波形蛋白的警報(bào)素功能鑒定①

陳　卓　夏　昶　余　蘭　艾　思　方　成

(武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室，武漢430023)

波形蛋白的警報(bào)素功能鑒定①

陳卓夏昶余蘭艾思方成

(武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室，武漢430023)

[摘要]目的：鑒定胞外可溶性波形蛋白(Vim)促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞增殖、活化、趨化的能力。方法：體外檢測Vim刺激大鼠脾細(xì)胞的增殖情況。體內(nèi)檢測Vim免疫小鼠的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)及Vim抗體水平。收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與不同濃度Vim共培養(yǎng)，檢測其對巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響。以Transwell小室法檢測Vim對NIH3T3成纖維細(xì)胞的趨化作用。結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)Vim劑量依賴性地促進(jìn)大鼠脾細(xì)胞增殖，16 μg/ml濃度的Vim刺激預(yù)致敏或未致敏脾細(xì)胞增殖率分別高達(dá)(196.0±9.7)%、(208.9±4.6)%，且該二者無顯著性差異。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)單用Vim免疫小鼠的外周血淋巴細(xì)胞濃度(109 L-1)激增(5.74±0.51 vs.1.69±0.13)，同時(shí)激發(fā)了Vim特異性抗體水平(OD值2.31±0.06 vs.0.19±0.08)；且與Vim輔以佐劑免疫小鼠的相應(yīng)指標(biāo)均無顯著性差異。體外實(shí)驗(yàn)Vim濃度依賴性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，并能夠?qū)IH3T3成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。結(jié)論：胞外可溶性Vim非特異性促進(jìn)炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞增殖、活化、趨化，具有警報(bào)素功能。

[關(guān)鍵詞]波形蛋白；增殖；活化；趨化；警報(bào)素

波形蛋白(Vimentin，Vim)為極度保守的真核細(xì)胞骨架Ⅲ型中間絲蛋白(IFs)，單體分子量約53 kD，常表達(dá)于中胚層起源的間充質(zhì)細(xì)胞，多以多聚體纖維形態(tài)在胞內(nèi)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)Vim參與細(xì)胞分化、遷移、介導(dǎo)感染和胞內(nèi)免疫等功能，并隨細(xì)胞凋亡而降解[1-5]。胞外Vim以胞膜外段、巨噬細(xì)胞分泌、細(xì)胞破裂后釋放等形式存在?？扇苄訧Fs約占總IFs的5%～10%，并與聚合態(tài)IFs在胞內(nèi)保持動態(tài)平衡[6]。有研究顯示Vim的Ⅱ號桿狀結(jié)構(gòu)域在胞膜表面具有識別N-乙酰葡糖胺的凝集素樣活性基團(tuán)[7]。活化的巨噬細(xì)胞能分泌Vim，TNF-α促進(jìn)分泌，IL-10則反之[8]。因細(xì)胞壞死釋放及巨噬細(xì)胞分泌的可溶性Vim，可與單核細(xì)胞非toll樣模式識別受體Dectin-1結(jié)合，通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與動脈粥樣硬化形成[9]。雖然Vim及其瓜氨酸修飾體的抗原性已普遍報(bào)道[10]，但胞外可溶性Vim的其他免疫功能尚有待揭示。本實(shí)驗(yàn)對Vim促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞增殖、活化、趨化的功能進(jìn)行鑒定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及試劑Lewis大鼠(北京維通利華公司，雄性12～15周齡，許可證號SCXK京2006-2009)，BALB/c小鼠(湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心，雌性6～8周齡，許可證號SCXK鄂2015-0018)，NIH3T3細(xì)胞(武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心)，Vim(Cytoskeleton公司)，Vim單抗(圣克魯斯生物)，HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(武漢博士德)，IL-8(Solarbio)，完全弗氏佐劑(CFA，Sigma)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基(Solarbio)，胎牛血清(杭州四季青)，酶標(biāo)板(Corning)，24/96孔板(Jet biofil)，Transwell小室(Corning)，CCK-8(碧云天生物)，瑞氏染液(Solarbio)。

1.1.2儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，全自動血細(xì)胞分析儀(Abbott公司)，高速冷凍離心機(jī)(日立GR21GⅢ)，酶標(biāo)儀(Tecan sunrise)，正置/倒置顯微鏡(重慶明光)。

