野生圓口銅魚卵巢成熟內(nèi)分泌信號(hào)表達(dá)分析

夏雨果陳曉文賀江燕劉家壽殷 戰(zhàn)（.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 00049）

野生圓口銅魚卵巢成熟內(nèi)分泌信號(hào)表達(dá)分析

夏雨果1，2陳曉文1賀江燕1劉家壽1殷 戰(zhàn)1
（1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

摘要：圓口銅魚（Coreius guichenoti）是一種呈群同步發(fā)育繁殖的魚類，對(duì)其卵巢成熟各時(shí)期特征分析，可進(jìn)一步了解魚類卵巢成熟的分子調(diào)控機(jī)制，并為人工催產(chǎn)實(shí)踐提供理論支持。研究以野生雌性圓口銅魚不同發(fā)育時(shí)期的卵巢為研究對(duì)象，通過現(xiàn)場(chǎng)卵巢解剖觀察以及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)組織學(xué)分析，收集處于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的卵巢組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。研究顯示野生圓口銅魚卵巢組織在其成熟發(fā)育各階段具有明確的組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征。研究采用全序列轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以鯉科模式魚類斑馬魚的基因序列作為主要參考序列，共檢測(cè)得到11495 bp基因片段。聚焦內(nèi)分泌/自分泌信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)現(xiàn)促乳素（Prolactin，prl）、卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，fsh）、雌激素（Estrogen）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成酶類、生長(zhǎng)/分化因子9（Growth/differentiation factor 9，gdf9）、激活素（Activin）、和抗穆氏管激素（Anti-Müllerian hormone，amh）等轉(zhuǎn)錄表達(dá)和卵巢發(fā)育成熟呈現(xiàn)出顯著的關(guān)聯(lián)動(dòng)態(tài)變化。通過對(duì)樣品中卵巢成熟誘導(dǎo)激素（Maturationinducing hormone，MIH）合成酶分子的表達(dá)水平的觀察，發(fā)現(xiàn)涉及MIH的17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one的合成酶分子表達(dá)水平較高，而另一種MIH分子11-deoxycorticosteron的合成酶的表達(dá)水平處于檢測(cè)水平之下，因此，提示17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one可能是圓口銅魚卵巢成熟后期的主要促進(jìn)因子。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了完整的膽酸合成酶系列分子在卵巢轉(zhuǎn)錄組中的存在，這是魚類卵巢組織中具有合成膽酸能力的首次報(bào)道，其生理作用有待進(jìn)一步研究?？傊?，作為一種群同步發(fā)育的魚類，此項(xiàng)研究為魚類卵巢成熟發(fā)育過程中的內(nèi)分泌信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了大量的數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：圓口銅魚； 卵巢成熟； 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析； 內(nèi)分泌/自分泌信號(hào)

大部分的硬骨魚類都屬于卵生動(dòng)物，在雌性生殖系統(tǒng)中產(chǎn)生卵黃，并伴隨著卵成熟的發(fā)育過程。硬骨魚類雌性卵巢的發(fā)育過程存在多樣性，包括同步發(fā)育（單批產(chǎn)卵）、群同步發(fā)育（分批產(chǎn)卵）和異同步發(fā)育（連續(xù)產(chǎn)卵）類型。對(duì)于同步發(fā)育類型的魚類，卵細(xì)胞同步發(fā)育并一次性產(chǎn)完所有的卵，所有的卵粒在短期內(nèi)排出。而對(duì)于群同步發(fā)育的類型，在繁殖的卵巢內(nèi)，至少存在著兩個(gè)發(fā)育階段的卵粒。在繁殖季節(jié)，這些卵粒發(fā)育至成熟，之后分幾個(gè)批次成熟排出。對(duì)于異同步發(fā)育類型的魚類，卵巢中包含著各種不同發(fā)育階段的卵泡，并能在全年任何階段產(chǎn)卵。盡管繁殖策略存在多樣化，但是在卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟過程中，總是伴隨著一些共同的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征的變化［1］。生殖腺的發(fā)育過程也是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，這個(gè)過程包含著許多與組裝和修飾細(xì)胞組成的相關(guān)因子之間的協(xié)作調(diào)控，用以支持配子的發(fā)育。這個(gè)過程是通過大量的結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)變來完成的，包括初級(jí)卵母細(xì)胞形成、卵黃形成、卵母細(xì)胞成熟及生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle breakdown，GVBD）。許多早期的研究關(guān)注了內(nèi)分泌、旁分泌因子對(duì)魚類卵巢發(fā)育的調(diào)控及影響，近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)的應(yīng)用為研究不同繁殖策略的硬骨魚類卵巢發(fā)育及排卵的分子調(diào)控機(jī)制提供了寶貴的方法［1，2］。迄今為止，有關(guān)卵巢發(fā)育的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的工作較多地在模式魚類，如斑馬魚（Danio rerio）、鰷（Pimephales promelas）［3，4］，由于這些模式魚類均為非同步發(fā)育卵的代表，因此難以開展對(duì)不同成熟時(shí)期的卵巢特征的研究。盡管近期在養(yǎng)殖魚類，如花條鱸（Morone saxatilis）、橄欖比目魚（Paralichthys olivaceus）等也有關(guān)于卵巢轉(zhuǎn)錄組研究報(bào)道，但這些研究或者采用的定量效率較弱基因芯片技術(shù)、抑或是各期卵巢的混合樣品，其關(guān)注的依然是卵巢器官特異基因表達(dá)的特性分析，而非對(duì)不同成熟期的卵巢轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行分析［5，6］。

