肝X受體通過(guò)線粒體通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

王云開(kāi)　陶　劍　李衛(wèi)勇　王迎春　殷　然

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科　江西省高血壓研究所，江西　南昌　330006)

肝X受體通過(guò)線粒體通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

王云開(kāi)陶劍李衛(wèi)勇1王迎春殷然

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科江西省高血壓研究所，江西南昌330006)

〔摘要〕目的探討高糖環(huán)境中肝X受體通過(guò)線粒體途徑在調(diào)控H9C2細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。方法以H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，分為低糖組(Control組)、甘露醇組、高糖組、高糖+T0901317組及高糖+5CPPSS-50組。檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞的活性，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，Bax 、Bcl-2 mRNA，cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率，并觀察細(xì)胞線粒體膜電位變化。結(jié)果表達(dá)LXRs組明顯降低高糖誘導(dǎo)的Bax mRNA、激活型caspase3蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；上調(diào)高糖抑制的Bcl-2 mRNA表達(dá)和線粒體膜電位。結(jié)論LXRs激動(dòng)劑T0901317可改善高糖環(huán)境中H9C2細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用；抑制LXRs后，對(duì)高糖環(huán)境中H9C2細(xì)胞損傷作用更明顯。LXRs可通過(guò)線粒體途徑調(diào)控高糖環(huán)境所致H9C2細(xì)胞凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕高糖；肝X受體；凋亡；線粒體通路

糖尿病時(shí)線粒體活性氧簇(ROS)〔1〕產(chǎn)生增多可導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，膜電位下降。線粒體中包含著許多重要的與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)的蛋白酶或蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞色素C、半胱氨酸蛋白酶(caspase-2)，3，9、Bcl-2家族、AIF等。當(dāng)線粒體膜通透性增加時(shí)，這些凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到胞質(zhì)中增多，從而加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生。肝X受體(LXRs)是一類屬于核受體超家族依賴配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在能量代謝、炎癥、凋亡及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活LXRs可抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB等信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。研究激活LXRs能否抑制高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞的凋亡，且這種效應(yīng)是否是通過(guò)線粒體途徑來(lái)完成對(duì)尋找防治糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用LXRS激動(dòng)劑T0901317及抑制劑5CPPSS-50處理高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位變化及線粒體途徑中相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，探討LXRs調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡與線粒體途徑的關(guān)系，為糖尿病心肌病的防治提供新的靶向及理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料H9C2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉、甘露醇粉、T0901317、羅丹明123購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膽重收縮素八肽(CCK8)溶液、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzolreagent、聚合酶鏈反應(yīng)引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ROS檢測(cè)試劑盒；5CPPSS-50購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；熒光素標(biāo)記物(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自Vazyme有限公司；兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；First-strand cDNA synthesis kit、All-in-One qPCR Mix購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組從培養(yǎng)瓶中取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞傳代計(jì)數(shù)，在6孔板或96孔板中按以下分組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為①Control組：低糖DMEM培養(yǎng)基(D-葡萄糖濃度5.5 mmol/L)培養(yǎng)H9C2細(xì)胞24 h后換液，不進(jìn)行任何干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；②甘露醇組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換為等滲D-甘露醇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h；③高糖組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；④高糖+T0901317組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基并加入T0901317(終濃度10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；⑤高糖+5CPPSS-50組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基并加入5CPPSS-50(終濃度15 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2CCK-8檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞的活性選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9C2細(xì)胞進(jìn)行傳代計(jì)數(shù)，按每孔100 μl細(xì)胞懸液(約5 000個(gè)細(xì)胞)為標(biāo)準(zhǔn)，加入96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并預(yù)留只含等量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的空白對(duì)照組。在最外層的孔周加入磷酸鹽緩沖液(PBS)以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，相應(yīng)組別更換為D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基及D-甘露醇等滲培養(yǎng)基，并進(jìn)行藥物干預(yù)，24h后，每孔加入10 μl CCK-8；將96孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，再分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的OD值。細(xì)胞活性=〔(處理組-空白對(duì)照)/(正常組-空白對(duì)照)〕×100%。

1.2.3二氧二氫光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L；收集細(xì)胞后重懸于稀釋好的DCFH-DA中(1 ml)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣品內(nèi)細(xì)胞活性氧水平。

