羅氏沼蝦Rab11基因cDNA克隆及其組織表達(dá)分析

夏正龍 黃雪娜 黃振遠(yuǎn) 陳雪峰 高 強(qiáng) 濮劍威 慎佩晶 彭 菲 楊國(guó)梁（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，國(guó)家羅氏沼蝦遺傳育種中心，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001）

羅氏沼蝦Rab11基因cDNA克隆及其組織表達(dá)分析

夏正龍 黃雪娜 黃振遠(yuǎn) 陳雪峰 高 強(qiáng) 濮劍威 慎佩晶 彭 菲 楊國(guó)梁
（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，國(guó)家羅氏沼蝦遺傳育種中心，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州 313001）

摘要：為了發(fā)掘羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）免疫相關(guān)基因，研究Rab蛋白（Ras-related proteins in brain）在羅氏沼蝦免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用，研究采用RACE-PCR技術(shù)克隆了羅氏沼蝦Rab11基因全長(zhǎng)cDNA序列，記為MrRab11。全長(zhǎng)1381 bp，包括226 bp的5′UTR，511 bp的3′UTR和645 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼214個(gè)氨基酸，含有一個(gè)Rab結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)顯示，羅氏沼蝦與岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、蚤狀溞（Daphnia pulex）、葉蟬（Homalodisca vitripennis）Rab11一致性分別為82%、83%和82%。軟件預(yù)測(cè)，MrRab11編碼的蛋白分子量約為23.75 kD，等電點(diǎn)約為5.34。實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析表明，MrRab11基因在羅氏沼蝦各組織中都有表達(dá)，肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是肌肉和腸道。在陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）感染12h后，羅氏沼蝦肝胰腺中MrRab11的表達(dá)量上升，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），推測(cè)這是MrRab11對(duì)陰溝腸桿菌的應(yīng)激表達(dá)，MrRab11在肝胰腺中參與了羅氏沼蝦免疫應(yīng)答過(guò)程。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦； Rab11； 組織表達(dá)； 免疫應(yīng)答

Rab蛋白（Ras-related proteins in brain）是小分子GTP結(jié)合蛋白家族中的最大亞族，分子量介于20—25 kD，由180—200個(gè)氨基酸構(gòu)成［1］。研究表明Rab蛋白存在于所有真核生物中，進(jìn)化過(guò)程比較保守，但不同物種間Rab蛋白種類差別較大:如裂殖酵母（Fission yeast）中Rab蛋白種類最少，只有7種［2］，人類基因組中Rab蛋白種類最多，有60多種［3］。不同的Rab蛋白定位于不同的細(xì)胞器上，通過(guò)結(jié)合和水解GTP來(lái)調(diào)節(jié)不同的膜泡運(yùn)輸過(guò)程［4］，是膜泡運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)因子，在膜泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、融合及信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程起重要作用［5—7］。

