殼聚糖磷脂酰膽堿對癡呆大鼠學習能力和海馬區(qū)白細胞介素-1β表達的影響

郭　鶴　孟慶慧

(菏澤醫(yī)學專科學校護理系基礎護理學教研室，山東　菏澤　274000)

殼聚糖磷脂酰膽堿對癡呆大鼠學習能力和海馬區(qū)白細胞介素-1β表達的影響

郭鶴孟慶慧

(菏澤醫(yī)學?？茖W校護理系基礎護理學教研室，山東菏澤274000)

〔摘要〕目的觀察殼聚糖磷脂酰膽堿對治療經海馬內注射Aβ25～35的健康Wistar大鼠所誘導的阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬內白細胞介素(IL)-1β的表達數量以及該藥物對AD大鼠學習記憶能力的干預療效。方法對健康Wistar大鼠經兩側海馬內注射Aβ25～35誘導建立AD大鼠炎性癡呆模型，Morris水迷宮以及免疫組織化學方法分別觀察AD模型大鼠經藥物治療前后學習記憶能力以及海馬內炎性表達因子IL-1β的表達狀況。結果對照組和藥物組大鼠的平均逃避潛伏期(AEL)比AD模型組顯著縮短、2 min內跨越原平臺次數和在靶象限時間比模型組明顯延長(P<0.05)。模型組大鼠海馬區(qū)IL-1β陽性量高于對照組(P<0.01)，藥物組IL-1β陽性表達較模型組顯著下降(P<0.05)。 結論殼聚糖磷脂酰膽堿對改善AD大鼠學習記憶能力和注射Aβ25～35后誘導的炎性反應均有一定的治療作用。

〔關鍵詞〕殼聚糖磷脂酰膽堿；阿爾茨海默??；白細胞介素-1β；炎性反應

阿爾茨海默病(AD)病因較為復雜，特征性的病理學改變是發(fā)生神經原纖維纏結(NFT)、大量老年斑(SP)形成以及神經元的丟失〔1〕。然而，現今仍缺乏有效的防治藥物以及有效的治療手段。近些年來，有研究表明，大腦內部的炎癥反應在AD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用〔2,3〕。因此，抑制腦內炎性因子的產生成為當前防治AD藥物研究的熱點之一。Aβ25～35的凝聚狀態(tài)具有毒性作用，它能引起神經元損傷、學習記憶能力損害。本研究采用大鼠左右兩側海馬立體定位定向注射Aβ25～35的方法建立AD大鼠動物模型，研究殼聚糖磷脂酰膽堿對AD大鼠的抗感染治療作用，為臨床應用殼聚糖磷脂膽堿治療AD提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1動物與分組購買山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物部的Wistar大鼠30只，SPF級，6～8月齡，體重(350±30)g，標準條件下飼養(yǎng)〔(20±2)℃，濕度50%～60%〕，隨機分為對照組、模型組和藥物組(n=10)。

1.2主要藥品、試劑及儀器Aβ25～35(美國 Sigma公司)；IL-1β抗體(美國Biowoild公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。DMS-2Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；江灣Ⅰ型C腦立體定向儀(第二軍醫(yī)大學)；超薄組織切片機和DME型光學顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1Aβ25～35孵育無菌條件下，用生理鹽水將Aβ25～35稀釋。37℃條件下連續(xù)孵育7 d，變?yōu)橛卸拘缘哪蹜B(tài)Aβ25～35。

1.3.2模型制備及處理方法參照大鼠腦立體定位圖譜，將模型組和藥物組大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉后，固定頭部于腦立體定位儀，按照常規(guī)先備皮消毒切開表層皮膚，暴露大鼠的前囟部位，再用牙科鉆鉆孔后將10 μl注入兩側海馬內，每一側各注入藥物Aβ25～355 μl，前囟后(AP)=-3.5 mm,左右旁開(ML)=2.5 mm,進針深度(DV)=3.0 mm。對照組經以上同樣操作注射5 μl 0.9%生理鹽水。造模完成后，給予藥物組150 mg·kg-1·d-1的殼聚糖磷脂酰膽堿灌胃，其他兩組給予2 ml 0.9%生理鹽水灌胃，實驗時間為4 w。

1.3.3行為學觀察本實驗目的為檢測大鼠的學習記憶能力情況。實驗分為3個階段，每一次實驗時間為6 d(定位航行試驗為期5 d，空間探索實驗為期1 d)。前者實驗目的是記錄各組大鼠尋找平臺用的時間，稱為大鼠的逃避潛伏期。后者的實驗目的是檢測大鼠在2 min內跨原平臺位置的次數以及在靶象限的停留時間。

