柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠鈉通道穩(wěn)態(tài)失活及再恢復的影響*

盛望　劉侃　王瑾茜　袁華　劉建和△（.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南　長沙　40007；.湖南中醫(yī)藥大學，湖南　長沙　4008）

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柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠鈉通道穩(wěn)態(tài)失活及再恢復的影響*

盛望1劉侃2王瑾茜2袁華1劉建和1△
（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

【摘要】目的觀察柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心室肌細胞膜鈉通道電流及鈉通道穩(wěn)態(tài)失活及再恢復的影響，尋求該藥治療心律失常的分子細胞學機制。方法將所有大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、胺碘酮組各10只，建立缺血性心律失常動物模型，酶解法分離心室肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄各組鈉通道電流（INa）的變化。結(jié)果各組細胞I～V曲線均在-70 mV時激活，-20 mV時出現(xiàn)峰值，+40 mV出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，組間比較，以胺碘酮組和中藥高劑量組I～V曲線較低；各組INa峰值比較，中藥高劑量組和胺碘酮組均較模型組明顯下降（P＜0.01），兩組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。中藥高劑量組和胺碘酮組INa穩(wěn)態(tài)失活曲線較模型組有明顯左移趨勢；各組INa半數(shù)失活電壓V0.5比較，中藥高劑量組和胺碘酮組較模型組明顯降低（P＜0.01），兩組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。中藥高劑量組和胺碘酮組INa滅活后再恢復曲線較模型組有明顯下移趨勢；各組在時間間隔為45、95、145 ms時INa恢復程度比較，中藥高劑量組和胺碘酮組較模型組明顯降低（P＜0.01），兩組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論柴胡三參膠囊能夠結(jié)合鈉通道失活態(tài)并對其產(chǎn)生抑制作用，延緩鈉通道失活后再恢復，這可能是其抗心律失常的機制之一。

【關(guān)鍵詞】缺血性心律失常柴胡三參膠囊鈉通道膜片鉗

心律失常是常見心血管疾病之一，各種類型的心律失常，尤其室性心動過速、心房顫動等惡性心律失常，不但可加重原有心臟疾患，還可誘發(fā)心源性猝死［1］。當前臨床對本病治療主要以口服藥物為主，但各類抗心律失常藥物均有導致心律失常的風險，甚至增加患者死亡率；而介入治療或者射頻消融等外科治療方式創(chuàng)傷大且價格昂貴，難以切合患者實際需求［2］。因此，尋求一種針對本病、副作用少、經(jīng)濟有效的治療藥物具有重要的醫(yī)學及社會意義。研究顯示，中醫(yī)藥治療心律失常具有療效確切、效果穩(wěn)定、不良反應較少等優(yōu)勢，有望為本病治療開辟新的途徑。前期研究證明，柴胡三參膠囊可通過Ca2+拮抗等機制產(chǎn)生對心律失常大鼠模型的保護作用，且無明顯毒副作用［3-4］。本研究擬通過酶消化法分離大鼠左心室肌細胞，采用膜片鉗技術(shù)，觀察柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心室肌細胞膜鈉通道電流（INa）、通道穩(wěn)態(tài)失活及再恢復的影響，尋求該藥治療心律失常的分子細胞學機制?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物成年Wistar大鼠50只，雌雄不拘，SPF級，體質(zhì)量150～200 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號:4304700472。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號: SYXK（湘）2009-0001。

1.2藥物與試劑柴胡三參膠囊，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科制備，規(guī)格:0.4 g/片，批號: 681210；鹽酸胺碘酮片，規(guī)格:200mg/片，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn)，批號:國藥準字H19993254。無鈣臺氏液（mmol/L）:NaCl 140、NaHCO311.9、KCl 25.4、MgCl20.53、NaHPO40.33、HEPES 5.0、Glucose 10，NaOH調(diào)pH為7.3；酶液:無鈣臺氏液中加入Ⅰ型膠原酶至0.4 g/L、牛血清白蛋白至2 g/L；KB液（mmol/L）:KOH 70、KCl 40、KH2PO420、L -glutamic acid 50、Taurine 20、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose 10，KOH調(diào)pH為7.3；INa細胞內(nèi)液（mmol/L）:CsCl 130、MgCl22、NaCl 10、HEPES 10，CsOH調(diào)pH為7.3；INa細胞外液（mmol/L）:氯化膽堿100、NaCl 150、MgCl22、HEPES 10、Glucose 10，NaOH調(diào)pH為7.3，加入4-AP 5、CsCl 20阻斷K+電流，加入CdCl20.3阻斷Ca2+電流。