目前對(duì)Rab蛋白的研究，很多集中在動(dòng)植物的病害和免疫方面。轉(zhuǎn)基因水稻中高度表達(dá)的Rab11能通過(guò)誘導(dǎo)茉莉酸應(yīng)答基因的表達(dá)顯示出對(duì)病原的抗性［8］。提高Rab11的活性有助于對(duì)患有亨丁頓舞蹈癥小鼠的治療［9］。Rab11a還與人類癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)有關(guān)［10］，有望成為各種癌癥的檢測(cè)指標(biāo)以及惡性腫瘤新的治療靶點(diǎn)［11］。在水產(chǎn)動(dòng)物中:被愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染的斑點(diǎn)叉尾鲖（Ietalurus Punetaus）Rab11a［12］、Rab11b［13］的表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明這兩種Rab蛋白參與了胞吞途徑的免疫應(yīng)答。被鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）Rab基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)，且在感染1.5h后達(dá)到最高水平，提示Rab蛋白可能與蝦蟹的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［14］。RNA干擾沉默Rab基因后，吞噬細(xì)胞比率和吞噬指數(shù)都顯著下降； 而Rab基因高度表達(dá)的日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）吞噬細(xì)胞比例及吞噬指數(shù)都顯著上升，表明Rab蛋白在吞噬中有重要作用，推測(cè)機(jī)體中Rab蛋白主要通過(guò)調(diào)節(jié)吞噬作用來(lái)抵抗細(xì)菌感染，可以通過(guò)提高Rab蛋白表達(dá)量來(lái)達(dá)到加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的抵抗力［15］。而沉默Rab9和Rab11基因后，HIV病毒的繁殖會(huì)受到抑制［16，17］； 沉默Rab7基因后，可以抑制斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）感染白斑綜合征（WSSV）以及黃頭病毒（YHV）［18］。體外抗體試驗(yàn)也表明Rab7蛋白或其抗體能顯著降低對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡率，推測(cè)Rab蛋白是病毒在體內(nèi)復(fù)制所必需的細(xì)胞因子，可以通過(guò)沉默Rab基因抑制病毒在體內(nèi)繁殖［19］。綜上研究表明Rab基因參與了機(jī)體對(duì)細(xì)菌和病毒免疫，且Rab基因?qū)?xì)菌和病毒的免疫機(jī)制可能存在差異。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）為世界上個(gè)體最大的淡水蝦，是重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種［20，21］。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其病害也越來(lái)越多，給養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的損失［22，23］。近年來(lái)多地羅氏沼蝦育苗過(guò)程中疾病頻發(fā)，幼體出膜幾天后就大批死亡，本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是引發(fā)幼體此類病害的主要病原。發(fā)掘羅氏沼蝦免疫相關(guān)基因，研究其免疫機(jī)制，對(duì)病害防治等方面將會(huì)有重要作用。本研究克隆了羅氏沼蝦Rab11基因全長(zhǎng)cDNA序列，分析其生物信息學(xué)特征并研究其對(duì)陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究該基因的功能和羅氏沼蝦免疫抗病機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

150尾羅氏沼蝦取自浙江嘉興養(yǎng)殖戶，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)（水溫25℃），每天換水10%，定時(shí)投喂飼料2次。試驗(yàn)用陰溝腸桿菌從高郵2014年初發(fā)病的幼體中分離得到。羅氏沼蝦暫養(yǎng)一周后進(jìn)行細(xì)菌感染試驗(yàn)，挑選健康、規(guī)格統(tǒng)一［體重:（15.5±1.1）g］的個(gè)體70尾，平均分成兩組:試驗(yàn)組在肌肉注射100 μL經(jīng)生理鹽水稀釋的陰溝腸桿菌（2.5×108cfu/ mL），對(duì)照組注射等量生理鹽水，兩組分別飼養(yǎng)在兩個(gè)相同的水箱中。注射前取樣一次，作為空白對(duì)照，記為0樣品，注射后0.5h、1.5h、3h、6h、12h、 24h、48h和96h分別從對(duì)照組和試驗(yàn)組取樣（每次每組取樣3尾），取羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道、胃等組織立即放入液氮中，然后保存于-80℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

用柱式動(dòng)物RNAout試劑盒（北京天恩澤）提取羅氏沼蝦總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo）測(cè)定RNA濃度，以2 μg總RNA為模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA第一鏈。

1.3 羅氏沼蝦Rab11全長(zhǎng)cDNA克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的羅氏沼蝦EST序列（登錄號(hào):EL695849），和數(shù)據(jù)庫(kù)中相近物種序列比對(duì)分析保守性，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)Rab11基因特異性引物（表 1）擴(kuò)增基因的3′末端，其中APOL和AP為通用引物。以反轉(zhuǎn)錄的c D N A第一鏈為模板，MrRab11 3′F1和AOLP分別為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為:94℃ 3min；94℃ 45s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)； 72℃8min。以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后為模板，MrRab11 3′F2和AP為上下游引物進(jìn)行第二輪巢式PCR，退火溫度為60℃，其他條件同第一輪。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，用DNA 膠回收試劑盒（Axygen）回收，回收產(chǎn)物與pMDl9-T 載體（Takara）連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α敏感態(tài)細(xì)胞中，于LB Amp+平板上培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 MrRab11 cDNA及其編碼氨基酸序列分析