圓口銅魚（Coreius guichenoti），廣泛分布于長(zhǎng)江的上游地區(qū)，是一種重要的經(jīng)濟(jì)淡水魚類。圓口銅魚的幼魚會(huì)在長(zhǎng)江的重慶至宜賓江段生活3—4年，之后逐步上溯600—1000 km至水流湍急及水溫更低的上游江段。成魚（體重約500—2000 g）群體生活于長(zhǎng)江的上游江段，并在每年的4—7月進(jìn)行產(chǎn)卵活動(dòng)。近年來，長(zhǎng)江上游包括三峽大壩、溪洛渡大壩和向家壩的建設(shè)，導(dǎo)致這種洄游性魚類種群資源受到了威脅。近來，關(guān)于圓口銅魚的人工養(yǎng)殖已經(jīng)開展了一些工作，目的在于一方面保護(hù)野生魚類群體，另一方面以期未來能繼續(xù)利用具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚類。然而，由于圓口銅魚的養(yǎng)殖過程中病害造成的大量損失，以及圓口銅魚相對(duì)長(zhǎng)的成熟周期，使在網(wǎng)箱中飼養(yǎng)的圓口銅魚很難發(fā)育至性成熟期。因此，圓口銅魚苗種的獲得面臨困難，隨著在原有圓口銅魚成熟江段可以獲取的野生成熟雌性群體不斷下降，研究圓口銅魚的催熟技術(shù)以推動(dòng)人工繁殖的發(fā)展已經(jīng)迫在眉睫。

本研究采用以轉(zhuǎn)錄組分析為基礎(chǔ)的方法來探討圓口銅魚卵巢成熟過程中的分子特征。RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析）是轉(zhuǎn)錄組研究的新方法，它為基因組序列信息不完善的非模式生物的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究提供了可能［7］。本研究采用這種方法研究圓口銅魚卵巢發(fā)育過程中各個(gè)發(fā)育階段的基因表達(dá)特征，將增加對(duì)硬骨魚類卵母細(xì)胞發(fā)育過程的基因表達(dá)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，該項(xiàng)研究結(jié)果也將為針對(duì)各卵巢發(fā)育階段提供潛在的、能應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

成熟的雌性圓口銅魚樣品的采集時(shí)間為2012和2013年的4—5月，采集地點(diǎn)云南省華坪縣，位于金沙江中、下游，采樣工具為滾鉤、餌鉤。采集的魚類樣品，用麻醉使其昏迷，測(cè)量全長(zhǎng)（mm）、體重（g）、性腺重（g）。性體指數(shù)GSI（Gonadosomatic index），計(jì)算公式如下:GSI=性腺重/體重×100%。取部分卵巢樣品保存于波恩溶液中，用于之后的組織學(xué)分析。部分樣品保存于RNAlater溶液中（AM7020，Life Technologies），用酒精擦拭過的剪刀將RNAlater溶液中樣品剪碎，并迅速冷凍保存用于提取RNA。所有野生樣品的采集得到云南省農(nóng)業(yè)部門許可。

將波恩溶液中固定的卵巢組織樣本包埋在石蠟中并切成6—12 μm的連續(xù)切片。卵巢的染色利用標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精和伊紅溶液。圓口銅魚的卵巢分期參見Selman［8］，將卵巢分為5個(gè)時(shí)期。在卵巢分期的任何一個(gè)階段，卵巢表現(xiàn)出異質(zhì)性，包含了不同發(fā)育階段的卵粒。卵巢分期基于最成熟的卵母細(xì)胞階段，在10倍和40倍顯微鏡下進(jìn)行分辨。選取代表性的發(fā)育期Ⅲ期（卵黃形成期）、Ⅳ期（卵母細(xì)胞成熟期）和Ⅴ期（排卵期或成熟卵期）雌魚各1尾，取卵巢樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2 RNA提取及純化

