢緦?shí)驗(yàn)則已成功克隆出CYP19b基因的全長(zhǎng)，并與斑馬魚、青鳉、鯉等物種的CYP19b基因進(jìn)行比對(duì)。在ncbi上比對(duì)的結(jié)果得出多條其他物種的CYP19a或是與CYP19a相似的序列，另外也將食蚊魚CYP19基因的兩個(gè)基因編碼進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其相似性高達(dá)58.62%。張揚(yáng)等［13］認(rèn)為CYP19具有相同的祖先基因，在硬骨魚類中，經(jīng)歷了一次魚類特異的基因組復(fù)制事件，產(chǎn)生了兩個(gè)包含芳香化酶基因的旁系同源基因框，經(jīng)過亞功能化和長(zhǎng)期的選擇壓力，分別形成了硬骨魚類中的卵巢芳香化酶基因和腦芳香化酶基因。這也就解釋了食蚊魚CYP19的兩個(gè)基因具有高相似性的原因。

本文在食蚊魚腦芳香化酶中發(fā)現(xiàn)3個(gè)高度保守片段，依次為I-螺旋區(qū)、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)［14］，這與徐跑等［15］對(duì)黃顙魚腦芳香化酶和卵巢芳香化酶的研究結(jié)果相一致，但是氨基酸序列稍有一些不同。Graham-Lorence等［16］發(fā)現(xiàn)人芳香化酶的氨基酸序列中有7個(gè)酶催化活性位點(diǎn)，包括I130、E298、P304、D305、T306、R431 和C433，與食蚊魚腦芳香化酶在這些位點(diǎn)所編碼的氨基酸作比對(duì)分析的結(jié)果證明僅有一部分相一致；同時(shí)與黃顙魚［15］、泥鰍［17］腦及卵巢芳香化酶在這些位點(diǎn)所編碼的氨基酸所作的比對(duì)分析結(jié)果也表明僅有一部分相同；雖然位點(diǎn)不近相同，但卻都間接證明腦芳香化酶是具有催化活性的。由此可見，與其他魚類相比較，食蚊魚腦芳香化酶也具有3個(gè)高度保守片段，并具有催化活性，但是芳香化酶在不同魚類中所存在的形式有所不同。崔俊莉［17］認(rèn)為這種存在形式不一的原因:其一是可能由于魚類不同物種在進(jìn)化時(shí)基因復(fù)制出現(xiàn)偏差，生活環(huán)境多樣，導(dǎo)致不同組織的芳香化酶基因由同一個(gè)基因編碼；其二是在魚類中均存在兩種形式的CYP19基因，二者在不同組織中均有表達(dá)。