用SeqMan軟件分析測(cè)序結(jié)果，去掉載體序列，拼接即得MrRab11全長(zhǎng)cDNA 序列，查找開(kāi)放閱讀框（ORF）并推測(cè)其氨基酸序列。通過(guò)Blast在線工具查找數(shù)據(jù)庫(kù)中同源序列，ClastalW2對(duì)同源序列比對(duì)分析； 用EXPASY工具分析蛋白的基本物理化學(xué)參數(shù)分析及功能結(jié)構(gòu)； SignalP 預(yù)測(cè)編碼蛋白信號(hào)肽；TMHMM 查找預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域； PredictProtein工具預(yù)測(cè)MrRab11編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)； SWISSMODEL工具預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)； Blastx從數(shù)據(jù)庫(kù)檢索MrRab11同源序； MAGE6.0軟件，NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 MrRab11基因組織表達(dá)和免疫應(yīng)答分析

根據(jù)羅氏沼蝦β-actin基因序列（登錄號(hào):AY62 6840.1）設(shè)計(jì)熒光定量PCR內(nèi)參引物Mrβ-actinF、Mrβ-actinR，產(chǎn)物長(zhǎng)度為193 bp。在所得羅氏沼蝦R a b 1 1基因序列的開(kāi)放閱讀框內(nèi)設(shè)計(jì)引物MrRab11-qF和MrRab11-qR，產(chǎn)物長(zhǎng)度為197 bp。以正常羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道和胃組織的樣品cDNA為模板，檢測(cè)Rab11基因在各個(gè)組織的表達(dá)情況； 以試驗(yàn)組和對(duì)照組在注射后不同時(shí)間點(diǎn)的組織樣品分析MrRab11對(duì)陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答。組織表達(dá)分析根據(jù)SYBR?Green qPCR預(yù)混液（Applied Biosystems）說(shuō)明書(shū)，在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 cycles； 繪制溶解曲線。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，以2-ΔΔCt法結(jié)合SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較分析。

2 結(jié)果

2.1 MrRab11 cDNA序列分析

將3′RACE獲得的Rab11片段和EST序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接后得到1381 bp的Rab11全長(zhǎng)cDNA序列，經(jīng)BLAST和同源比對(duì)分析確認(rèn)為羅氏沼蝦Rab11基因。該序列包含226 bp的5′非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR），511 bp的3′非編碼區(qū)和645 bp的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。在3′UTR，有一個(gè)RNA不穩(wěn)定模體（RNA instability motif）ATTTA結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有典型的polyA加尾信號(hào)AATAAA。

MrRab11編碼214個(gè)氨基酸，DNAstar軟件預(yù)測(cè)蛋白分子量約為23.75 kD，等電點(diǎn)約為5.34。BLASTX分析顯示該序列與GenBank中已知的岡比亞按蚊（XP_001238828.3）、蚤狀溞（EFX80521.1）、葉蟬（AAT01087.1）Rab11氨基酸序列一致性分別為82%、83%、82%。其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α螺旋36.45%，β折疊17.29%，無(wú)規(guī)卷曲46.26%。SMART軟件分析顯示，MrRab11有1個(gè)Rab結(jié)構(gòu)域； SignalP軟件分析表明其不存在信號(hào)肽序列； TMHMM 軟件分析顯示MrRab11蛋白不存在跨膜區(qū)域； Swiss-Model軟件預(yù)測(cè)MrRab11的三維結(jié)構(gòu)，與其他Rab蛋白一樣，MrRab11含有一個(gè)由6個(gè)β折疊和5個(gè)α螺旋構(gòu)成的核心區(qū)域（圖 1）。

圖 1 羅氏沼蝦Rab11預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 羅氏沼蝦Rab11系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