RNA提取采用RNeasy Mini Kit（Qiagen）試劑盒，提取RNA后用RNase-free DNaseⅠ（Qiagen）處理去DNA。用Agilent 2000分析儀檢測(cè)RNA大小和完整性。采用PolyATract mRNA（Promega，Madison，WI，USA）分離純化mRNA。由反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物將片段化的mRNA合成cDNA第一鏈，第二鏈的合成則使用DNA polymerase Ⅰ和RNase H。用核酸外切酶和聚合酶進(jìn)行末端修復(fù)、連接接頭，分離純化，PCR擴(kuò)增創(chuàng)建cDNA文庫(kù)，采用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序采用Illumnima HiSeqTM2000，95 bp雙向測(cè)序。原始數(shù)據(jù)（Raw reads）通過去除接頭和低質(zhì)量序列后，采用SOAPaligner/soap2將原始數(shù)據(jù)比對(duì)到斑馬魚基因組序列上，允許兩個(gè)以上堿基不匹配（Zebrafish genome assembly version 9，Zv9； http:// www.sanger.ac.uk）。比對(duì)完后，統(tǒng)計(jì)reads在參考序列上的分布及覆蓋度，判斷比對(duì)結(jié)果并進(jìn)行質(zhì)控。運(yùn)用Trinity軟件（http://trinityrnaseq.sourceforge.net）進(jìn)行組裝拼接，得到轉(zhuǎn)錄本序列。為了利于樣品間轉(zhuǎn)錄水平的比較，每個(gè)文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)水平用RPKM（Reads Per kilo-base per Million reads）表示。確定基因轉(zhuǎn)錄活性的閥值是基于每個(gè)基因RPKM值的95%置信區(qū)間。GO（Gene Ontology，基因聚類）功能注釋使用軟件Blast2GO（version 2.3.5）（http:// www.blast2go.org/）進(jìn)行。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析使用帶ClueGO插件（http://www.ici.upmc.fr/cluego/cluegoDownload.shtml）的Cytoscape軟件（version 2.6.2）（http://www.cytoscape.org/）進(jìn)行。樣本之間RPKM值變化倍數(shù)為2倍及以上的基因認(rèn)為有差異表達(dá)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

為了驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果，選取9個(gè)與繁殖相關(guān)的基因通過熒光實(shí)時(shí)PCR確定其在3個(gè)發(fā)育期（各1尾樣本）中的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)在2014年圓口銅魚繁殖季節(jié)，自金沙江上游野外再采獲卵巢發(fā)育處于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的雌魚各一尾，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證的樣品，提取總RNA?？俁NA用RevertAid ?First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，引物采用oligo（dT）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）:SYBR綠色熒光染料Mix（Toyobo，Osaka，Japan）10 μL，引物0.25 μL，cDNA模板1 μL。選用glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapdh）作內(nèi)參，計(jì)算mRNAs的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，3次重復(fù)測(cè)量的值變異系數(shù)小于5%被認(rèn)為有效。不同樣品的表達(dá)水平采用變化倍數(shù)（Mean±SE）來表示，設(shè)第Ⅲ期為對(duì)照，即第Ⅲ期樣品的值均設(shè)為1倍。實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)見表 1。

2 結(jié)果

2.1 卵巢樣品的組織學(xué)特征

圓口銅魚的產(chǎn)卵主要是4或5齡雌性個(gè)體在4—5月或7月進(jìn)行。在卵巢組織樣品的組織學(xué)特征觀察之后，選取樣品H6007、H6003和H5006用于之后的轉(zhuǎn)錄組研究。3個(gè)樣品的基本信息見表 2。所選取的每個(gè)圓口銅魚卵巢樣品的代表性顯微圖像見圖 1。卵黃生成期（Ⅲ期）的特點(diǎn)是卵黃明顯沉積，且周圍有大量油滴形成。卵母細(xì)胞成熟期（Ⅳ期）的特點(diǎn)是液泡逐漸消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)卵黃增加，逐漸形成同質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)。排卵期（Ⅴ期）特點(diǎn)是生發(fā)泡破裂（GVBD）及消失，切片觀察可發(fā)現(xiàn)染色的卵母細(xì)胞數(shù)量明顯減少。隨著卵巢的發(fā)育成熟，GSI也從2.1%增加到6.1%，這和其他關(guān)于硬骨魚類的研究結(jié)果是相符合的［8］。圓口銅魚所有卵母細(xì)胞的發(fā)育并非完全同步的，導(dǎo)致樣本在轉(zhuǎn)錄組分析中部分的發(fā)育階段分子特征發(fā)生重疊掩蓋，然而，隨著發(fā)育的進(jìn)行，每個(gè)新的發(fā)育階段還是體現(xiàn)著顯著的組織學(xué)特征，相信各期所具有的獨(dú)特表達(dá)及組成會(huì)依然在轉(zhuǎn)錄組中有所體現(xiàn)。因此，選取的H6007（Ⅲ期）、H6003（Ⅳ期）和P5006（Ⅴ期）卵巢組織樣品作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析對(duì)象，將能夠反映卵巢成熟各階段的表達(dá)特征。

表 1 實(shí)時(shí)定量PCR中引物信息Tab.1 Information on the primers that were used for quantitative real-time RT-PCR

表 2 轉(zhuǎn)錄組分析的圓口銅魚樣品基本信息Tab.2 Basic data on the three selected largemouth bronze gudgeon ovary samples