1.3主要儀器倒置顯微鏡（日本Olympus公司），膜片鉗信號放大器及記錄分析軟件pulse+pulsefit 8.53（德國HEKA公司），多導生理信號采集系統(tǒng)（成都儀器廠），小動物人工呼吸機（浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器廠），微電極拉絲儀（美國Sutter公司）。

1.4分組及造模所有大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、胺碘酮組，共5組，每組10只，參考文獻［5］采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立缺血性心律失常動物模型。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，予10%水合氯醛麻醉、固定、連接四道生理記錄儀及小動物呼吸機；左側(cè)胸部胸部備皮、消毒，手術(shù)剪由左側(cè)胸骨下端向左腋方向剪開胸腔、分離胸膜、暴露心臟，顯微持針器用6.0縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支（假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎）；觀察心電圖，出現(xiàn)ST段或者T波抬高、心臟局部顏色變暗等變化說明動物模型復制成功。

1.5給藥方法造模后3 d開始灌胃給藥，中藥組成:柴胡15 g，法半夏9 g，苦參15 g，丹參15 g，黨參20 g，黃連6 g，青蒿10 g，炙甘草5 g。中藥按成人等效劑量4.8 g/d換算，低劑量組灌胃2.4 g/d，高劑量組灌胃9.6 g/d；胺碘酮組予灌胃胺碘酮0.1 g/（kg·d），其余各組均灌胃0.9%NaCl，各組灌胃體積均為10 mL/kg。1個月后取材分離心肌細胞。

1.6標本采集與檢測1）心室肌細胞的分離:取大鼠，開胸取心臟，剪去心包，從主動脈根部連接心臟灌流裝置，用37度無鈣臺氏液灌流6～8 min；換用配制好的酶液反復灌流8～10 min，直至心臟膨大、松弛并出現(xiàn)拉絲后取下；取心室壁組織、剪碎，置于酶液與臺式液1∶1混合液中，攪拌并充入O2，4～5 min后吸取上清于KB液中，靜置1 h鏡下觀察細胞膜恢復即可。2）膜片鉗全細胞記錄:微電極拉絲儀將清潔毛坯電極拉制成玻璃微電極，阻抗2～3 MΩ；采用Hamill［6］法，將心室肌細胞滴于灌流槽中，靜置5 min后用INa細胞外液2～3 mL/min灌流以沖去細胞碎片；采用三維液壓微操控器將電極靠近細胞、稍加負壓可形成1 GΩ以上的高阻抗封接，再用較大負壓吸破細胞膜形成全細胞記錄，記錄不同刺激下的相應電流。3）INa電流記錄: （1）電流-電壓曲線:保持電位（HP）=-140 mV、階躍+10 mV、頻率1 Hz、鉗制50ms，給予從-80 mV至+60 mV去極化脈沖刺激；以電流幅值與膜電容之比（pA/pF）表示電流值（電流密度），將鉗制電壓和電流值連線繪圖連線，即為INa密度-電壓（I～V）曲線。（2）穩(wěn)態(tài)失活曲線:雙脈沖刺激法，HP=-120 mV，條件脈沖-160～-40 mV，鉗制時間1000 ms，階躍+10 mV；條件脈沖后加一去極化到-30 mV的測試脈沖，持續(xù)50 ms，將記錄的INa與最大激活時INa比值，及對應脈沖膜電位連線作圖即為INa失活曲線，采用Pulse +Pulsefit軟件計算INa半數(shù)失活電壓（V0.5）。（3）滅活后再恢復曲線雙脈沖刺激法，第1個脈沖HP=-80 mV，去極化到-20 mV，持續(xù)50ms，在第1個脈沖回到HP后5 ms給予第2個脈沖，去極化到-30 mV，隨后每間隔10 ms給予脈沖刺激直至145 ms，頻率=1 Hz；以第2個脈沖與第1個脈沖比值及相應時間連線作圖即為INa失活后再恢復曲線。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細胞INa密度-電壓（I～V）曲線比較見表1，圖1。各組心室肌細胞所監(jiān)測的鈉通道電流變化見圖1，各組細胞I～V曲線均在-70 mV時激活，-20 mV時出現(xiàn)峰值，+40 mV出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，組間比較，以胺碘酮組和中藥高劑量組I～V曲線較低；各組INa峰值比較，中藥高劑量組和胺碘酮組均較模型組明顯下降（P＜0.01），兩組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1　各組心肌細胞INa密度-電壓（I～V）曲線比較