1.3.4免疫組織化學法染色根據大鼠體重用10%水合氯醛3.5 ml/kg通過腹腔注射將其麻醉后固定，心臟取血2 ml后,先用200～300 ml的0.9%生理鹽水灌注，再用300～400 ml的4℃冰4%多聚甲醛進行大鼠心臟灌注，待大鼠四肢變僵硬后，剪斷頭部剖開取腦，置于4%多聚甲醛中固定。固定后采用冠狀面切取海馬部位標本，緩慢流水沖洗過夜，經75%～85%～90%～100%梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，浸蠟，包埋，切片(4 μm)，免疫組化PV法染色檢測，一抗IL-1β濃度1∶100。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1水迷宮實驗結果隨著訓練次數的增加，各組大鼠對平臺位置產生了記憶，各組大鼠的平均逃避潛伏期(AEL)逐漸縮短。造模之前水迷宮實驗結果顯示，第1～2天各組大鼠尋找平臺所用時間逐漸縮短，第3～5天各組趨于穩(wěn)定，各組所用時間相比并沒有顯著差異(P>0.05)，空間探索實驗結果亦無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模7 d后，定位航行實驗結果顯示，AD模型組和藥物組大鼠AEL較造模前比明顯延長，與對照組有顯著差異(P<0.05)?？臻g探索實驗結果顯示模型組和藥物組大鼠在單位時間內跨越原平臺次數以及在靶象限停留時間明顯減少(P<0.05)。藥物治療4 w后，藥物組大鼠AEL時間較模型組明顯減少(P<0.05)，見表1、表2。

2.2免疫組織化學染色結果模型組大鼠海馬區(qū)細胞排列紊亂，細胞數目和層數減少，胞核固縮，細胞核染色加深，炎性因子IL-1β大量表達(46.40±4.62)，細胞染色深，棕黃色，胞質表達。對照組陽(10.70±2.91)性表達量明顯少于模型組，藥物干預治療后藥物組(28.70±3.56)IL-1β表達量較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖1。

表1　各組空間探索實驗成績

表2　各組水迷宮逃避潛伏期成績

圖1　各組海馬CA1區(qū)IL-β表達(DAB，×200)

3討論

Aβ是AD形成和發(fā)展的重要因素〔4,5〕。 也有學者認為，NFT和軸索缺乏營養(yǎng)等病理性變化以及相應臨床癥狀的出現均晚于Aβ的形成，而且較高濃度的Aβ能引起神經元變性和死亡，發(fā)生炎性反應。近年研究表明，腦內的炎性反應貫穿于AD慢性病程的整個過程，膠質細胞激活活化是腦內炎癥反應較為顯著的特征，它具有誘導一系列炎性細胞活化，增殖的功能〔6,7〕。White等〔8〕實驗研究表明，膠質細胞活化后釋放的IL-1β引發(fā)炎癥反應是 AD 早期發(fā)展變化和進展的關鍵病理炎性因子。在Aβ刺激下，小膠質細胞被激活產生的IL-1β能上調小膠質細胞表達釋放其他細胞因子，還可誘導產生前列腺素、NO、APP等的生成增加，進一步造成Aβ堆積。Goshen等〔9〕研究證實海馬區(qū)內出現大量IL-1β，是出現炎癥反應的重要標志。IL-1β是細胞內發(fā)揮重要作用的免疫調節(jié)因子，在異常沉積的老年斑周圍積聚了大量的小膠質細胞和星形膠質細胞，激活的膠質細胞能夠釋一氧化氮(NO)，TNFα,IL-1β等炎癥因子〔10～12〕。在AD患者大腦中IL-1β主要由激活的小膠質細胞釋放產生〔13,14〕,炎性分子作用于小膠質細胞又可促進其他炎性分子的產生，所以這種現象稱為交互作用。因為交互作用持續(xù)存在因此促進了AD腦內慢性炎癥反應的形成和炎性因子產物水平會持續(xù)升高，高水平的炎性因子產物對AD腦損傷與淀粉蛋白變性產生廣泛的影響。有實驗研究證明AD老年斑中發(fā)現存在的大量IL-1β蛋白及其mRNA等。閆恩志等〔15，16〕研究報道，IL-1β表達增加后可通過激活的小膠質細胞和星形膠質細胞使iNOS 和環(huán)氧化酶的表達增加。所以，IL-1β是炎性反應中的一個重要因子。本實驗之前的研究結果提示殼聚糖磷脂酰膽堿可能具有抑制或延遲IKKβ/NF-κB通路激活，降低炎癥因子激活增生，起到保護神經膠質細胞作用〔17〕。本次實驗研究的結果顯示殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組海馬內炎性因子IL-1β表達降低，同時Morris水迷宮測試成績有明顯改善，提示殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組對AD大鼠空間學習記憶能力有改善作用。