3.2 雌二醇暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

目前國內(nèi)對(duì)CYP19b基因的研究相對(duì)于CYP19a基因來說尚少見報(bào)，而國外的研究也相對(duì)較少。Cheshenko等［18］對(duì)斑馬魚進(jìn)行雌激素處理并且觀察CYP19b mRNA的表達(dá)來判斷芳香化酶的活性，發(fā)現(xiàn)CYP19b mRNA表達(dá)量的升高表示芳香化酶的活性有所提高； 而對(duì)其胚胎進(jìn)行48h的10 nmol/L（約3000 ng/L）17β-雌二醇（E2）的處理，結(jié)果能引起端腦，視前區(qū)和下丘腦內(nèi)側(cè)基底部的CYP19a 或CYP19b的轉(zhuǎn)錄以及蛋白強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá)［19］； 分別用0.1 nmol/L（約30 ng/L）和1 nmol/L（約300 ng/L）兩個(gè)濃度的17α-乙炔基雌二醇（EE2）暴露都能抑制CYP19a的表達(dá)［20］。Lyssimachou等［21］用人工合成雌激素乙炔雌二醇（EE2）與防污劑三丁基錫（TBT）分別對(duì)大西洋鮭處理發(fā)現(xiàn)，EE2能提高CYP19a和CYP19b的mRNA的表達(dá)水平，而TBT則能降低CYP19b mRNA的表達(dá)水平。吳鵬［22］研究了三丁基氯化錫（TBTCl）暴露情況下雌性和雄性孔雀魚T和E2含量以及CYP19a和CYP19b mRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明，500 ng/L TBTCl暴露組雌魚卵巢中CYP19a mRNA表達(dá)顯著降低，抑制芳香化酶將甲基睪酮（MT）轉(zhuǎn)化為雌二醇（E2）的過程，導(dǎo)致雌魚E2顯著降低。熊甜甜等［23］研究了E2暴露對(duì)食蚊魚（Gambusia affinis）細(xì)胞色素P4501A基因（CYP4501A）表達(dá)的影響。結(jié)果也顯示，高濃度E2（500 ng/L）極顯著抑制CYP4501A mRNA的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雌二醇暴露可以提高CYP19b mRNA的表達(dá)水平，起到促進(jìn)作用； 但也可能降低其表達(dá)量，具有抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)較低E2濃度組（2和10 ng/L）暴露對(duì)CYP19b的表達(dá)表現(xiàn)為初始的抑制、隨后促進(jìn)的趨勢(shì)； 而相對(duì)較高E2濃度組（50和100 ng/L）暴露對(duì)CYP19b的表達(dá)表現(xiàn)為初始的促進(jìn)、隨后抑制后再促進(jìn)的趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果基本相一致。結(jié)果表明，短時(shí)間的暴露，低濃度的E2對(duì)食蚊魚作用不明顯，但相對(duì)較高濃度的E2能顯著地上調(diào)食蚊魚CYP19b基因的表達(dá)；不同的暴露濃度及不同的取樣時(shí)間點(diǎn)可能表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制CYP19b基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)從基因表達(dá)方面來看，尚未能發(fā)現(xiàn)E2暴露在一定的劑量范圍內(nèi)與CYP19b的表達(dá)存在的線性關(guān)系，也沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的現(xiàn)象，我們推斷這很可能是實(shí)驗(yàn)操作的原因，或者是劑量的原因，需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前雖然CYP19a的調(diào)控研究已比較完善，但是CYP19b的調(diào)控機(jī)制仍然不十分清楚。Kazeto等［24］在斑馬魚CYP19b啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)雌激素應(yīng)答原件（ERE），這一發(fā)現(xiàn)指明CYP19b具有雌激素應(yīng)答效應(yīng)。 Gloria等［25］根據(jù)多方面的研究推斷:硬骨魚內(nèi)的雌二醇（E2）和甲基睪酮（MT）的轉(zhuǎn)換受到CYP19b的調(diào)控，CYP19b的表達(dá)與雌激素受體（ER）緊密聯(lián)系，ER一旦接收外源雌激素類物質(zhì)，通過相關(guān)的信號(hào)通道誘導(dǎo)CYP19b的表達(dá)，從而合成細(xì)胞色素P450芳香化酶，進(jìn)而硬骨魚體內(nèi)的E2和睪酮（T）的含量就會(huì)發(fā)生變化。而體內(nèi)的E2也能同時(shí)與體內(nèi)的ER結(jié)合，也能通過其他的基因向下調(diào)節(jié)，通過促性腺激素及其他神經(jīng)效應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)體，形成一個(gè)自動(dòng)反饋的系統(tǒng)。由此可見，這些調(diào)控過程相當(dāng)復(fù)雜，將有待后續(xù)的進(jìn)一步研究。

