濾泡輔助性T細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的作用①

平昌昀　李呼倫　詹曉霞　孫　博

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物教研室,哈爾濱150081)

濾泡輔助性T細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中的作用①

平昌昀李呼倫詹曉霞孫博

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物教研室,哈爾濱150081)

[摘要]目的：探討濾泡輔助性T細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用機(jī)制。方法：隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為CFA組、EAE組、anti-ICOSL組和control 組。用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)Tfh細(xì)胞的變化及T細(xì)胞的活化情況，石蠟切片染色觀察炎細(xì)胞浸潤、脫髓鞘及生發(fā)中心的改變，ELISA法檢測髓鞘蛋白特異性抗體的分泌水平。結(jié)果：anti-ICOSL治療組較EAE對照組臨床評分低(P<0.05)，炎癥浸潤減輕，無脫髓鞘病變,Tfh細(xì)胞比例降低，但活性不受影響，不能夠形成生發(fā)中心，并且髓鞘蛋白特異性抗體的分泌減少。結(jié)論：濾泡輔助性T細(xì)胞通過與B細(xì)胞的相互作用促進(jìn)生發(fā)中心形成，分泌抗神經(jīng)髓鞘蛋白MOG35-55特異性抗體發(fā)揮致病性作用。

[關(guān)鍵詞]濾泡輔助性T細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；生發(fā)中心

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是T細(xì)胞介導(dǎo)的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nerve system，CNS)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫性疾病[1-3],患者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀前的數(shù)周或數(shù)月，多有疲勞、體重減輕、肌肉和關(guān)節(jié)隱痛等。MS多次復(fù)發(fā)后,病人癥狀逐漸加重，出現(xiàn)無力、僵直、感覺障礙、視力損害和尿失禁[4]。各種非特異性免疫抑制治療不僅能夠引起副作用，如感染、腫瘤及骨髓抑制等，而且無法完全防止MS的復(fù)發(fā)[5]。因此，特異性MS的新療法仍是許多研究者努力的方向[6,7]。2000年，研究人員首次提出濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)為主要負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群，在刺激B細(xì)胞增殖、分化以及免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換中起著十分重要的作用[8-11]，但是Tfh細(xì)胞參與自身免疫性疾病的作用機(jī)制至今仍未被徹底地闡明和解釋。隨著研究的深入，越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，B細(xì)胞和自身抗體通過多種途徑影響著MS的發(fā)病和病程轉(zhuǎn)歸[12-15]。而作為輔助B細(xì)胞的Tfh細(xì)胞是通過輔助B細(xì)胞還是通過自身的致病性參與多發(fā)性硬化、在多發(fā)性硬化中Tfh細(xì)胞又是如何變化等問題目前仍是空白。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encelphalomyelitis，EAE)是目前應(yīng)用最廣泛的MS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，本研究通過EAE小鼠模型，探討Tfh在EAE中的作用機(jī)制，旨為臨床對MS的治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級C57BL/6小鼠，雌性，24只，6～8周齡，體重16～18 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2015-0001。對C57BL/6小鼠晝夜12 h 交替光照，自由食水，于室溫(20±2)℃條件下飼養(yǎng)。

1.1.2儀器和試劑本研究所用到的儀器為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國BD公司)，Digital Camera(日本HITACHI公司)，酶標(biāo)儀(澳大利亞Bio-Rad公司)。

本研究所用到的試劑為結(jié)核菌素(H37RA，美國DIFCO LABORATORIES)，不完全弗氏佐劑(IFA，美國Sigma)，MOG35-55(西安聯(lián)美生物科技有限公司)，百日咳毒素(PT，List biological laboratories,inc.)，ELISA抗體(美國BD公司)，anti-ICOSL抗體(由北京博奧森生物技術(shù)有限公司合成)，HE染色試劑(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，LFB染色試劑(杭州臨安金龍化工有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及EAE小鼠模型的建立隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為CFA組：注射完全弗氏佐劑(CFA,250 μg結(jié)核菌素+50 μl IFA+50 μl 0.01 mol/L PBS)；EAE組；anti-ICOSL組和control 組：均注射CFA和MOG35-55，每組6只。免疫試劑配好后，用漩渦振蕩器充分振蕩成均勻乳白色液體后，于小鼠兩側(cè)腋窩皮下進(jìn)行注射免疫。免疫當(dāng)天和免疫后的第2天，EAE組、control組和anti-ICOSL治療組小鼠尾靜脈注射百日咳毒素(PT)，200 ng/只；EAE建模的第2、4、6天，anti-ICOSL組小鼠腹腔注射anti-ICOSL抗體，100 μg/次；control 組小鼠腹腔注射與anti-ICOSL 抗體同等劑量的生理鹽水。臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常；0.5分：部分尾癱；1分：尾癱；1.5分：尾癱伴蹣跚步態(tài)；2分：一側(cè)后肢癱瘓；2.5分：一側(cè)后肢癱瘓伴另一側(cè)后肢無力；3分：雙后肢癱瘓；3.5分：上行性癱瘓；4分：軀干無力或癱瘓；4.5：瀕死；5分：死亡。