1.2.4羅丹明123熒光染色觀察線粒體膜電位的變化將5 mg羅丹明123粉末溶于1 ml二甲基亞砜(DMSO)中，配成羅丹明123母液備用；用培養(yǎng)基將羅丹明123母液稀釋為5 μg/ml的工作液；將6孔板中的細(xì)胞用PBS洗滌2遍，向各孔加入1 ml羅丹明123工作液，37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min；去除工作液，并用PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)提取各組細(xì)胞RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度(RNA原液濃度(mg/L)=OD260 nm×40×稀釋倍數(shù)，純度要求達(dá)到OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.1。按濃度計(jì)算出1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2 μl cDNA進(jìn)行qRT-PCR，以GADPH作為內(nèi)參對(duì)照，檢測(cè)Bax和Bcl-2的mRNA水平。每個(gè)樣品均重復(fù)三次，ΔCt值=樣本基因Ct值-對(duì)應(yīng)內(nèi)參Ct值；取Control組的ΔCt值的平均值作為對(duì)照，ΔΔCt值=每個(gè)樣本ΔCt值-參照組的ΔCt值；計(jì)算出2-ΔΔCt值后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Western印跡檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞酶切caspase-3蛋白的表達(dá)分別提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白的濃度，配制二喹啉甲酸(BCA)工作液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并加適當(dāng)體積樣品到96孔板中；各孔加入200 ml BCA工作液育充分混勻后，置于37℃恒溫箱中孵育30 min；以0號(hào)孔作為對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處的吸光值；樣品蛋白濃度(μg/μl)：根據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的蛋白含量除以樣品體積，再乘稀釋倍數(shù)。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)和電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，先后用Ⅰ抗及Ⅱ抗孵育，按Supcrsignal west fomto trial kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)ImageProPlus軟件，分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)灰度進(jìn)行組間比較。

1.2.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡將6孔板中各組細(xì)胞用胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，用PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于200 μl上樣緩沖液。加入10 μlannexin V-FITC和10 μl碘化吖啶(PI)，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μl上樣緩沖液，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞的活性與Control組(100%)相比，高糖組(62.76±1.34)%、高糖+T0901317(83.23±2.17)%、高糖+5CPPSS-50組(56.48±1.41)%細(xì)胞活性均降低(P<0.05)，而甘露醇組與Control組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比，高糖+T0901317細(xì)胞活性較高，高糖+5CPPSS-50組細(xì)胞活性降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2DCFH-DA法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與Control組(24.65±1.83)相比，高糖組ROS生成水平(62.06±1.94)明顯升高(P<0.01)，甘露醇組(26.64±1.18)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與高糖組相比，高糖+T0901317組(47.51±1.90)ROS生成水平降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50組(77.8±2.68)ROS生成水平升高(P<0.01)。

2.3羅丹明123檢測(cè)H9C2細(xì)胞線粒體膜電位變化Control組與甘露醇組熒光強(qiáng)度最高，且二者無(wú)明顯差異；與Control組相比，高糖+T0901317組、高糖組、高糖+5CPPSS-50組熒光強(qiáng)度均減弱；與高糖組相比，高糖+T0901317組熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，高糖+5CPPSS-50組熒光強(qiáng)度稍弱。見(jiàn)圖1。

2.4qRT-PCR檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)以Control組(表達(dá)量為1)進(jìn)行比較，高糖+T0901317組(10.58±1.70)、高糖組(27.10±0.83)、高糖+5CPPSS-50組(47.19±1.58)Bax mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，其中高糖組Bax 的mRNA表達(dá)是Control組的27.10±0.83倍，高糖+5CPPSS-50組Bax mRNA表達(dá)是Control組的47.19±1.58倍，高糖+T0901317組的Bax mRNA表達(dá)是Control組的10.58±1.70倍，差異均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而甘露醇組(1.12±0.32)與Control組相比，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組相比，高糖+T0901317組Bax mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50組Bax mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)。以Control組表達(dá)量為1進(jìn)行比較，甘露醇組Bcl-2的mRNA表達(dá)為Control組的0.95±0.04倍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組Bcl-2的mRNA表達(dá)為Control組的0.04±0.03倍；高糖+T0901317組Bcl-2的 mRNA表達(dá)為Control組的0.23±0.05倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50組Bcl-2的mRNA表達(dá)為Control組的0.02±0.01倍。與高糖組相比，高糖+T0901317組Bcl-2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50組Bcl-2的mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)。

2.5Western印跡檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞酶切caspase-3蛋白的表達(dá)與高糖組(0.52±0.05)相比，高糖+T0901317組(0.83±0.04)的酶切caspase-3蛋白水平下調(diào)(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50組(0.97±0.05)的酶切caspase-3蛋白水平上調(diào)(P<0.01)；而甘露醇組(0.33±0.06)與Control組(0.32±0.03)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖1　各組H9C2細(xì)胞線粒體膜電位(E×/Em:505×529)

圖2　各組酶切caspase-3蛋白表達(dá)

2.6Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡與Control組(21.25±1.57)相比，高糖組凋亡率明顯上升(P<0.01)，甘露醇組(22.67±1.64)凋亡率無(wú)明顯改變(P>0.05)；與高糖組(48.12±2.81)相比，高糖+T0901317組(34.52±2.95)凋亡率有所降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50組(55.20±2.96)凋亡率上升(P<0.01)。