2.2各組INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的變化比較見圖2，表1。中藥高劑量組和胺碘酮組INa穩(wěn)態(tài)失活曲線較模型組有明顯左移趨勢；各組INa半數(shù)失活電壓V0.5比較，中藥高劑量組和胺碘酮組較模型組明顯降低（P＜0.01），兩組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1　各組I Na電流峰值及V0.5比較

表1　各組I Na電流峰值及V0.5比較

與模型組比較，△△P＜0.01。

組　別　n　INa電流峰值（pA/pF）　V0.5（mV）假手術(shù)組　10　-28.61±5.03　-97.17±7.13模型組　10　-25.88±4.65　-110.56±5.67中藥低劑量組　10　-24.62±3.98　-112.12±6.12中藥高劑量組　10　-20.11±2.67△△　-127.23±-4.15△△胺碘酮組　10　-18.51±2.32△△　-125.48±5.01△△

圖2　各組心肌細胞INa穩(wěn)態(tài)失活曲線比較

2.3各組INa滅活后再恢復曲線變化比較見圖3。中藥高劑量組和胺碘酮組INa滅活后再恢復曲線較模型組有明顯下移趨勢；各組在時間間隔為45、95、145 ms 時INa恢復程度比較，中藥高劑量組和胺碘酮組較模型組明顯降低（P＜0.01），兩組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖3　各組心肌細胞INa滅活后再恢復曲線比較

3　討論

1976年德國學者Neher和Sakmann發(fā)明了膜片鉗技術(shù)，能直接反應細胞膜上離子通道活動，膜片鉗全細胞法可直接測定膜離子通道電流的大小，還可以研究通道的動力學及藥物對通道動力學的影響［5］。Na+通道廣泛存在于各類細胞中，是抗心律失常藥物常見心肌細胞上效應靶點之一。Na+通道的激活是電壓依賴的，當膜電位在-80～-90 mV時可發(fā)生去極化，通道被激活導致Na+快速內(nèi)流，表現(xiàn)為動作電位上升相。Na+電流是快反應心肌細胞動作電位0期除極化主要成分，動作電位0位相的最大上升速度和幅度決定了沖動的傳導速度，但這也與動作電位平臺期內(nèi)“鈉窗電流”（慢鈉通道的慢鈉電流）有關(guān)。Na+通道的激活決定著心肌細胞的興奮性和傳導性，Na+通道電生理改變也是發(fā)生心律失常的重要機制之一［6］。

心律失常在中醫(yī)學中屬于“心悸”“怔忡”“驚悸”范疇，中醫(yī)認為，“陰陽之氣不能順承，病則時發(fā)時已，可予小柴胡湯和解”［7］，陣發(fā)性疾病發(fā)作多與少陽相關(guān)；心律失常陣發(fā)性發(fā)作，類似于少陽證之寒熱往來陣作，因痰濕瘀血等宿邪作祟，正勝邪退則脈率/律穩(wěn)定，邪勝正退則內(nèi)擾心神發(fā)為心悸。因此，本研究采用柴胡三參膠囊和解少陽，定悸養(yǎng)心，祛瘀化痰，益氣通經(jīng)。方中柴胡、青蒿芳香疏泄、和解少陽；法半夏、苦參燥濕化痰、祛邪散氣；丹參活血祛瘀；黃連清心定悸；黨參溫補心脈；炙甘草調(diào)和諸藥。全方共奏和解定悸、祛瘀化痰、益氣通經(jīng)之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡三參膠囊高劑量組及胺碘酮組心肌細胞INa峰值、INa半數(shù)失活電壓V0.5及INa I～V曲線均較缺血性心律失常模型組明顯下降，表明高劑量柴胡三參膠囊和胺碘酮均能作用于INa，可降低其最大激活電壓Vmax，延遲沖動傳導時間；INa穩(wěn)態(tài)失活曲線和滅活后恢復曲線可反映出通道的電壓依賴特征和通道滅活后的恢復過程，常用來判斷藥物對通道失活態(tài)的影響［8］。本研究結(jié)果示，柴胡三參膠囊高劑量組及胺碘酮組INa穩(wěn)態(tài)失活曲線較模型組有明顯左移趨勢，INa滅活后再恢復曲線較模型組有明顯下移趨勢，說明高劑量柴胡三參膠囊和胺碘酮均對失活態(tài)INa有較好的親和力，能呈電壓依賴地影響INa滅活過程，延緩INa失活后的恢復進程，延長心肌細胞動作電位時程，并降低0期電位的上升速率和幅度，總體有利于消除動作電位的傳導折返，從而抑制快速性心律失常的發(fā)生，這也與其他學者關(guān)于胺碘酮的研究結(jié)果相一致［9］。