1.2.2T淋巴細(xì)胞的提取眼球取血處死發(fā)病早期、高峰期、緩解期EAE模型小鼠，無菌取小鼠腋窩、腹股溝、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)細(xì)胞和脾單核細(xì)胞。將淋巴結(jié)和脾單核細(xì)胞混合，以5×106個(gè)/ml細(xì)胞的濃度加入1640完全培養(yǎng)液，同時(shí)加入MOG35-55至終濃度為25 μg/ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將經(jīng)過MOG35-55肽段體外刺激所獲得的特異性增殖的淋巴細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)T淋巴細(xì)胞。

1.2.3T淋巴細(xì)胞活性及濾泡輔助性T細(xì)胞的檢測分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th細(xì)胞(主要為CD3+、CD44+及CD4+的細(xì)胞)活性和濾泡輔助性T細(xì)胞的表達(dá)(Tfh，主要為BCL-6-PE、CXCR5-PE、ICOS-PerCP)。于EAE免疫后3、5、8、15 d時(shí)分離淋巴結(jié)和脾，研磨過濾，制成淋巴細(xì)胞懸液，加入MOG(25 μg/ml)抗原刺激細(xì)胞后，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。Tfh細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD4+ICOS+CXCR5+[16]。

1.2.4組織病理學(xué)檢測于發(fā)病高峰期(第15天)取小鼠脊髓腰骶段，制成石蠟切片，用5 μm厚度的組織切片進(jìn)行HE染色[17]、8 μm厚度的組織切片進(jìn)行LFB染色[17]，高倍顯微鏡觀察病理改變。取發(fā)病高峰期(第15天)小鼠脾臟，制作冰凍切片，用6 μm 厚度的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色[18]，高倍顯微鏡觀察脾組織中生發(fā)中心的形成。

1.2.5血清IgG抗體分泌水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)法[19]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)中任意兩獨(dú)立樣本之間的比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析法(One-way classification，ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1EAE小鼠模型的建立試驗(yàn)結(jié)果顯示，EAE組小鼠從免疫后第10天開始出現(xiàn)臨床癥狀，于免疫后第15天左右達(dá)到發(fā)病高峰期，免疫后第21天開始緩解。EAE組發(fā)病小鼠的臨床評分為0.5～3.0分，第11天EAE組評分明顯高于CFA組(P<0.05)；EAE組在第11天開始出現(xiàn)明顯的、逐漸加重的臨床癥狀：尾部無力、蹣跚步態(tài)、單后肢至雙后肢癱瘓，嚴(yán)重者出現(xiàn)前肢癱瘓；第12、13、14、15天EAE組小鼠EAE評分均高于CFA組(P<0.001)。對照組在相同時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)上述臨床癥狀，活動(dòng)正常，見圖1。

免疫后第15天，進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)與CFA組相比， EAE組脊髓白質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(單核-巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞等)， LFB染色可以觀察到EAE組脊髓有明顯的脫髓鞘病灶，病灶中髓鞘變性崩解成顆粒狀，并被吞噬細(xì)胞吞噬，形成泡沫細(xì)胞，表明小鼠EAE模型建立成功。見圖2。