1.2主要方法

1.2.1體外脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)近交系Lewis大鼠，體質(zhì)量220～250 g。致敏組(n=3)皮下注射含25 μg Vim的PBS溶液100 μl，2周后加強(qiáng)1次；未致敏組(n=3)僅注射PBS。1周后無菌收獲大鼠脾臟，將脾臟研磨通過200目不銹鋼濾網(wǎng)。裂解紅細(xì)胞后，有核細(xì)胞以PBS 清洗兩次，臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)，活細(xì)胞>95%。細(xì)胞重懸于10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液。將含5×103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液50 μl/孔接種于96孔板，每孔另加入含Vim的血清RPMI 1640培養(yǎng)液50 μl，使Vim終濃度分別為2-2、2-1、20、21、22、23、24μg/ml。另設(shè)不含Vim的空白對照，及僅加有100 μl培養(yǎng)液的本底調(diào)零孔，均設(shè)3復(fù)孔。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，即于酶標(biāo)儀上測定450nm波長的吸光度。細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)孔測定值-本底值)/(對照孔測定值-本底值)-1]×100%。

1.2.2外周血淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組每組6只BALB/c小鼠。Vim免疫組皮下注射含200 μg Vim的PBS溶液100 μl；(Vim+CFA)免疫組皮下注射前述Vim溶液與等體積CFA的混合液；陰性對照組皮下注射100 μl PBS溶液；2周后劑量減半強(qiáng)化免疫1次。第3周眶靜脈叢采血，肝素抗凝全血標(biāo)本以全自動血細(xì)胞分析儀檢測外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3外周血Vim抗體水平檢測另取上述實(shí)驗(yàn)小鼠部分抗凝全血標(biāo)本，離心取血漿，以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測Vim特異性抗體水平。酶標(biāo)板每孔加入100 μl Vim(5 μg/ml)PBS溶液包埋過夜，洗板并以1% BSA溶液150 μl封閉。洗板后加入各小鼠稀釋血漿樣本(1∶20)100 μl，另以加入100 μl PBS設(shè)為本底孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100 μl HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶4 000)，37℃孵育30 min后洗板；每孔加入100 μl TMB顯色10 min后終止，于酶標(biāo)儀上測定450nm波長的吸光度[11]。

1.2.4吞噬實(shí)驗(yàn)4只BALB/c小鼠每天1次連續(xù)3天腹腔注射6%淀粉肉湯1 ml，末次注射2 h后處死，以PBS液灌洗腹腔，合并灌洗液。1 500 r/min冷凍離心10 min，棄上清，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸至細(xì)胞數(shù)為2×106ml-1，每孔1 ml接種于24孔板。設(shè)4組Vim終濃度為10、20、40、80 μg/ml及空白組，每組3復(fù)孔。每孔加入1%雞紅細(xì)胞PBS液100 μl，混勻。5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)45 min，每5 min震板一次。每孔取100 μl溶液做細(xì)胞涂片，瑞氏染色后顯微鏡下每細(xì)胞涂片隨機(jī)觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5趨化實(shí)驗(yàn)Transwell小室置于24孔板中，在上室加入含NIH3T3細(xì)胞數(shù)為3×104的DMEM培養(yǎng)基200 μl。下室設(shè)陽性組和3個(gè)Vim濃度梯度組，即500 μl DMEM培養(yǎng)基含終濃度為100 ng/ml的IL-8或10、20、40 μg/ml的Vim，每組3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照組。5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。吸去上室細(xì)胞懸液，無菌棉簽拭去碳酸脂膜上室面細(xì)胞，下室面浸入4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色3 min，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔顯微鏡下(×200)隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)穿過膜入下室的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算趨化指數(shù)(Chemotactic index，CI)。CI=實(shí)驗(yàn)組下室細(xì)胞數(shù)/陰性對照組下室細(xì)胞數(shù)[12]。

2結(jié)果

2.1Vim對體外培養(yǎng)脾細(xì)胞的增殖作用(圖1C為濃度)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vim劑量依賴性(P<0.001)地刺激脾淋巴細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)中Vim最高濃度16 μg/ml刺激預(yù)致敏或未致敏脾細(xì)胞24 h的增殖率分別高達(dá)(196.0±9.7)%、(208.9±4.6)%，增殖數(shù)量提升接近于2倍。但Vim刺激預(yù)致敏或未致敏脾細(xì)胞的增殖率并無顯著性差異(P>0.05)。提示Vim具有非特異性強(qiáng)烈刺激脾細(xì)胞增殖的作用，胞外可溶性Vim具有固有免疫活化功能。