綜上所述，柴胡三參膠囊能夠結(jié)合INa失活態(tài)并對其產(chǎn)生抑制作用，延緩INa失活后再恢復，這可能是其抗心律失常的機制之一。

參考文獻

［1］Cintra FD，Leite RP，Storti LJ，et al.Sleep apnea and nocturnalcardiac arrhythmia:a populational study［J］.Arq Bras Cardiol，2014，103（5）:368-374.

［2］Nattel S，Andrade J，Macle L，et al.New directions in cardiac arrhythmia management: present challenges and future solutions［J］.Can J Cardiol，2014，30（12）:420-430.

［3］劉建和，胡熙苒，何少平，等.柴胡三參膠囊對實驗性心律失常保護作用的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，9（8）:1073-1075.

［4］劉建和，何少平，胡熙苒，等.柴胡三參膠囊對心肌缺血心律失常模型大鼠心肌細胞Ca（2+）及SERCA2a mRNA表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，10（25）:1574-1576.

［5］Ossola D，Amarouch MY，Behr P，et al.Force -controlled patch clamp of beating cardiac cells［J］.Nano Lett，2015，15 （3）:1743-1750.

［6］van Hoeijen DA，Blom MT，Tan HL.Cardiac sodium channels and inherited electrophysiological disorders: an update on the pharmacotherapy［J］.Expert Opin Pharmacother，2014，15 （13）:1875-1887.

［7］陳明，張印生.傷寒名醫(yī)驗案精選［M］.北京:文苑出版社，2008:255-258.

［8］Remme CA，Bezzina CR.Sodium channel（dys）function and cardiac arrhythmias［J］.Cardiovasc Ther，2010，28（5）:287-294.

［9］Beckerman Z，Azran A，Cohen O，et al.A novel amiodaroneeluting biological glue for reducing postoperative atrial fibrillation:first animal trial［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2014，19（5）:481-491.

·文獻分析·

·研究報告·

Effects of Chaihu Sanshen Jiaonang on Steady-state Inactivation and Recovery of Sodium Channel in Ischemic Arrhythmia Rats

SHENG Wang，LIU Kan，WANG Jinxi，et al.The First Hospital of Human Univer- sity of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective: To observe the effects of Chaihu Sanshen Jiaonang on steady-state inactivation and recovery of sodium channel in ischemic arrhythmia rats，and seek for the molecular cytological mechanism of Chaihu Sanshen Capsule on ischemic arrhythmia.Methods: Rats were randomly divided into sham operation group，the model group，low dosage of TCM group，high dosage of TCM group and amiodarone group.The annimal models of ischemic arrhythmia were made；ventricular myocytes were isolated with enzymatic digestion，and the change of sodium channel currents were detected with Patch-clamp techniques.Results: Compared with the model group，peak value of INa，V0.5 and I-V curve of high dosage of TCM group and amiodarone group decreased obviously （P＜0.01）；steady-state inactivation curve moved left and recovery curve moved down observably in the two.Conclusion: Chaihu Sanshen Jiaonang can combine the inactivation state of sodium channel，and have a suppression effect on the channel，which may be the mechanism of Chaihu Sanshen Jiaonang on ischemic arrhythmia.

【Key words】Ischemic arrhythmia；Chaihu Sanshen Jiaonang；Solium channel；Patch-clamp technique

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0042-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.015

*基金項目：湖南省教育廳項目（15C1048）

通信作者△（電子郵箱：ljhtcm@163.com）

收稿日期（2015-08-12）