2.2 卵巢發(fā)育階段特異性轉(zhuǎn)錄組

為了了解圓口銅魚卵巢成熟的分子基礎(chǔ)，本研究對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的卵巢樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較。Trinity拼接得到47—151個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列，其中共有35—255個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列（74.8%）比對(duì)到斑馬魚參考序列中（E value < 1E-5）。3個(gè)轉(zhuǎn)錄組中，至少有一個(gè)RPKM值大于4的轉(zhuǎn)錄本序列有13—330個(gè)（顯著表達(dá)轉(zhuǎn)錄本），有11—495（86.2%）在斑馬魚參考基因組中有相應(yīng)的基因描述。

圖 1 圓口銅魚卵巢主要發(fā)育期切片圖

通過對(duì)卵巢組織中的13330個(gè)顯著表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的分析，我們發(fā)現(xiàn)在某一特定時(shí)期的基因表達(dá)特征與其相鄰時(shí)期最相似（圖 2），表明基因表達(dá)譜與卵巢形態(tài)發(fā)育密切相關(guān)。隨著卵巢發(fā)育的進(jìn)行，差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也明顯不同。每個(gè)發(fā)育期表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量venn圖（圖 2），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期卵巢共有9992個(gè)共同表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，其中Ⅲ期和Ⅳ期卵巢共享11155個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而Ⅲ期和V期則僅共享10299個(gè)轉(zhuǎn)錄本。如圖2所示，隨著卵粒的成熟，可檢測(cè)到的表達(dá)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量逐漸減少，由Ⅲ期的12024、Ⅳ期的11832，至Ⅴ期的11172。

通過GO分析和KEGG通路分析，初步評(píng)估了參入性腺發(fā)育的主要生物學(xué)過程。不同樣本間發(fā)生最顯著影響的10個(gè)信號(hào)途徑GO和KEGG分析結(jié)果見表 3。這些通路分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了圓口銅魚卵母細(xì)胞成熟過程與線粒體或細(xì)胞代謝、細(xì)胞成分合成相關(guān)，這與前人研究的其他硬骨魚類是相似的［9—11］。已有研究報(bào)道，Gai蛋白和細(xì)胞內(nèi)cAMP參與孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟過程［12］。生發(fā)泡破裂（GVBD）和細(xì)胞核位移過程中，Rho信號(hào)起重要作用［13—15］。而在爪蟾（Xenopus）卵巢中，促成熟因子（Maturation-promoting factor，MPF）復(fù)合體的激活包括細(xì)胞周期依賴性控制蛋白（cdc2，cyclin-dependent control protein 2）和細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1），可調(diào)控卵母細(xì)胞成熟中生化過程的協(xié)調(diào)配合［16］。在3個(gè)樣品中，熱休克蛋白90（hsp90，heat shock protein 90）、cdc2，Ringo A和Mos Oocyte Mature Factor（mos）均有較高的表達(dá)量。圓口銅魚卵巢發(fā)育期后階段（Ⅴ期）上調(diào)的基因有，膜相關(guān)孕激素受體組件（Membrane-Associated Progesterone Receptor Component 2）、細(xì)胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白（cpe1，Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein 1）、Cyclin B1和Cyclin A。結(jié)果表明MPF和MOS相似的信號(hào)途徑在卵母細(xì)胞成熟過程中起作用。然而由于目前的KEGG軟件針對(duì)信號(hào)通路的分析過于強(qiáng)調(diào)病理生理過程，特別是腫瘤學(xué)研究，這種聚類分析不完全適合解釋卵巢發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，因此，本研究后續(xù)利用所獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步針對(duì)相關(guān)的內(nèi)分泌信號(hào)分子的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。

圖 2 圓口銅魚卵巢發(fā)育過程中表達(dá)譜venn圖

2.3 內(nèi)分泌和生長(zhǎng)因子信號(hào)

圓口銅魚卵巢為非同步發(fā)育，相對(duì)于完全非同步發(fā)育的斑馬魚卵巢組織，在圓口銅魚卵巢中相對(duì)集中的不同發(fā)育時(shí)期的卵巢樣品是研究硬骨魚類卵子發(fā)生很好的模型。采用RNA-seq測(cè)序分析，與信號(hào)分子相關(guān)的內(nèi)分泌/旁分泌因子在表 4中列出。從這些分子表達(dá)譜可以看出，哺乳動(dòng)物和魚類卵巢的分子生物學(xué)過程有相似的基本特征。

表 3 不同卵巢樣品中差異表達(dá)基因的GO聚類分析Tab.3 Gene ontology（GO）analysis of differentially expressed genes in the different ovary samples