2.2Vim免疫小鼠的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)陰性對照組、Vim免疫組、(Vim+CFA)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)依次為(1.69±0.13)×109L-1、(5.74±0.51)×109L-1、(6.52±0.33)×109L-1(圖2)。對比陰性組與Vim免疫組、陰性組與(Vim+CFA)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)均具有極顯著性差異(P<0.001)，而Vim免疫組與(Vim+CFA)免疫組(5.74±0.51 vs.6.52±0.33，P>0.05)無顯著性差異。結(jié)果顯示皮下注射Vim促進(jìn)小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖，數(shù)量增加2倍以上。而單獨(dú)使用Vim免疫與(Vim+CFA)聯(lián)合免疫刺激外周血淋巴細(xì)胞增殖的效能無顯著性差異，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示Vim本身即具有強(qiáng)烈的非特異性免疫增強(qiáng)作用。

圖1　體外檢測Vim刺激脾細(xì)胞增殖作用Fig.1　Proliferation of splenocytes stimulated with Vim in vitro

圖2　免疫小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)Fig.2　Number of peripheral blood lymphocytes in immunized miceNote: *.P<0.001 compared with group PBS.

2.3Vim免疫小鼠的特異性抗體水平ELISA測定對照組、Vim免疫組、(Vim+CFA)免疫組抗體水平的OD值依次為0.19±0.08、2.31±0.06、2.82±0.03(圖3)，陰性組與Vim免疫組、陰性組與(Vim+CFA)免疫組的Vim抗體水平具有極顯著性差異(P<0.001)，而Vim免疫組與(Vim+CFA)免疫組(2.31±0.06 vs.2.82±0.03，P>0.05)無顯著性差異。提示單純Vim免疫即能夠產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫激活作用，CFA對Vim刺激并無顯著的非特異性免疫強(qiáng)化輔佐作用。

2.4吞噬實(shí)驗(yàn)鏡下依次觀察空白組和Vim濃度梯度組，隨著Vim濃度的增加巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力逐漸增強(qiáng)(圖4)。計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)(圖5)，10 μg/ml Vim組與空白組存在非常顯著差異(48.58±4.17 vs.26.65±4.35，P<0.01)，其余3組與空白組有極顯著差異(P<0.001)。提示Vim能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，其活化巨噬細(xì)胞的能力呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

圖3　免疫小鼠血漿Vim特異性抗體水平Fig.3　Vim-specific antibody levels in plasmas of immunized miceNote: *.P<0.001 compared with group PBS.

圖4　巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞形態(tài)(×200)Fig.4　Macrophage morphology of phagocytosing chicken erythrocytes(×200)

圖5　Vim對巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響Fig.5　Phagocytic rates and indexs of macrophages stimulated with VimNote: *.P<0.01 and **.P<0.001 compared with blank control group.

圖6　Vim對3T3細(xì)胞的趨化作用Fig.6　Chemotaxis of Vim effecting on 3T3 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01 and ***.P<0.001 compared with negative group.

2.5趨化實(shí)驗(yàn)檢測從Transwell上室通過碳酸脂膜微孔趨化到含Vim溶液下室的細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算趨化指數(shù)(圖6)?？梢园l(fā)現(xiàn)與趨化因子IL-8作用相似，Vim 10 μg/ml組與陰性組的趨化指數(shù)(CI)有顯著性差異(3.62±0.51 vs.1.00±0.34，P<0.05)，Vim 20 μg/ml、40 μg/ml組與陰性組的CI有非常顯著差異(P<0.01)。顯示Vim能夠?qū)IH3T3成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，并呈現(xiàn)出濃度依賴性。

3討論

自己成分的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)通過天然免疫細(xì)胞的模式識別受體(PRRs)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。在某些細(xì)胞內(nèi)正常存在，當(dāng)細(xì)胞受損或非程序性死亡時(shí)大量釋放的DAMPs稱為警報(bào)素(Alarmins)[14]。警報(bào)素在細(xì)胞內(nèi)外行使不同的功能，在細(xì)胞外通過與相應(yīng)PRRs結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用。具有促淋巴細(xì)胞活化與增殖的能力，并具有募集趨化能力，可行使增強(qiáng)機(jī)體免疫水平的類似佐劑的功能。較受關(guān)注的警報(bào)素有高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和IL-33[15,16]，另外還包括α-防御素(HNP1-4和HD5-6)和β-防御素(HBD1-4)、抗菌肽(CAP18)、嗜酸粒細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素(EDN)[17]。HMGB1在胞核普遍存在，可與Toll樣受體TLR2/4/9及糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合[18]。IL-33主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞及氣管上皮細(xì)胞，可與異源二聚受體ST2L/IL-1RAcP 結(jié)合，受體胞質(zhì)區(qū)的Toll-IL-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域募集MyD88、IRAK1和IRAK4，啟動TRAF6依賴的MAPK通路增強(qiáng)促炎因子的表達(dá)[19]。α-防御素儲存于中性粒細(xì)胞和小腸潘氏細(xì)胞的顆粒，β-防御素在角質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)，其中HBD2通過TLR4激活DC細(xì)胞。CAP18在中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的顆粒及上皮細(xì)胞中都有表達(dá)，其酶解片段LL-37通過受體FPRLl發(fā)揮募集單核細(xì)胞的作用，并經(jīng)MAPK信號通路活化巨噬細(xì)胞。EDN儲存在嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒中，通過TLR2來激活DC細(xì)胞。警報(bào)素作為與固有免疫關(guān)系密切的因素，可激發(fā)和促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是生物治療的新興靶點(diǎn)。