BLAST檢索得到MrRab11同源序列:葉蟬（Homalodisca vitripennis，AAT01087.1）、大西洋鮭（Salmo salar，ACI68958.1）、斑點(diǎn)叉尾鲖（Ictalurus furcatus，ADO28360.1）、人（Homo sapiens，CA G46492.1）、蚤狀溞（Daphnia pulex，EFX80521.1）、野牦牛（Bos mutus，ELR60022.1）、原鴿（Columba livia，EMC77353.1）、大家鼠（Rattus norvegicus，NP_116006.1）、果蠅（Drosophila melanogaster，NP_477170.1）、斑馬魚(yú)（Danio rerio，NP_0010 02555.1）、雞（Gallus gallus，NP_001005827.1）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae，XP_001238828.3）、小蜜蜂（Apis florea，XP_003692576.1）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos，XP_005015582.1）、揚(yáng)子鱷（Alligator sinensis，XP_006032658.1）、綠海龜（Chelonia mydas，XP_007064684.1）、葉吻銀鮫（Callorhinchus milii，XP_007906492.1）以及凡納濱對(duì)蝦部分序列（Litopenaeus vannamei，AER34937.1），用MAGE6.0軟件，以NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果顯示MrRab11與凡納濱對(duì)蝦Rab11在進(jìn)化關(guān)系上最近，并和蚤狀溞Rab11聚為一支，其余Rab11以哺乳類、魚(yú)類、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)類、爬行類為單位形成5個(gè)分支，與傳統(tǒng)的分類方法所得結(jié)果一致。

2.3 MrRab11組織分布

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)了MrRab11在羅氏沼蝦肝胰腺（Hepatopancreas）、肌肉（Muscle）、鰓（Gill）、心臟（Heart）、腸道（Intestine）、胃（Stomach）、血液（Hemocytes）等組織的表達(dá)水平，結(jié)果每個(gè)擴(kuò)增曲線走勢(shì)正常，熔解曲線顯示單峰且峰值單一，說(shuō)明引物的特異性較好，檢測(cè)體系比較穩(wěn)定，可靠性高。2-△△Ct法計(jì)算MrRab11的相對(duì)表達(dá)量，在檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，肝胰腺中表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05），其次是肌肉、腸道，其他組織表達(dá)量較低，無(wú)顯著差異（圖 3）。

圖 2 Rab11系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 MrRab11在不同組織對(duì)陰溝腸桿菌的應(yīng)激表達(dá)

為了探究MrRab11在細(xì)菌感染后的應(yīng)激表達(dá)，分別檢測(cè)了其在羅氏沼蝦感染陰溝腸桿菌后各組織不同時(shí)間點(diǎn)（0、0.5h、1.5h、3h、6h、12h、24h、48h和96h）的表達(dá)情況（圖 4）。與空白對(duì)照組相比0，羅氏沼蝦注射陰溝腸桿菌后，0.5h時(shí)肝胰腺中Rab11的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），但試驗(yàn)組和對(duì)照組沒(méi)有顯著差異； 12h時(shí)再次升高，且試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在肌肉中，0.5h時(shí)MrRab11表達(dá)量上調(diào)，3h時(shí)回到正常水平0h； 24h時(shí)再次上升，試驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。腸道中，注射0.5h后Rab11表達(dá)量顯著上升（P<0.05），試驗(yàn)組和對(duì)照組無(wú)顯著差異，48h后回到正常水平。鰓、心臟、胃等組織表達(dá)量低，注射后無(wú)顯著變化，且試驗(yàn)組與對(duì)照組也無(wú)顯著差異。

3 討論

圖 3 MrRab11在不同組織的相對(duì)表達(dá)