2.2濾泡輔助性T細(xì)胞在淋巴結(jié)和脾中的變化情況結(jié)果表明：免疫后第5天，淋巴結(jié)中的CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細(xì)胞增多，且Tfh數(shù)量達(dá)到高峰；EAE組和CFA組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。第8天，Tfh細(xì)胞在EAE組所占百分比明顯高于CFA組(P<0.001)；第15天，Tfh細(xì)胞在EAE組所占百分比有所下降，但仍高于對應(yīng)CFA組，見圖3A。免疫后第3、5、8、15天，EAE組小鼠脾中的Tfh細(xì)胞數(shù)量均高于CFA組，且在第5天時(shí)表達(dá)最高，與CFA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3B。

2.3選擇性濾泡輔助性T細(xì)胞阻斷劑anti-ICOSL IgG的治療結(jié)果

圖1　EAE臨床評分及體重變化Fig.1　Clinical scores and weights of EAENote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2　脊髓組織HE染色及LFB染色(×200)Fig.2　HE staining and LFB staining of spinal cord(×200)Note: A and B are EAE group:A shows HE staining,in which arrow indicates inflammatory cell infiltration；B shows LFB staining,in which arrows indicate demyelination；C and D are CFA group:C shows HE staining and D shows LFB staining.

2.3.1臨床評分和體重實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予選擇性濾泡輔助性T細(xì)胞阻斷劑能夠緩解EAE疾病的進(jìn)程。EAE組實(shí)驗(yàn)鼠在免疫后的第10天開始發(fā)病，且隨時(shí)間延長，病情逐漸加重，約至實(shí)驗(yàn)的第15天達(dá)到高峰，隨后緩解。anti-ICOSL組實(shí)驗(yàn)鼠第11天開始發(fā)病，隨后以較輕的病情持續(xù)12天后緩解。EAE組實(shí)驗(yàn)鼠第13～17天臨床評分與給藥組實(shí)驗(yàn)鼠相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。給藥組實(shí)驗(yàn)鼠在發(fā)病期間體重平均維持在約16 g；在第14～17天，EAE組實(shí)驗(yàn)鼠體重下降較給藥組明顯，見圖4。

2.3.2實(shí)驗(yàn)鼠脊髓脫髓鞘和淋巴細(xì)胞浸潤情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EAE組小鼠脊髓組織中可見明顯的、多發(fā)且散在的炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘，anti-ICOSL治療組小鼠脊髓組織中少見明顯的炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘，CFA組小鼠脊髓組織中未見有炎性細(xì)胞浸潤和脊髓脫髓鞘發(fā)生。表明濾泡輔助性T細(xì)胞選擇性抑制劑anti-ICOSL 治療可以減輕疾病，見圖5。

圖3　濾泡輔助性T細(xì)胞在C57BL/6小鼠淋巴結(jié)(A)和脾(B)中的表達(dá)Fig.3　Expression of T follicular cells on lymph nodes(A) and spleen(B)Note: *.P<0.001.

2.3.3濾泡輔助性T細(xì)胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL對T細(xì)胞活化影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，anti-ICOSL組和EAE組相比，CD44高表達(dá)的CD3+T細(xì)胞數(shù)目無差異，說明T細(xì)胞活化不受anti-ICOSL的影響；在免疫5 d后，無論是anti-ICOSL組還是EAE組淋巴結(jié)CD44高表達(dá)的CD3+T細(xì)胞數(shù)目都顯著增加(見圖6)，說明免疫5 d后淋巴結(jié)T細(xì)胞參與到免疫反應(yīng)中。

2.3.4濾泡輔助性T細(xì)胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL對ICOS高表達(dá)的CD4+CXCR5-T細(xì)胞數(shù)目影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EAE組和anti-ICOSL組淋巴結(jié)及脾中ICOS高表達(dá)的CD4+CXCR5-T細(xì)胞數(shù)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。說明anti-ICOSL治療未抑制ICOS分子在T細(xì)胞上的表達(dá)。

圖4　anti-ICOSL 治療的臨床評分及體重變化Fig.4　Clinical scores and weight of therapy by anti-ICOSLNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖5　脊髓組織LFB染色(ACE)及HE(BDF)染色(×200)Fig.5　LFB staining(ACE) and HE staining(BDF) of spinal cord(×200)