3討論

糖尿病心肌病的病理過(guò)程極其復(fù)雜，葡萄糖脂肪酸代謝紊亂、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、鈣平衡調(diào)節(jié)異常、RAAS的激活、心肌細(xì)胞凋亡等多種因素等都參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。高糖環(huán)境中，線粒體內(nèi)ROS的過(guò)量生產(chǎn)，使線粒體膜通透性增加，線粒體內(nèi)致凋亡因子釋放增多，通路相關(guān)信號(hào)通路，加速細(xì)胞凋亡。LXRs在能量代謝、炎癥、凋亡及RASS中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。線粒體內(nèi)含有多種凋亡相關(guān)因子，如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)caspase-2，3，9等，凋亡過(guò)程中通過(guò)線粒膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中，隨后引起特異性凋亡發(fā)生。同時(shí)多種促凋亡蛋白及凋亡誘導(dǎo)物可轉(zhuǎn)移至線粒體，破壞線粒體膜的通透性和完整性，加速線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放，進(jìn)一步使凋亡細(xì)胞增多〔3〕。ROS是線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的一個(gè)導(dǎo)致氧化損傷和老化的破壞性產(chǎn)物，大量研究證實(shí)，ROS的積聚和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體膜電位及通透性的改變，最終與心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生相關(guān)。Fiordaliso等〔4〕在用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠糖尿病心肌病模型中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)伴隨細(xì)胞凋亡的增加而成倍上升。細(xì)胞色素C釋放是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵步驟〔5〕，Bax、Bcl-2的相互作用可誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的激活〔6〕。Cai等〔7〕研究顯示在大鼠糖尿病心肌病模型中伴隨心肌細(xì)胞的凋亡增多，線粒體細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的活性也增加，并且與在高糖環(huán)境中體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞得出的結(jié)論相一致。這說(shuō)明，線粒體細(xì)胞色素C調(diào)節(jié)caspase-3的激活參與了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí)細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3活化間存在著互相的正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制〔8〕，導(dǎo)致凋亡信號(hào)放大，細(xì)胞線粒體功能喪失和細(xì)胞死亡。

糖尿病狀態(tài)下，RAAS被激活，血漿及心肌局部的血管緊張素(Ang)Ⅱ合成增加，而有研究觀察到Ang-Ⅱ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡〔9〕。唐香等〔10〕研究表明通過(guò)降低糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平，可減少或抑制心肌線粒體ROS 的產(chǎn)生。已有研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動(dòng)劑T0901317可減輕由Ang-Ⅱ及LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這也揭示了LXRs與線粒體凋亡途徑的相關(guān)性。同時(shí)在高糖環(huán)境下，NF-κB信號(hào)通路也被激活〔11〕，NF-κB可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，而這些促炎癥因子可增強(qiáng)caspase 3的活性，刺激NF-κB的不斷活化，活化后的NF-κB可促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生〔12〕。乳鼠心肌細(xì)胞復(fù)制缺氧復(fù)氧模型中，外源性激活LXRs可通過(guò)抑制NF-κB活性，從而減輕心肌細(xì)胞炎癥及凋亡的產(chǎn)生〔13〕，提示NF-κB可能是線粒體凋亡途徑的上游信號(hào)分子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T0901317組與高糖組相比，Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平下降；Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高。而5CPPSS-50組Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平升高；Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，表明LXRs可通過(guò)線粒體的caspase依賴性凋亡途徑調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡。但LXRs能否通過(guò)線粒體的caspase非依賴性凋亡途徑調(diào)控高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

Liver X receptors regulating H9C2 cells apoptosis induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway

WANG Yun-Kai,TAO Jian，LI Wei-Yong,et al.

Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Hypertension Institute of Jiangxi,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the viability and apoptosis level of H9C2 cells induced by high glucose and investigate the effect of liver X receptors(LXRs)on the regulation of apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.MethodsH9C2 cells were used in the experiments and divided into:low glucose group(control group);D-mannitol group;high glucose group;high glucose +T0901317 group and high glucose +5CPPSS-50 group.The viability and the level of ROS in the H9C2 cells were measured.The mRNA expressions of Bax and Bcl-2 were detected by qRT-PCR.The protein level of cleaved caspase 3 was determined by Western blot.The apoptotic rates of H9C2 cells with different treatments were analyzed by cytometry with annexin V-FITC/PI double staining.ResultsOverexpressed LXRs significantly attenuated the mRNA expression of Bax induced by high glucose,cleaved caspase-3,cell viability and the ROS lever,and increased Bcl-2 expression and mitochondrial membrane potential inhibited by high glucose.ConclusionsT0901317 improves the cell viability and reduces the apoptotic rate of H9C2 cells induced by high glucose，while inhibits the LXRs damage effect more obvious in H9C2 cells induced by high glucose.LXRs can regulate apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.

【Key words】High glucose;LXRs;Apoptosis;Mitochondria-mediated pathway

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160117)

〔中圖分類號(hào)〕R329.24

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2324-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.006

1江西省腫瘤醫(yī)院

第一作者：王云開(kāi)(1963-),男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)和臨床研究。