硬骨魚類類固醇激素，如熟知的促成熟激素（MIHs），能調(diào)控性腺分化、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟［17］。按照現(xiàn)有來自哺乳類或前人在硬骨魚類中的研究，假定圓口銅魚卵巢中關(guān)鍵的類固醇合成酶途徑見圖 3。那么本研究顯示在圓口銅魚卵巢成熟過程中，17β雌二醇的合成途徑始終是處于活動(dòng)狀態(tài)。另外，前列腺素類，一組脂質(zhì)類介質(zhì)，包括前列腺素（PGs），在排卵過程中也起一定調(diào)控功能［18］。基于RNA-seq分析，在卵母細(xì)胞成熟階段，與前列腺素E（Prostaglandin E）合成相關(guān)的關(guān)鍵酶的表達(dá)量在卵巢發(fā)育Ⅳ是最高的，而前列腺素F的合成酶則在Ⅴ期達(dá)致最高（圖 4）。

2.4 圓口銅魚卵巢膽汁酸主要合成途徑

膽汁酸在脂質(zhì)和膽固醇代謝過程中起著重要的作用，通常膽汁酸在肝膽系統(tǒng)中合成，在胃腸道起作用［19—21］。然而，本研究RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，膽汁酸主要合成途徑中關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄本持續(xù)出現(xiàn)，如Cyp46A、Cyp7A、Cyp27A和Cyp8b（圖 5），與膽固醇合成相關(guān)的一些列關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄本在圓口銅魚卵巢中均有檢得，因此推斷硬骨魚類膽汁酸合成可能在卵巢中也發(fā)生。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果

為了驗(yàn)證RNA-seq分析中發(fā)現(xiàn)的一些關(guān)鍵內(nèi)分泌信號(hào)分子的差異表達(dá)情況，共選取9個(gè)基因設(shè)計(jì)特異性引物，并采用另外獨(dú)立采集的3個(gè)不同成熟階段的樣本RNA進(jìn)行驗(yàn)證（表 1）。這些基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征，表明其可能參與卵巢發(fā)育成熟過程的調(diào)控。RT-PCR的結(jié)果顯示，這9個(gè)基因在不同時(shí)期表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果相同，盡管表達(dá)量存在一定差異（圖 6）。

3 討論

作為分批產(chǎn)卵的魚類，圓口銅魚的卵巢在不同的發(fā)育階段中，都能觀察到異質(zhì)性的卵巢組織，采取的卵巢樣品中，約有30%的卵母細(xì)胞處于卵黃形成期。與Ⅲ期樣本中卵母細(xì)胞群相比，Ⅳ期樣品中處于成熟期卵母細(xì)胞占約20%。而在Ⅴ期樣本的卵巢組織中則出現(xiàn)了超過10%處于排卵階段的卵母細(xì)胞。這些觀察表明，在野生圓口銅魚的卵巢發(fā)育過程中，進(jìn)入后期成熟過程的卵母細(xì)胞僅占一部分，即使在出現(xiàn)了超過10%的卵母細(xì)胞達(dá)致成熟排卵期時(shí)，依然有發(fā)育至各期的卵母細(xì)胞在卵巢中存在，表明圓口銅魚的群同步性成熟特征。因此也表明我們所選取的樣品都將發(fā)生各個(gè)發(fā)育期存在部分重疊的分子特征。然而，我們假定每個(gè)新出現(xiàn)階段的分子特征是可區(qū)別的，并且能夠反映增加的和疊加的基因表達(dá)譜。同時(shí)，我們采用的整體卵巢組織取樣，也將真實(shí)地反映性腺成熟的實(shí)際發(fā)生過程，包含與生殖細(xì)胞交流中的來自生殖腺中的體細(xì)胞表達(dá)特征。

表 4 卵巢樣品中與內(nèi)分泌信號(hào)相關(guān)的差異表達(dá)基因Tab.4 Differentially expressed genes related with endocrine signaling genes in the ovary samples

圖 3 圓口銅魚卵巢性腺類固醇激素表達(dá)變化

圖 4 圓口銅魚卵巢與性腺廿烷酸合成相關(guān)的基因表達(dá)變化

圓口銅魚和斑馬魚都同屬于鯉科魚類［22］，由于沒有圓口銅魚全基因組信息，以斑馬魚基因組為參考序列，生物信息學(xué)分析顯示圓口銅魚轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平RPKM值大于4的轉(zhuǎn)錄本有86.2%是與斑馬魚轉(zhuǎn)錄本高度匹配的，表明我們的分析具有較高的可信度?；贕O聚類分析的KEGG通路分析揭示，圓口銅魚卵巢樣品中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)途徑包含:卵巢能量代謝、Gαi信號(hào)、胞內(nèi)cAMP驅(qū)動(dòng)信號(hào)和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等與形態(tài)變化高度相關(guān)的信號(hào)途徑［12，14—16］。這些觀察到的卵巢成熟特征與爪蟾和其他魚類的前期報(bào)道具有共有特征，因此，本研究的RNA-seq和GO分析具有較強(qiáng)的功能分析的可信度。

3.1 內(nèi)分泌和生長(zhǎng)因子信號(hào)