綜上，在體條件下Aβ25～35誘導AD大鼠腦組織小膠質細胞增生、活化后，IL-1β大量表達，實驗結果表明，殼聚糖磷脂膽堿能夠減少炎性因子IL-1β的表達，可改善AD大鼠學習記憶能力，這說明殼聚糖磷脂膽堿能夠抑制AD大鼠的腦部炎性反應，可能是防治AD的有效途徑之一，但由于本實驗屬于小樣本研究，具體的臨床應用還需要進行更進一步的探討。

4參考文獻

1Braak H，Braak E.Frequency of stages of Alzheimer-related lesions in different age categories〔J〕.Neurobiol Aging，1997；18(4):351-5.

2Tuppo EE，Arias HR.The role of inflammation in Alzheimer’s disease〔J〕.Biochem Cell Biol,2005；37(2):289-305.

3Liu L,Chan C.The role of inflammasome in Alzheimer's disease〔J〕.Ageing Res Rev,2014；15(5):6-15.

4孫博，費洪新，姜波，等.阿爾茨海默病發(fā)病機制初探〔J〕.中醫(yī)藥信息,2014；31(3)：26-30.

5孟慶慧.Aβ誘導AD大鼠的炎癥機制及乙酰葛根素和殼聚糖磷脂酰膽堿的干預作用〔D〕.濟南：山東大學，2013.

6Ransohoff RM，Cardona AE.The myeloid cells of the central nervous system parenchyma〔J〕.Nature,2010；468:253-62.

7Galimberti D,Scarpini E.Inflammation and oxidative damage in Alzheimer’s disease:friend or foe〔J〕?Front Biosci(ScholEd),2011；3:252-66.

8White JA，Manelli AM，Holmberg KH，etal.Differential effects of oligomeric and fibrillar amyloid-beta 1-42 on astrocyte-mediated inflammation〔J〕.Neurobiol Dis，2005；18(3):459-65.

9Goshen I,Yirmiya R.Interleukin-1(IL-1):a central regulator of stress responses〔J〕.Front Neuroendocrinol,2009；30(1):30-45.

10Li Y，Liu L，Barger SW，etal.Interleukin-1 mediates pathological effects of microglia on tau phosphorylation and on synap-tophysin synthesis in cortical neurons through a p38-MAPK pathway〔J〕.J Neurosci，2003；23(5):1605-11.

11Guo J T，Yu J，Grass D，etal.Inflammation-dependent cerebral deposition of serum amyloid a protein in a mouse model of amyloidosis〔J〕.J Neurosci，2002；22(14):5900-9.

12 Lee JW，Lee YK，Yuk DY，etal.Neuro-inflammation in-duced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment through enhancement of beta-amyloid generation〔J〕.J Neuroinflam，2008；29(5):37.

13鄔烈銘.老年性癡呆患者認知功能與血清炎性細胞因子濃度的相關研究〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012；11(6)：105.

14劉愷,牛艷麗,鄧錦波.小膠質細胞與阿爾茨海默病〔J〕.解剖學雜志,2014；37(2):258-61.

15閆恩志,范瑩,隋海娟,等.阿魏酸鈉對脂多糖引起的大鼠海馬炎癥反應的抑制作用及其機制探討〔J〕.中成藥，2013；35(2)：211-5.

16Matousek SB,Ghosh S,Shaftel SS,etal.Chronic IL-1β-mediated neuroinflammation mitigates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease without inducing overt neurodegeneration〔J〕.J Neuroimmune Pharmacol，2012；7(1):156-64.

17郭鶴，孟慶慧，汪娟娟，等.殼聚糖磷酯酰膽堿對AD大鼠海馬中iNOS和IKKβ表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(9):2073-6.

〔2014-12-11修回〕

(編輯曹夢園)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2348-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.015

第一作者：郭鶴(1985-)，女，助教，碩士,主要從事老年性癡呆研究。