Vim作為保守的Ⅲ型中間絲蛋白，常存在于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)，在腎小球、腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也有豐富表達(dá)[20]。當(dāng)出現(xiàn)感染或損傷等因素時(shí)，Vim會隨著細(xì)胞的破損而暴露或釋放于胞外，參與固有免疫調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)Vim基因敲除小鼠的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的活性氧代謝物(ROS)增強(qiáng)殺菌能力；Vim通過與NADPH氧化酶的p47phox亞單位相互作用可抑制ROS的產(chǎn)生[4]。另一研究發(fā)現(xiàn)Vim是模式識別受體NOD2的協(xié)同蛋白，胞內(nèi)Vim具有協(xié)助NOD2介導(dǎo)的NF-κB通路活化的功能；病理狀態(tài)下，NOD2不能與Vim結(jié)合，導(dǎo)致NOD2介導(dǎo)的易感菌防御能力降低，促進(jìn)炎癥性腸病(CD)的發(fā)展[21]。最近有報(bào)道指出胞外Vim可與C型凝集素受體Dectin-1結(jié)合，可能通過活化巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成[9]。

本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胞外可溶性Vim均能夠非特異性強(qiáng)烈刺激淋巴細(xì)胞增殖，提升效率高達(dá)2倍，并能激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。單純Vim免疫即能夠產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫激活作用，而CFA的非特異性免疫增強(qiáng)作用對Vim刺激的輔佐作用有限。吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Vim能夠活化巨噬細(xì)胞的吞噬能力，趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Vim具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞趨化的功能，且均呈現(xiàn)濃度依賴性。綜上證實(shí)Vim具有警報(bào)素的功能特性，為深入探究Vim在免疫反應(yīng)、炎癥及慢性纖維化的交互過程中發(fā)揮的功能作用奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2016-03-08]

(編輯張曉舟)

Functional verification of vimentin as an alarmin

CHEN Zhuo,XIA Chang,YU Lan,AI Si,FANG Cheng.

Laboratory of Transplant Immunology,Wuhan Polytechnical University,Wuhan 430023,China

[Abstract]Objective:To identify the function of extracellular soluble vimentin that promotes proliferation,activation and chemotaxis of inflammatory cells.Methods: The proliferation of rat splenocytes stimulated with vimentin was evaluated in vitro.The lymphocyte counts and vimentin-antibody levels of peripheral blood in mice immunized with vimentin were detected in vivo.Peritoneal macrophages were collected and cultured with different concentrations of vimentin to detect the effect on phagocytosing chicken red blood cells.The chemotaxis of NIH3T3 fibroblast towards vimentin was observed in transwell chamber.Results: In vitro vimentin dose dependently promoted the proliferation of splenocytes.The proliferation indexes of primed and naive splenocytes cultured with 16 μg/ml vimentin were reached up to(196.0±9.7)% and(208.9±4.6)% respectively without significant difference.In vivo vimentin significantly enhanced the lymphocytes number(109 L-1)of peripheral blood(5.74±0.51 vs.1.69±0.13)and the levels of vimentin specific antibody(OD value 2.31±0.06 vs.0.19±0.08)that shown no significant difference from immunization with vimentin plus CFA.In vitro vimentin dose dependently stimulated phagocytic ability of macrophages and performed the chemotactic effects on NIH3T3 fibroblasts.Conclusion: Extracellular soluble vimentin promotes the proliferation,activation and chemotaxis of concerned inflammatory cells and possesses the functions as an alarmin.

[Key words]Vimentin;Proliferation;Activation;Chemotaxis;Alarmin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.006

作者簡介：陳卓(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫藥理學(xué)研究，E-mail:chenzhuoc@sina.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：方成(1972年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫生物學(xué)和免疫藥理學(xué)研究，E-mail:fang_cheng@foxmail.com。

中圖分類號R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0798-05

①本文受湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015CFC845)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370867)和武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2013CX021)資助。