本研究從羅氏沼蝦基因組中成功克隆MrRab11基因，該基因序列和其他物種Rab11序列相似度在80%左右，具有較高的同源性。MrRab11含有Rab GTP酶家族所特有的5個(gè)氨基酸序列，該模體序列是鑒別Rab 蛋白一種較為準(zhǔn)確的方法［24］。預(yù)測(cè)蛋白包含有1個(gè)Rab結(jié)構(gòu)域和5個(gè)G結(jié)構(gòu)域（G1-G5），Rab結(jié)構(gòu)域是Rab蛋白家族共有的保守區(qū)，G結(jié)構(gòu)域是GTP結(jié)合和水解區(qū)域，在整個(gè)Ras小分子GTP酶超家族成員中都具有保守性。這些都印證了同源Rab基因結(jié)構(gòu)上高度保守［25］。同其他Rab11一樣，MrRab11上有兩個(gè)分別稱作開(kāi)關(guān)Ⅰ和開(kāi)關(guān)Ⅱ的區(qū)域，是Rab11與GDP、GTP結(jié)合的兩種狀態(tài)之間構(gòu)像發(fā)生變化的位置，當(dāng) Rab11和GTP結(jié)合時(shí)處于活化狀態(tài)，可以識(shí)別其效應(yīng)因子并執(zhí)行各種功能，GTP水解變?yōu)镚DP后變?yōu)闊o(wú)活性狀態(tài)，這在Rab11與其調(diào)節(jié)蛋白的相互作用、免疫防御等發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］。蛋白預(yù)測(cè)分析表明MrRab11不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，推測(cè)這是因?yàn)镽ab11是一種胞內(nèi)GTP酶，在細(xì)胞膜內(nèi)調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。

圖 4 陰溝腸桿菌感染后Rab11在各組織的表達(dá)情況

多數(shù)Rab蛋白沒(méi)有組織特異性，但也有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)Rab蛋白僅在特定的組織表達(dá)，如家蠶Rab7只在腦、卵巢、精巢表達(dá)［27］，Rab3A只在神經(jīng)分泌細(xì)胞表達(dá)［28］，組織特異性表達(dá)暗示這些Rab蛋白具有獨(dú)特的作用。本研究對(duì)MrRab11在羅氏沼蝦各組織表達(dá)分析表明:MrRab11在肝胰腺、肌肉、腸道等組織表達(dá)量相對(duì)較高，在鰓、心臟、胃、血液等組織少量表達(dá)，沒(méi)有明顯組織特異性。類似的，Rab基因在日本對(duì)蝦血淋巴、肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、腸道等組織都有廣泛表達(dá)［29］。肝胰腺是蝦類體液免疫和細(xì)胞免疫的重要場(chǎng)所［30，31］，很多與免疫相關(guān)基因已經(jīng)被證實(shí)在肝胰腺中有很高的表達(dá)量［32］。腸道是消化吸收的器官，會(huì)有各種包含病原體的微生物隨著食物進(jìn)入，同時(shí)Rab蛋白參與吞噬體的形成及成熟過(guò)程［33］，因此推測(cè)MrRab 11在羅氏沼蝦肝胰腺、肌肉和腸道的高表達(dá)量與其先天性免疫過(guò)程有關(guān)。

在研究免疫應(yīng)答試驗(yàn)中，注射器及其他因素對(duì)生物體刺激都可能顯著影響基因的表達(dá)水平［34］，為了避免這些刺激帶來(lái)的影響，本試驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組，相同時(shí)間分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組取樣。熒光定量PCR檢測(cè)了羅氏沼蝦注射陰溝腸桿菌后MrRab11的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照相比0.5h，注射0.5—1.5h后，在肝胰腺、肌肉、腸道中Rab11的表達(dá)量都有一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)，在肌肉中24h時(shí)又顯著上升，但試驗(yàn)組和對(duì)照組變化同步，沒(méi)有顯著差異，推測(cè)這是由于MrRab11對(duì)注射時(shí)的刺激及生理鹽水的應(yīng)激反應(yīng)，從而試驗(yàn)組和對(duì)照組變化沒(méi)有差異。而在注射后12h時(shí)，試驗(yàn)組肝胰腺中MrRab11的表達(dá)量上升，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），推測(cè)這是MrRab11對(duì)細(xì)菌感染的應(yīng)激表達(dá)，因?yàn)楦我认偈侵匾拿庖咂鞴伲?5］，對(duì)細(xì)菌等病原感染會(huì)有明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)； 而其他組織對(duì)外來(lái)病原的免疫應(yīng)答功能可能不如肝胰腺，只對(duì)針頭注射等生理刺激才會(huì)有應(yīng)答反應(yīng)，因此，本試驗(yàn)在注射陰溝腸桿菌后，肌肉、鰓、心臟等組織中試驗(yàn)組和對(duì)照組MrRab11的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果與斑點(diǎn)叉尾鲖［12，13］、中華絨螯蟹［14］、日本對(duì)蝦［15］等感染細(xì)菌后Rab基因的應(yīng)激表達(dá)結(jié)果相似，推測(cè)在本試驗(yàn)中MrRab11參與了羅氏沼蝦對(duì)陰溝腸桿菌的免疫應(yīng)答，下一步可以利用基因敲除等手段來(lái)驗(yàn)證其功能，并展開(kāi)對(duì)Rab家族其他相關(guān)基因的研究，弄清它們?cè)诹_氏沼蝦免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制和地位。

