信陽(yáng)市斑點(diǎn)叉尾鮰爆發(fā)性疾病病原的分離鑒定

林偉(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南信陽(yáng)464000)

信陽(yáng)市斑點(diǎn)叉尾鮰爆發(fā)性疾病病原的分離鑒定

林偉(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南信陽(yáng)464000)

通過對(duì)患病斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)信陽(yáng)市某養(yǎng)殖場(chǎng)的斑點(diǎn)叉尾鮰爆發(fā)性疾病病原為維氏氣單胞菌，菌株對(duì)慶大霉素、美福仙和卡那霉素敏感，對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等9種藥物不敏感。

斑點(diǎn)叉尾鮰；維氏氣單胞菌；爆發(fā)性；致病菌

斑點(diǎn)叉尾鮰，屬于鯰形目科，原產(chǎn)美國(guó)，是美國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖和食用魚類。肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有很好的降血脂、健腦益智、補(bǔ)腎明目、減肥抗衰老、增強(qiáng)免疫力功能。生長(zhǎng)快，易捕撈，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益高，深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的喜愛，斑點(diǎn)叉尾鮰成魚抗病力強(qiáng)，較少患病，但苗種階段易感染細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲類疾病及其它并發(fā)癥[1]，導(dǎo)致大量死亡，每年給斑點(diǎn)叉尾鮰殖戶造成巨大損失。

2014年7月，河南省信陽(yáng)市某養(yǎng)殖戶水泥培育池一批孵化出膜6-7d的斑點(diǎn)叉尾鮰稚魚出現(xiàn)爆發(fā)性死亡。對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行檢測(cè)，水質(zhì)并無(wú)異常?；疾“唿c(diǎn)叉尾鮰主要癥狀為不攝食、頭部出血、腹部腫脹有腹水、肝臟出血。同時(shí)，該養(yǎng)殖場(chǎng)稍大規(guī)格魚苗也出現(xiàn)類似癥狀，但死亡率較這批小規(guī)格魚苗低。由于發(fā)病快、死亡率高，造成很大損失。本研究對(duì)發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰稚魚進(jìn)行常規(guī)臨床診斷、細(xì)菌分離鑒定、動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)、藥物敏感性試驗(yàn)等一系列方法，確定此次爆發(fā)性死亡的斑點(diǎn)叉尾鮰稚魚病原為維氏氣單胞菌，為科學(xué)防治斑點(diǎn)叉尾鮰魚種培養(yǎng)期爆發(fā)性疾病提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

患病斑點(diǎn)叉尾鮰稚魚于2014年7月27日采自信陽(yáng)市某養(yǎng)殖戶水泥培育池，體長(zhǎng)12-25mm。健康斑點(diǎn)叉尾鮰體重為(120±5)g，購(gòu)自河南省信陽(yáng)市水產(chǎn)品貿(mào)易市場(chǎng)。普通肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、LB平板、LB肉湯、MH肉湯、鮮血平板等按常規(guī)方法制備。標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙和微量生化試管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 臨床診斷

觀察病魚體表癥狀，在解剖顯微鏡下觀察送檢魚的體表及內(nèi)臟器官，拍照記錄。

1.3 病原菌分離鑒定

選取有明顯發(fā)病癥狀的病魚，無(wú)菌條件下在解剖顯微鏡下進(jìn)行操作：送檢魚體表消毒后用手術(shù)剪將頭部和軀干部分離，使用解剖針將鰓和腸道去掉；用滅菌生理鹽水分別清洗頭部和軀干部，再用75%酒精浸泡30s；用鑷子將頭部、軀干部分別放入加有適量滅菌生理鹽水的滅菌離心管中，將組織勻漿后2000r／min離心2min，取上清液涂布接種至LB平板置28℃培養(yǎng)24h。

挑取優(yōu)勢(shì)菌單菌落接種至LB平板，28℃培養(yǎng)24h后以革蘭氏染色法檢驗(yàn)菌落純度，純化后的細(xì)菌石蠟封存于LB斜面，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取單菌落，劃線接種于LB瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，使用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，并拍照記錄。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行病原菌相關(guān)生理生化鑒定。

1.4 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)

試驗(yàn)方法參照房海等和Wise等的方法[2-3]進(jìn)行，用接種環(huán)挑取已純化菌株，接種于LB肉湯中，28℃振蕩培養(yǎng)24h，菌液用滅菌生理鹽水稀釋至7.0× 107cfu/mL。將健康的斑點(diǎn)叉尾鮰分為3組，每組5尾，其中1組作為對(duì)照組，飼養(yǎng)1周無(wú)異常后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組腹腔注射菌液，劑量為0.3mL／尾，注射兩組，對(duì)照組每尾腹腔注射等量的滅菌生理鹽水，注射后飼養(yǎng)于水溫約25℃的水族箱，試驗(yàn)期間連續(xù)曝氣，觀察7d，每天記錄試驗(yàn)魚癥狀和死亡數(shù)，并進(jìn)行死魚的細(xì)菌分離鑒定。

1.5 細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)

采用Kirby—Bauer紙片法對(duì)常用藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)參照管遠(yuǎn)志[4]等的方法進(jìn)行。用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，并根據(jù)CLSI相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