3.3 甲基睪酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

甲基睪酮（MT）是一種強(qiáng)的雄激素類物質(zhì)，能對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育，性逆轉(zhuǎn)等造成重要的影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)濃度組（2、10、50 和100 ng/L）MT對(duì)食蚊魚進(jìn)行短期暴露，研究了其對(duì)CYP19b表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從總體上看，除了較高濃度組（50 ng/L）外，其他不同濃度MT暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因的表達(dá)呈明顯地抑制作用。范俊杰等［26］研究了甲基睪酮對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育期間的雌性食蚊魚形態(tài)雄性化及目標(biāo)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，甲基睪酮（MT）高濃度組（500 nmol/L）的雄激素效應(yīng)明顯，導(dǎo)致雌魚在生長(zhǎng)發(fā)育過程中出現(xiàn)形態(tài)雄性化的變化。Martina Fenske等［27］用10000 ng/L的MT處理71日齡的斑馬魚，發(fā)現(xiàn)MT處理組的腦部CYP19b表達(dá)量明顯高于對(duì)照組雄性CYP19b的平均表達(dá)量，約為其的5倍，這是由于在10000 ng/L濃度下，MT向E2轉(zhuǎn)化了。這為MT暴露組中為什么CYP19b的表達(dá)會(huì)上調(diào)作了解釋。本實(shí)驗(yàn)暴露濃度遠(yuǎn)低于前人所使用的濃度（10000 ng/L），由于在體內(nèi)睪酮（T）能被P450arom酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)镋2，E2又可以產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，所以MT暴露組表現(xiàn)出抑制CYP19b表達(dá)的現(xiàn)象。而在第7天高濃度50 ng/L MT的暴露增加了食蚊魚CYP19b的表達(dá)量，這可能是由于MT的刺激增加了食蚊魚體內(nèi)的類固醇激素睪酮（T）的含量，促使MT往E2的方向轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)P450arom酶表達(dá)，即表現(xiàn)為CYP19b的表達(dá)的上調(diào)；張勇［28］以MT喂食斜帶石斑魚，發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)的睪酮（T）含量與芳香化酶基因的表達(dá)活性密切相關(guān)，而MT單獨(dú)作用于孵育下丘腦、腦垂體、性腺。但是MT是直接作用于性腺芳香化酶基因，還是通過其他調(diào)控因子影響CYP19b基因的表達(dá)，其機(jī)制還不得而知，有待作進(jìn)一步研究。

3.4 雄烯二酮暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響

雄烯二酮（Androstenedione，AED）是雄激素物質(zhì)之一，是睪酮（T）向雌激素轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物。在有關(guān)處理造紙廢水的研究中，科研人員已經(jīng)確認(rèn)造紙廠廢水流入的水體存在著雄烯二酮（AED），1，4雄烯二酮（Androstadienedione，ADD）和孕酮（Progesterone，PRO），造成生活在該水體中的雌性食蚊魚發(fā)生了形態(tài)雄性化轉(zhuǎn)變［29］。AED能夠代謝為另外一些雄激素（如睪酮testosterone、11-酮睪丸激素11-ketotestosterone），同時(shí)也會(huì)干擾芳香信號(hào)途徑［30］。AED暴露對(duì)CYP19基因表達(dá)的影響其研究非常少，難以找到前人的研究與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，但AED對(duì)VTG的表達(dá)效應(yīng)的研究結(jié)果有一定的參考價(jià)值。范俊杰［27］的研究表明，50和500 nmol/L AED處理極顯著地抑制了雌性食蚊魚VTGα mRNA的表達(dá)水平，0.5和5 nmol/L AED暴露組致VTGα mRNA表達(dá)水平也呈一定程度的增加，因此認(rèn)為AED或許被部分芳香化成了一些具有雌激素活性的物質(zhì)從而起到雌性化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了較低濃度組（10 ng/L）在第7天的表達(dá)出現(xiàn)上升外，AED各濃度組暴露對(duì)食蚊魚CYP19b基因表達(dá)的影響十分明顯，并隨時(shí)間的推移抑制作用加強(qiáng)。AED暴露初期，低濃度組（2和10 ng/L）致CYP19b表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，而隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度組AED對(duì)CYP19b的表達(dá)均起到極顯著性的抑制作用，但至第7天，低濃度組（10 ng/L）則致CYP19b表達(dá)上升，為對(duì)照組的近2倍。解釋這一結(jié)果可以參考Stanko和Angus［31］的假設(shè)，過量的AED在雌性食蚊魚體內(nèi)將很有可能被代謝成E2，導(dǎo)致E2含量的相對(duì)提升； 或者可能代謝為11-酮睪丸激素，而11-酮睪丸激素將抑制E2量的提升。由此E2受到抑制將會(huì)影響雌激素受體（ER）的表達(dá)，從而導(dǎo)致CYP19b的表達(dá)下調(diào)。而在暴露第7天，10 ng/L AED 出現(xiàn)上調(diào)作用，推測(cè)其低濃度AED與MT暴露后期的雄激素效應(yīng)相似，刺激增加了食蚊魚體內(nèi)的睪酮（T）含量，促使T往E2的方向轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)P450arom酶的表達(dá)，表現(xiàn)為CYP19b表達(dá)的上調(diào)。目前AED對(duì)CYP19b的研究幾乎空白，其作用機(jī)制尚未清楚，同時(shí)有關(guān)CYP19a基因在這方面的研究尚少報(bào)道，因此將有待作進(jìn)一步研究。