本研究根據(jù)EST序列，以RACE-PCR方法克隆獲得羅氏沼蝦MrRab11全長(zhǎng)cDNA序列，該序列含有Rab家族特有的結(jié)構(gòu)特征。以qRT-PCR方法分析了MrRab11的組織表達(dá)情況，結(jié)果顯示MrRab11在肝胰腺的表達(dá)量最高，其次是肌肉和腸道。通過(guò)病原刺激的方法，誘導(dǎo)MrRab11的免疫應(yīng)答，結(jié)果顯示注射12h后，試驗(yàn)組肝胰臟中MrRab11相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)MrRab11參與了羅氏沼蝦感染陰溝腸桿菌后的免疫應(yīng)答過(guò)程。對(duì)于主要依賴自身的先天非特異免疫機(jī)制進(jìn)行免疫防御的蝦蟹來(lái)講，這在今后病害防治、良種培育等方面都有重要參考價(jià)值。

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MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION RESEARCH OF RAB11 FROM GIANT FRESHWATER PRAWN，MACROBRACHIUM ROSENBERGII

XIA Zheng-Long，HUANG Xue-Na，HUANG Zhen-Yuan，CHEN Xue-Feng，GAO Qiang，PU Jian-Wei，SHEN Pei-Jing，PENG Fei and YANG Guo-Liang
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic Breeding of Zhejiang Province，National Genetic Breeding Center for Macrobrachium Rosenbergii，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou 313001，China）

Abstract:Rabs play important role in vesicular transport in all eukaryotic cells.The current study successfully cloned the full-length cDNA of a Rab gene of Macrobrachium rosenbergii（named MrRab11）by the rapid amplification of cDNA ends（RACE）techniques.The full-length of MrRab11 cDNA was 1381 bp，including a 226 bp 5′-terminal untranslated region（UTR），a 511 bp 3′UTR and a 645 bp open reading frame（ORF）encoding a polypeptide of 214 amino acids residues that contain a Rab domain.The calculated molecular mass of deduced MrRab11 polypeptide was 23.75 kD and the isoelectric point was 5.34.BLASTX analysis revealed that MrRab11 had significant homology to Anopheles gambiae，Daphnia pulex and Homalodisca vitripennis with the identity of 82%，83% and 82%，respectively.Quantitative real-time reverse transcription PCR analysis demonstrated a broad expression of MrRab11 in many tissues with the highest level in hepatopancreas and then muscle and intestine.The expression level of MrRab11 in hepatopancreas was significantly（P<0.05）induced by Enterobacter cloacae at 12h.These results suggest that MrRab11 may play a role in the innate immunity of M.rosenbergii.

Key words:Macrobrachium rosenbergii； Rab11； Tissue expressions； Immunological response

中圖分類號(hào)：Q344+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0443-08

doi:10.7541/2016.59

收稿日期：2015-04-30；

修訂日期：2016-01-20

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金（LY12C19008）； 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD26B04）； 浙江省重大科技專項(xiàng)（2012C12907）； 浙江省科研院所專項(xiàng)（2014F50002）資助［Supported by Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China（LY12C19008）； National Key Technologies R & D Program of China（2012BAD26B04）； Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（2012C12907）； Scientific Research Institutes Special Project of Zhejiang Province（2014F50002）］

作者簡(jiǎn)介：夏正龍（1987—），男，浙江龍泉人； 碩士研究生； 主要從事水產(chǎn)遺傳育種工作。E-mail:zjhill@126.com

通信作者：楊國(guó)梁，E-mail:ygl0572@163.com