2.3.5濾泡輔助性T細(xì)胞選擇性阻斷劑anti-ICOSL 對Tfh細(xì)胞數(shù)量的影響結(jié)果表明：在給予選擇性阻斷劑anti-ICOSL后，小鼠CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細(xì)胞水平表達(dá)下降；anti-ICOSL組與EAE組相比，各時(shí)間點(diǎn)的小鼠淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞表達(dá)水平均下降；至第8天，EAE組小鼠的Tfh細(xì)胞所占百分比明顯高于anti-ICOSL組(P<0.01)，見圖8A。anti-ICOSL組小鼠脾中的Tfh細(xì)胞百分比較EAE組均有所下降，見圖8B。

2.3.6濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)減少對生發(fā)中心形成的影響結(jié)果表明，至第8天，EAE組脾組織中可以看到完整的次級濾泡的形態(tài)，略呈圓形，次級濾泡中可見散在的PNA陽性細(xì)胞分布。在CFA組中未見次級濾泡形態(tài)，在anti-ICOSL組中僅可見完整的次級濾泡形態(tài)，未見PNA陽性細(xì)胞。至第15天，EAE組小鼠脾組織次級濾泡中可見成簇的PNA陽性細(xì)胞聚集，表明此時(shí)成熟的生發(fā)中心已經(jīng)形成；CFA組和anti-ICOSL組中仍未見PNA陽性細(xì)胞，見圖9。

圖6　anti-ICOSL對淋巴結(jié)和脾中T細(xì)胞活化的影響Fig.6　Influence of anti-ICOSL IgG on activation of T cells in lymph nodes and spleen

圖7　anti-ICOSL對淋巴結(jié)和脾中ICOS高表達(dá)CD4+CXCR5- T細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.7　Influence of anti-ICOSL IgG on number of CD4+CXCR5- T cells with high ICOS expression in lymph nodes and spleen

圖8　anti-ICOSL對濾泡輔助性T細(xì)胞在淋巴結(jié)(A)和脾(B)中表達(dá)的影響Fig.8　Influence of anti-ICOSL IgG on expression of Tfh cells in lymph nodes(A) and spleen(B)Note: *.P<0.01.

圖9　濾泡輔助性T細(xì)胞減少對生發(fā)中心形成的影響Fig.9　Influence of decreased Tfh cells on germinal centreNote: A，D.EAE;B,E.Anti-ICOSL group；C，F(xiàn).CFA group.A，B，C.×40；D，E,F.×200；Arrows indicate PNA positive cells.

圖10　濾泡輔助性T細(xì)胞減少對髓鞘蛋白特異性抗體分泌的影響Fig.10　Influence of decreased T follicular helper cells on MOG-specific AbsNote: *.P<0.01；**.P<0.001.

2.3.7濾泡輔助性T細(xì)胞減少對髓鞘蛋白特異性抗體分泌的影響結(jié)果顯示，anti-ICOSL組各抗體分泌水平較EAE組低(IgG2a，P<0.001；IgG2b，P<0.001； IgG1，P<0.001)；anti-ICOSL組各抗體分泌水平較CFA組高(IgG2a，P<0.01； IgG1,P<0.01)。隨著TFH細(xì)胞減少，髓鞘蛋白特異性抗體分泌水平也相應(yīng)降低，見圖10。

3討論

MS一直被認(rèn)為是由CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的自身免疫性疾病，在遺傳或者感染等因素的作用下，CD4+T細(xì)胞被刺激活化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原特異性Th1、Th17細(xì)胞，并分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-21、IL-22等致炎性細(xì)胞因子引起一系列炎癥反應(yīng)引起MS的發(fā)生[3]。此外，有實(shí)驗(yàn)表明MS與B細(xì)胞也有著密切的關(guān)系。中樞神經(jīng)系統(tǒng)包含多種B細(xì)胞營養(yǎng)因子，如BAFF(B-cell-activating factor of the TNF family)、APRIL(A proliferation-inducing ligand)以及漿細(xì)胞存活因子CXCL12，為B細(xì)胞發(fā)育提供了良好的微環(huán)境[20]。在多發(fā)性硬化患者的腦和腦脊液中B細(xì)胞增殖并分泌IgG[21]，同時(shí)B細(xì)胞作為專職抗原提呈細(xì)胞將抗原提呈給T細(xì)胞[22]。

濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)，定位于淋巴濾泡，表型為CXCR5+CD40L+ICOS+，主要通過分泌IL-21輔助B細(xì)胞產(chǎn)生對T細(xì)胞依賴抗原應(yīng)答[23]。Tfh已被證實(shí)了在許多免疫缺陷病和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[16,24]。眾所周知，自身免疫紊亂主要和高親和力致病性抗體的產(chǎn)生息息相關(guān)。lupus疾病模型中，錯(cuò)誤的Tfh細(xì)胞的擴(kuò)增，可以導(dǎo)致自身抗體分泌增加[25]。在Roquin san/san 轉(zhuǎn)基因鼠中發(fā)現(xiàn)過多的Tfh細(xì)胞表達(dá)，使生發(fā)中心的反應(yīng)增強(qiáng)，利用分離出來的Tfh細(xì)胞回輸給正常的野生型鼠，會(huì)自發(fā)性形成生發(fā)中心。在SLE模型鼠中，阻斷ICOSL-ICOS 信號通路可以通過減少Tfh細(xì)胞，從而減弱生發(fā)中心的反應(yīng)，從而抑制疾病發(fā)生[26]。

Tfh細(xì)胞是輔助B細(xì)胞發(fā)揮體液免疫作用的主要效應(yīng)性T細(xì)胞。這種輔助作用可以分為四個(gè)階段。①攜帶特異性抗原的樹突狀細(xì)胞將抗原提呈給初始T細(xì)胞，使之分化為效應(yīng)性Tfh細(xì)胞；②效應(yīng)性Tfh細(xì)胞遷移到濾泡T-B細(xì)胞邊界與抗原預(yù)激的B細(xì)胞相互接觸；③經(jīng)識別共同抗原的B細(xì)胞接觸后，一部分效應(yīng)性Tfh細(xì)胞遷移進(jìn)入生發(fā)中心，調(diào)節(jié)抗原特異性記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生；④另一部分記憶性Tfh細(xì)胞將持續(xù)存在于初始活化的微環(huán)境中調(diào)節(jié)抗原特異性記憶B細(xì)胞對再次抗原免疫的應(yīng)答[27]?？乖c受體的結(jié)合程度，T-B細(xì)胞間接觸的持久性，識別共同抗原的T-B細(xì)胞上信號分子的相互作用等影響因素始終貫穿始終。Tfh細(xì)胞的形成與維持和以下信號通路有關(guān)：T細(xì)胞活化的第二信號CD28和B7(即CD80/CD86)，CD4+CD3-淋巴組織刺激細(xì)胞表達(dá)的OX40L和CD30L提供的刺激信號，T-B細(xì)胞接觸并相互作用的雙重信號刺激CD40/CD40L，ICOS/ICOSL，表面信號淋巴細(xì)胞激活分子相關(guān)蛋白(SLAM-associated protein，SAP)介導(dǎo)的信號通路[28]。上述作用最終都直接或間接引起B(yǎng)cl-6的表達(dá)，而Bcl-6轉(zhuǎn)錄因子，對于T細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CXCR5，活化T細(xì)胞遷移進(jìn)入淋巴濾泡以及GC的形成都具有重要作用[29]。

我們在前期工作中利用RT-PCR以及Western blot的方法檢測了Tfh細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6在外周淋巴器官脾和淋巴結(jié)的表達(dá)情況，結(jié)果Bcl-6在EAE發(fā)病的起始期表達(dá)有所增高。我們把檢測的時(shí)間點(diǎn)集中在免疫后第3、5、8、15天，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Tfh細(xì)胞的表面標(biāo)志，結(jié)果顯示，Tfh細(xì)胞參與了EAE的疾病發(fā)生，并且在免疫后的初始期，即第5天時(shí)表達(dá)明顯增高，與CFA組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高峰期即免疫后15 d表達(dá)略有下降。