部分斑點(diǎn)叉尾鮰在水中游動(dòng)失衡，少量在水中串游或者掙扎狀游動(dòng)；部分病魚可見尾鰭及其它鰭條末端發(fā)白、缺損。病魚內(nèi)臟器官發(fā)紅、出血，腹部膨大、有腹水，頭部有出血現(xiàn)象，腸道未見有明顯變化。2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

分離的兩株細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，近似橢圓狀，菌落邊緣整齊，表面光滑，乳白色，呈半透明，菌落直徑0.6-3mm。

2.2.2 病原菌生理生化鑒定結(jié)果

用生化鑒定管測(cè)定分離菌株的生化特性，結(jié)果顯示：氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性；精氨酸雙水解酶、乙酰胺酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性；西蒙氏枸櫞酸鹽、七葉苷、吲哚陽(yáng)性；氰化鉀、肌醇、水楊素、丙二酸鹽、衛(wèi)茅醇陰性；產(chǎn)甘露糖、半乳糖和麥芽糖；不產(chǎn)蔗糖、果糖、鼠李糖和硫化氫。根據(jù)該結(jié)果在《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中查找，發(fā)現(xiàn)與維氏氣單胞菌生化特性較為一致，初步斷定分離菌株為維氏氣單胞菌。

2.2.3 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

人工感染后連續(xù)觀察7d，分離菌死亡率達(dá)90%，發(fā)病魚表現(xiàn)出與自然發(fā)病相似癥狀，主要為鰭條基部充血，鰭條末端腐爛，體表出血，腹部腫大，有腹水，肝臟腫大充血。對(duì)病魚無(wú)菌操作分離得到優(yōu)勢(shì)菌落，經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定為維氏氣單胞菌，可確定維氏氣單胞菌為致病菌。

2.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

分離的維氏氣單胞菌對(duì)常見12種抗生素的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表1，試驗(yàn)結(jié)果顯示，所分離菌株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、美福仙敏感、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氟哌酸等9種藥物耐藥。

表1 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

隨著斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，密度的提高以及藥物的濫用，疾病的發(fā)生也越來越多，制約斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究在病魚身上分離出了致病性的維氏氣單胞菌，表明這批稚魚感染了維氏氣單胞菌。維氏氣單胞菌是一種人畜共患條件致病菌，并能感染多種魚類，包括羅非魚、日本鰻鱺、南方大口鯰等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。12種常用藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離出的菌株對(duì)慶大霉素、卡那霉素和美福仙敏感，可以采用內(nèi)服敏感藥物，同時(shí)外用消毒藥物相結(jié)合的方法進(jìn)行治療，但對(duì)鏈霉素、氟哌酸、四環(huán)素等耐藥。為確保養(yǎng)殖水產(chǎn)品的食品安全，我國(guó)將紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、桿菌肽鋅和泰樂菌素等抗生素列為水產(chǎn)違禁藥品 (中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5071—2002)。因此要有針對(duì)性的使用敏感藥物進(jìn)行維氏氣單胞菌感染的防治，也要嚴(yán)格遵守有關(guān)食品安全法規(guī)。

此次斑點(diǎn)叉尾鮰稚魚爆發(fā)性死亡率高，病程短，未能及時(shí)得出致病階段的環(huán)境因子作用、致病病原詳細(xì)的生物特性，及致病菌潛伏期和爆發(fā)期的監(jiān)測(cè)。因此維氏氣單胞菌物理、生物特性及與環(huán)境變化的關(guān)系有待進(jìn)一步研究，以期為維氏氣單胞菌引起的魚病防治提供參考依據(jù)。

[1]夏春.水產(chǎn)動(dòng)物疾病學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2004:102-103.

[2]房海,陳翠珍,張曉君.水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2010:147-150.

[3]Wise J A,Harrell S F,Busch R L,et a1.Vertical transm -ission of channel catfish virus[J].Am J Vet Res,1988, 49(9):1506-1509.

[4]管遠(yuǎn)志,王艾琳,李堅(jiān).醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:111.

[5]黎炯,葉星,盧邁新,等.羅非魚維氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2011,32(3): 132-136.

[6]楊求華,郭松林,關(guān)瑞章,等.鰻鱺病原性維氏氣單胞菌的分離與鑒定[J].生物技術(shù)通報(bào),2012,28(7): 134-139.

Isolation and identification of pathogenic bacteriumAeromonas veronii from channel catfish(Letalurus punetaus)in Xinyang City

Lin Wei

(Fisheries Science Department,Xinyang College of Agriculture and forestry,Xinyang 464000,Henan,China)

Isolation ofAeromonas veroniiwas isolated from affected channel catfish in Xinyang City during an outbreak in 2014.According to the morphology,biochemistry and agglutination test,the strain was identified to be kanamycin.By sensitivity testing to antibiotics,the results showed that itwas hypersensitive to gentamicin, kanamycin,mefoxin,but resistant to 9 antibiotics including doxycycline and tetracycline.

channel catfish;Aeromonas veronii;paroxysmal;pathogenicity

河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（S-2014-10-G01）

林偉（1980-），男，漢族，講師，碩士，研究方向?yàn)轸~類養(yǎng)殖、觀賞魚業(yè)、魚病防治，E-mail:linwei0924@sohu.com