內(nèi)分泌/自分泌信號(hào)是機(jī)體調(diào)控生殖過程的重要信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，也是體外可能對(duì)圓口銅魚養(yǎng)殖過程中人工催熟雌魚實(shí)施干預(yù)的理論基礎(chǔ)，因此，本次分析主要聚焦圓口銅魚卵巢組織中內(nèi)分泌/自分泌信號(hào)分子的表達(dá)特征。和其他脊椎動(dòng)物一樣，硬骨魚類卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟及排卵過程受到卵巢外信號(hào)和卵巢濾泡內(nèi)部因子的雙重調(diào)控，這些因子包括垂體分泌的一些多肽類激素，如促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）和催乳素（PRL）［1，23］。這些垂體促性腺激素可以通過循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)載至性腺組織，由在該處表達(dá)的受體感應(yīng)從而接受垂體激素的調(diào)控，另外來自垂體等中樞內(nèi)分泌器官的促性腺激素也可以通過調(diào)控由身體其他部位，包括性腺組織的類固醇激素生成代謝而間接調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。例如，有研究表明促卵泡激素（FSH）能夠促進(jìn)卵泡產(chǎn)生17β-雌二醇，后者能夠促進(jìn)卵黃形成和卵母細(xì)胞成熟［17］。除了雌二醇外，一些轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ）超家族成員對(duì)調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟也起重要作用。TGFβ超家族成員主要包括生長(zhǎng)分化因子9（GDF9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15，bone morphogenetic protein 15）、激活素（Activin）、抑制素（Inhibin）和抗苗勒氏管激素（AMH）。以及針對(duì)活化素發(fā)生抑制作用的TGFβ家族信號(hào)的關(guān)聯(lián)分子卵泡抑制素（Follistatin），許多屬于TGFβ的信號(hào)途徑可以活躍地參入對(duì)卵巢發(fā)育的調(diào)節(jié)［24—27］。一些其他激素和生長(zhǎng)因子，如生長(zhǎng)激素類胰島素生長(zhǎng)因子（IGFs）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）也被報(bào)道在調(diào)節(jié)卵巢成熟中起作用［28，29］。從圓口銅魚的分子表達(dá)譜可以看出，魚類卵巢和哺乳動(dòng)物的分子生物學(xué)過程有相似的基本特征。

圖 5 圓口銅魚卵巢中與膽固醇和膽汁酸合成相關(guān)的基因表達(dá)

3.2 雌激素信號(hào)

我們發(fā)現(xiàn)圓口銅魚卵巢成熟過程中，F(xiàn)SH受體的表達(dá)量低，且隨著發(fā)育進(jìn)程逐漸降低，表明FSH主要在卵巢成熟的早期起作用，有報(bào)道表明FSH促進(jìn)竇卵泡發(fā)育，在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)作用停止［1］。此外，在圓口銅魚卵巢樣品中prl受體的表達(dá)量處于相當(dāng)平穩(wěn)的水平，有研究報(bào)道IGFs（Insulinlike growth factors）與卵泡發(fā)育密切相關(guān)［11］，而我們也發(fā)現(xiàn)igf-2和igf受體以及一些IGF結(jié)合蛋白基因（igfbps，IGF-binding protein genes）在圓口銅魚卵巢成熟過程中均有表達(dá)。令人意外的是我們未發(fā)現(xiàn)lh受體在成熟過程中的卵巢組織有明顯表達(dá)，其原因值得探究。

在正常情況下，卵母細(xì)胞的成熟過程依賴于卵母細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞間一系列的信號(hào)分子的相互溝通和協(xié)調(diào)。卵母細(xì)胞通過合成和分泌卵母細(xì)胞特異性因子直接調(diào)控其發(fā)育及卵泡的生長(zhǎng)和分化，如GDF-9和BMP15作用于卵泡顆粒細(xì)胞，改變其增殖、功能和分化。研究表明GDF-9缺陷的小鼠（C56BL/6）卵母細(xì)胞生長(zhǎng)加速，可推斷GDF-9參與負(fù)反饋調(diào)控途徑，緩和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)［30］。BMP-15缺失的綿羊（Ovis aries），卵泡發(fā)育至第一階段即停止發(fā)育，卵母細(xì)胞迅速?gòu)挠谢盍Φ穆雅葜邢В?1］。在本研究中，檢測(cè)到圓口銅魚卵巢中g(shù)df-9和bmp15有一定的表達(dá)量，且gdf-9的表達(dá)水平在排卵期顯著上升（圖 6）。這表明硬骨魚類和哺乳動(dòng)物可能采用的相似的方式，都是通過卵母細(xì)胞中g(shù)df-9和bmp15表達(dá)水平的時(shí)空變化來調(diào)控卵母細(xì)胞成熟。激活素與抑制素是TGFβ超家族中兩個(gè)緊密相關(guān)的信號(hào)成員，具有相反的生物學(xué)功能。激活素能夠加強(qiáng)FSH的生物合成和分泌，并參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。卵泡抑素（Fst，F(xiàn)ollistatin）不是TGFβ超家族成員，但屬于一種激活素結(jié)合蛋白，能夠抵消激活素活性。在斑馬魚及其他許多脊椎動(dòng)物卵巢中，卵母細(xì)胞發(fā)育早期激活素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)顯著高表達(dá)，成熟過程中逐漸下降，然而在排卵期又急劇上升。有報(bào)道激活素、抑制素和Fst在斑馬魚卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)［27］。然而，激活素、抑制素和Fst轉(zhuǎn)錄本在本次研究的圓口銅魚卵巢中未檢測(cè)到，一些激活素受體基因和Fst-like-1的表達(dá)卻能觀察到。有趣的是，圓口銅魚卵巢中激活素Ⅱ型受體（A c t i v i n typeⅡreceptor）的表達(dá)量在排卵期顯著下降。這些觀察結(jié)果表明，圓口銅魚卵母細(xì)胞成熟過程中包含一個(gè)類似激活素信號(hào)的調(diào)節(jié)效應(yīng)。AMH是TGFβ超家族另一成員，在小鼠卵巢原始卵泡增殖和優(yōu)勢(shì)卵泡選擇中起重要作用［24，25］。在本研究中，amh在圓口銅魚卵巢卵黃形成期有適度表達(dá)，在其他時(shí)期均處于較低的表達(dá)水平（圖 6）。這種amh表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化可能暗示其在卵母細(xì)胞成熟早期階段一起作用。