由于Tfh細(xì)胞在EAE中表達(dá)主要集中在發(fā)病起始期，我們提出用阻斷劑選擇性抑制Tfh細(xì)胞能否通過抑制Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，進(jìn)而緩解EAE的發(fā)病癥狀而起到治療作用這樣一個(gè)疑問。Tfh細(xì)胞的分化要求與B細(xì)胞相互作用得以維持，在這個(gè)過程中參與的關(guān)鍵信號通路是ICOS-ICOSL共刺激分子信號[30]。ICOS廣泛表達(dá)于活化的效應(yīng)性T細(xì)胞上，而ICOSL是B細(xì)胞組成性表達(dá)的表面分子。因此我們在免疫早期隔日給予anti-ICOSL封閉B細(xì)胞上的ICOSL分子，試圖通過阻斷ICOS-ICOSL的信號通路，抑制Tfh細(xì)胞的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)顯示，給予anti-ICOSL選擇性封閉性抗體后，該組小鼠的發(fā)病減輕，高峰期中樞炎性細(xì)胞浸潤減少，脫髓鞘損傷減輕。然而，整體T細(xì)胞在免疫早期及高峰期的活化程度不受影響，CD44高表達(dá)的CD3+T細(xì)胞百分比在各組間沒有差異。原因是初始T細(xì)胞主要被樹突狀細(xì)胞活化，活化后的T細(xì)胞與識別共同抗原的活化B細(xì)胞間的相互作用中，存在其他信號通路如CD80/86-CD28、CD40-CD40L等信號通路代償了被阻斷的ICOS-ICOSL信號通路的作用。因此，給予anti-ICOSL抗體后并沒有影響ICOS在活化T細(xì)胞上的表達(dá)，具有分泌致炎性細(xì)胞因子的ICOS高表達(dá)CD4+CXCR5-細(xì)胞數(shù)量也沒有減少。流式結(jié)果顯示，在發(fā)病起始期Tfh細(xì)胞在anti-ICOSL組的數(shù)量較EAE組下降，這種趨勢在淋巴結(jié)中更為明顯。由于Tfh細(xì)胞的錯(cuò)誤擴(kuò)增與體內(nèi)高水平自身抗體密切相關(guān)[25]，那么Tfh細(xì)胞減少是否意味著自身抗體水平降低呢？我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在EAE組免疫第8天時(shí)脾中生發(fā)中心已經(jīng)開始形成，第15天時(shí)可檢測到完整的生發(fā)中心，同時(shí)血清中可檢測到高水平的抗體滴度。在anti-ICOSL組免疫第15天時(shí)仍未見有明顯的生發(fā)中心形成，血清中僅可檢測到低水平的自身抗體。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tfh細(xì)胞參與了EAE的發(fā)病過程，anti-ICOSL可以通過選擇性抑制Tfh細(xì)胞的B細(xì)胞輔助作用，抑制生發(fā)中心的形成和自身抗體的分泌，從而能夠有效緩解EAE的臨床表現(xiàn)。

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[收稿2016-02-03修回2016-04-14]

(編輯張曉舟)

Mechanism of T follicular cells in experimental autoimmune encephalomyelitis

PING Chang-Yun,LI Hu-Lun，ZHAN Xiao-Xia,SUN Bo.

Department of Neurobiology,Harbin Medical University,Harbin 150081，China

[Abstract]Objective:To evaluate the mechanism of T follicular helper cells (Tfh) in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) via in vivo experiments.Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into four groups,CFA group，EAE group，anti-ICOSL group and control group.Lymphocytes of different time points isolated from draining lymph nodes and spleen were stained for T follicular helper cells surface marker and T cells activation surface marker and analyzed by FACS.Observed parameters include inflammatory infiltration,demyelination in spinal cord and germinal center in spleen.ELISA was used to measure the level of antigen specific antibodies.Results: Mice in anti-ICOSL treated group developed mild disease was with lower clinical scores when compared with the EAE group.HE staining results turned out with alleviated inflammation and Luxol Fast Blue staining(LFB) showed no demyelization in anti-ICOSL treated mice compared with non-treated EAE models.Flow cytometry results revealed that percentages of T follicular helper cells decreased though the whole activated degree T cells was not influenced in anti-ICOSL treated group.Fewer ger minal center was found in both anti-ICOSL group and CFA group with reduced secretion of MOG-specific Ab.Conclusion: T follicular helper cells supported the development of cognate B cells,promoted the formation of germinal center,facilitate pathogenic MOG-specific Ab secretion,thus enhance EAE.

[Key words]T follicular helper cells(Tfh);Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE);Germinal center(GC)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.004

作者簡介：平昌昀(1990年-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主要參與多發(fā)性硬化及其動(dòng)物模型的研究，E-mail：pingchangyunhmu@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：孫博(1979年)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)免疫學(xué)的研究，E-mail：sunbo720@aliyun.com。

中圖分類號Q189

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0787-07

①本文受國家自然科學(xué)基金(81571168；81430035)資助。