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MOLECULAR CLONING AND mRNA EXPRESSION OF CYP19B GENE INDUCED BY ENVIRONMENTAL HORMONES IN THE MOSQUITOFISH（GAMBUSIA AFFINIS）

LAI Jing-Ping1，YAN Yue-Ming1，WEN Ru-Shu2and FANG Zhan-Qiang1
（1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education，College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，China； 2.College of Life Science，Jiaying University，Meizhou 514015，China）

Abstract:The current study investiaged effects of 17β-estradiol（E2），17α-methyl testosterone（MT）and androgen analogues androstendione（AED）exposure on brain tissue CYP19b gene expression in Gambusia affinis.The G.affinis CYP19b cDNA of full sequence was cloned and analyzed for the first time.G.affinis were randomly divided into five groups，with one control group and four experimental groups（2，10，50 and 100 ng/L E2，MT and AED，respectively）.The CYP19b mRNA expression levels in fish brain tissues were determined after 1，3，5，and 7d exposure，respectively.The G.affinis CYP19b cDNA of full sequence was cloned，from which 1670 bp nucleotides were obtained，encoding 501 amino acids with an open reading frame（ORF）from 52 bp to 1554 bp.The comparison among the similarity amino acid sequence of CYP19b with other related fishes supports high similarity between species.The results indicated that E2 at high concentrations（50 ng/L and 100 ng/L groups）significantly up-regulated CYP19b gene expression（P<0.01）but E2 at low concentration（2 ng/L and 10 ng/L groups）did not.MT had no significant effect on CYP19b expression in early stages，but it significantly inhibited CYP19b expression with prolonged treatment except the relatively high concentrations of MT（50 ng/L group）with the characerisitc of dose correlativity.As androgen analogue，AED was found to have similar effects with MT，and the relatively high concentrations（50 ng/L and 100 ng/L groups）of AED inhibited the CYP19b expression（P<0.01）.The results indicated the pivotal role of three typical environmental hormones under different concentration and various time points on the expression of CYP19b.

Key words:Environmental hormone； CYP19b gene； mRNA expression； 17β-estradiol； 17α-methyl testosterone；Androstendione； Gambusia affinis

中圖分類號(hào)：Q785； S917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0451-08

doi:10.7541/2016.60

收稿日期：2015-05-19；

修訂日期：2015-11-25

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B030800006）資助［Supported by the Science and Technology Project of Guangdong（No.2012B030800006）］

作者簡(jiǎn)介：賴靜萍（1988—），女，廣東廣州人； 碩士； 主要從事水生動(dòng)物生態(tài)毒理研究。E-mail:kenancheery@qq.com

通信作者：方展強(qiáng)，E-mail:fangzhq@scnu.edu.cn