圖 6 卵巢成熟過程中關(guān)鍵內(nèi)基因分泌信號(hào)轉(zhuǎn)錄本的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

在硬骨魚類卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟過程中，類固醇激素，尤其是雌二醇-17β（Estradiol-17β），通過控制肝臟中卵黃蛋白原的合成來調(diào)控卵巢的發(fā)育。卵巢為雌二醇-17β合成的主要部位，合成過程受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控。estradiol-17β是一種天然的類固醇激素，在卵巢中由膽固醇合成而來［1，17］。魚類膽固醇的合成途徑見圖 5。如圖 5所示，關(guān)鍵酶的相對(duì)表達(dá)量，包括限速HMG CoA還原酶在內(nèi)，在所檢測(cè)的三個(gè)時(shí)期中表現(xiàn)出相當(dāng)穩(wěn)定的表達(dá)水平，這表明在其卵巢成熟各階段能合成足夠豐富的膽固醇資源。而由膽固醇生成雌二醇17β過程中（圖 3），需要的所有關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄本均有檢測(cè)到，只有cyp11a和cyp19a1a的表達(dá)水平在三個(gè)樣品中相對(duì)較低。圓口銅魚卵巢中沒有發(fā)現(xiàn)cyp11b、cyp21a和hsd17b3轉(zhuǎn)錄本，表明在圓口銅魚中并非依賴11-脫氧皮質(zhì)酮作為其主要的促生素激素（MIH）作用，此次檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)在圓口銅魚卵巢中睪丸酮合成途徑的存在。這些結(jié)果表明，17α，20β-雙羥孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one）可能是圓口銅魚卵母細(xì)胞成熟過程中主要的促成熟激素。盡管合成雌二醇17β關(guān)鍵酶的表達(dá)水平并沒有發(fā)育時(shí)期特異性，但是類固醇合成因子1a（sf-1a，steroidogenic factor 1a）和雌激素相關(guān)受體α（errα，estrogen-related receptor α）表達(dá)水平在圓口銅魚卵巢排卵期顯著下降。而且，磺基轉(zhuǎn)移酶家族2（sf 2，sulfotransferase family 2）是雌二醇17β代謝的主要代謝酶［32，33］，其表達(dá)水平在排卵期卵巢中顯著高表達(dá)（圖 4、圖 6）。這些結(jié)果表明，在圓口銅魚卵巢中，雌二醇17β的活性在排卵期可能是下調(diào)的。

3.3 雄激素信號(hào)

在魚類卵巢中，前列腺素（PGs）可由廿碳四烯酸（Arachidonic acid）合成。在雌性繁殖過程中，前列腺素被認(rèn)為是一種重要的中介物質(zhì)。前列腺素氧化環(huán)化酶2（Ptgs2，Prostaglandin-endoperoxide synthase 2； 又名環(huán)氧化酶-2，COX-2），能將廿碳四烯酸轉(zhuǎn)化成內(nèi)過氧化物PGH2，是卵泡中前列腺素合成的限速酶［18，34］。如圖 4所示，PGE2合成途徑中的所有關(guān)鍵酶都具有相當(dāng)高的表達(dá)水平，而且一些合成酶的轉(zhuǎn)錄水平，包括限速酶cox-2在內(nèi)，在卵母細(xì)胞成熟期升高（圖 4、圖 6）。PGE2生成的階段特異性可能表明其活躍地參與圓口銅魚的卵巢成熟過程的調(diào)節(jié)。

3.4 膽汁酸合成因子

膽汁酸是一種類固醇物質(zhì)，主要在肝臟中由膽固醇合成。膽汁酸有兩條合成途徑，經(jīng)典途徑（肝臟）和替代途徑（肝外型），已有研究表明這兩條合成途徑在人類卵巢中均存在［2 0］。圓口銅魚卵巢KEGG分析表明，在卵巢中存在著膽汁酸合成的兩種主要途徑的所有關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄本，且沒有階段特異性（圖 5）［19—21］。這是首次發(fā)現(xiàn)在魚類卵巢中有膽汁酸的合成，然而，膽汁酸在卵泡中生成的生理學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。

利用消減雜交［9，35，36］和寡核苷酸基因芯片［10，11，37］技術(shù)，已經(jīng)對(duì)一些硬骨魚類進(jìn)行了與階段特異性的卵巢成熟相關(guān)的差異基因表達(dá)譜研究。然而，RNA測(cè)序是進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析的新標(biāo)準(zhǔn)，相比目前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，全mRNA測(cè)序展現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性［7］。迄今為止，還沒有關(guān)于利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)τ补囚~類卵巢進(jìn)行分期進(jìn)行差異基因表達(dá)分析的報(bào)道。本文利用RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)野生的圓口銅魚卵巢成熟過程進(jìn)行表達(dá)譜分析，并主要聚焦于圓口銅魚卵巢成熟過程的內(nèi)分泌/自分泌調(diào)控因子，并概括了在卵巢成熟過程中的這些信號(hào)的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征（圖 7）。本研究觀察為指導(dǎo)圓口銅魚的卵巢發(fā)育的內(nèi)分泌干預(yù)方式提供了依據(jù)，一些動(dòng)態(tài)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本也具有作為識(shí)別卵巢發(fā)育階段和卵子獲得受精能力的潛在特征性分子標(biāo)記。

圖 7 圓口銅魚卵巢成熟過程中重要內(nèi)分泌/自分泌信號(hào)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

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ENDOCRINE GENE EXPRESSION PATTERNS ASSOCIATED WITH THE OVARIAN MATURATION OF WILD FEMALE LARGEMOUTH BRONZE GUDGEON（COREIUS GUICHENOTI）

XIA Yu-Guo1，2，CHEN Xiao-Wen1，HE Jiang-Yan1，LIU Jia-Shou1and YIN Zhan1
（1.The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract:Oocyte maturation in fish involves numerous cell signaling cascades，including complex regulation by a set of endocrine/autocrine factors during specific stages of oocyte development.Wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）in the Yangtze River，which are group-synchronous reproducers，provide an opportunity to characterize the features associated with each emerging stage during the process of ovary development.This study reports the transcriptome profiling analysis of wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）ovaries at various morphologically diverse stages using the powerful RNA-seq approach.Our RNA-seq analysis identified 11495 contigs with definite gene description according to the zebrafish genome.Focusing on the endocrine/autocrine signaling pathways involved in oocyte maturation and ovulation，the expression profiles of the genes involved in the sensing cascade and metabolism pathways of various hormones and growth factors，such as prolactin（PRL），follicle-stimulating hormone（FSH），estrogen，prostaglandin E2（PGE2），growth/differentiation factor 9（GDF9），activin，and anti-Müllerian hormone（AMH），were analyzed.Our results indicate an overall conservation of the components and transcriptome alterations underlying oocyte maturation in fish and other vertebrate models.The transcriptional profile also suggests that 17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one and not 11-deoxycorticosteron may be synthesized as the maturation-inducing hormone in largemouth bronze gudgeon.The transcripts of the complete set of genes associated with the primary bile acid synthesis pathway in the fish ovary were also observed.This transcriptome profiling analysis provides valuable information regarding thousands of transcripts involved in the ovulation of wild largemouth bronze gudgeon.Because this fish is a wild group-synchronous spawner，the results obtained in our study also revealed insights into the cascades of endocrine regulatory events underlying fish oocyte maturation.

Key words:Coreius guichenoti； Ovarian maturation； Transcriptome analysis； Endocrine/autocrine signals

中圖分類號(hào)：Q344+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0431-12

doi:10.7541/2016.58

收稿日期：2015-05-05；

修訂日期：2015-07-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃基金項(xiàng)目（No.2012BAD25B08）； 三峽集團(tuán)研究項(xiàng)目（CT-12-08-01）資助［Supported by the National Key Technology R&D Program of China（No.2012BAD25B08）； Research Project of China Three Gorges Corporation（CT-12-08-01）］

作者簡(jiǎn)介：夏雨果（1988—），女，湖北人； 博士研究生； 主要從事魚類生態(tài)學(xué)和魚類資源學(xué)研究。E-mail:xiayg@ihb.ac.cn

通信作者：殷戰(zhàn)，zyin@ihb.ac.cn； 劉家壽，jsliu@ihb.ac.cn