以脂肪酶活為指標(biāo)快速篩選吉他霉素高產(chǎn)菌株的研究

劉守強(qiáng)， 趙 中， 王雪潔， 劉 果， 周淑梅

(1.天方藥業(yè)有限公司,河南駐馬店 463000;2.黃淮學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)系,河南駐馬店 463000;3.河南省駐馬店市環(huán)境保護(hù)局,河南駐馬店 463000)

以脂肪酶活為指標(biāo)快速篩選吉他霉素高產(chǎn)菌株的研究

劉守強(qiáng)1， 趙 中2， 王雪潔1， 劉 果1， 周淑梅3

(1.天方藥業(yè)有限公司,河南駐馬店 463000;2.黃淮學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)系,河南駐馬店 463000;3.河南省駐馬店市環(huán)境保護(hù)局,河南駐馬店 463000)

摘要[目的]篩選吉他霉素高產(chǎn)菌株。[方法]以1株北里鏈霉菌Zn14-05為出發(fā)菌株,進(jìn)行紫外線與NTG復(fù)合誘變處理，通過以脂肪酶活力為初篩指標(biāo)和搖瓶復(fù)篩篩選吉他霉素高產(chǎn)菌株。[結(jié)果]搖瓶發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高10%；傳代試驗(yàn)結(jié)果表明其遺傳性能穩(wěn)定。[結(jié)論]以高脂肪酶活性為初篩指標(biāo)選育吉他霉素高產(chǎn)突變株，縮短了選育周期，減少了初篩工作量，提高了選育效率。

關(guān)鍵詞紫外射線；突變株；吉他霉素；脂肪酶

吉他霉素是由鏈霉菌所產(chǎn)生的一種多組分的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，抗菌性能與紅霉素相似，對(duì)革蘭陽性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，較紅霉素稍弱，但對(duì)耐紅霉素等金黃色葡萄球菌有效，細(xì)菌對(duì)之耐藥性產(chǎn)生較慢，該品系非耐藥誘導(dǎo)藥物。隨著抗生素耐藥問題的不斷凸顯，吉他霉素以其低耐藥性的特性，豐富了現(xiàn)有抗生素品種，并且作為一種獸用飼料添加劑，市場(chǎng)需求較大。吉他霉素生產(chǎn)研究進(jìn)展較緩慢，自1953年發(fā)現(xiàn)以來，期間不斷有研究報(bào)道篩選出優(yōu)良高產(chǎn)菌株，1990年四川抗菌素工業(yè)研究所分離得到1株高產(chǎn)菌株，其效價(jià)較原菌株提高100倍，后期研究在提高菌株效價(jià)的同時(shí)，提高了吉他霉素有效組分的含量，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，自1995年以來，生產(chǎn)技術(shù)一直沒有大的突破。

在抗生素發(fā)酵過程中，工業(yè)化生產(chǎn)菌大多數(shù)是通過誘變育種方法獲得，傳統(tǒng)的誘變育種不僅可以獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，更以技術(shù)要求不高和操作簡便而在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。 筆者通過對(duì)出發(fā)菌株紫外誘變結(jié)合氯化鋰、NTG復(fù)合處理，以高脂肪酶活力為初次篩選指標(biāo)，進(jìn)行了吉他霉素高產(chǎn)菌株選育，以期為吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌。吉他霉素菌株Zn14-05由河南天方藥業(yè)股份有限公提供。

1.1.2培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基：淀粉15.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸鎂0.60 g/L，酵母膏4.00 g/L，豆油40.00 g/L，瓊脂21.00 g/L,消前pH 7.2,羅丹明B，氯化鋰 8.00 g/L。種子搖瓶培養(yǎng)基：淀粉20.00 g/L，黃豆餅粉18.00 g/L，氯化鈉4.00 g/L,葡萄糖10.00 g/L,碳酸鈣3.00 g/L,消前pH 7.2。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基：淀粉18.00 g/L，黃豆餅粉20.00 g/L，硫酸鋅0.06 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L,豆油40.00 g/L,消前pH 7.2。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法。

1.2.1.1平板、斜面培養(yǎng)。(28.0±0.5)℃恒溫培養(yǎng)10 d，4 ℃冰箱保藏。

1.2.1.2種子培養(yǎng)。由茄子瓶斜面挖約1 cm2大小塊狀物，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 搖床培養(yǎng)26～32 h。

1.2.1.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。 將種子液按10%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 搖床培養(yǎng)110 h。

1.2.2誘變方法。以吉他霉素菌株Zn14-05為出發(fā)菌株，用鏟子刮下新鮮斜面孢子，放入裝有玻璃珠并加入無菌生理鹽水的三角瓶中，搖勻攪散，滅菌后單層擦鏡紙過濾,鏡檢單孢子分散度在95%以上用于誘變處理。在誘變前進(jìn)行稀釋，然后按常規(guī)誘變方法進(jìn)行誘變處理[1]。

1.2.3篩選方法。

1.2.3.1紫外線誘變篩選。吸取單孢子懸浮液6 mL于含磁力旋子的平板中, 置于30 W的UV 燈(253.7 nm)下25 cm處,通過磁力攪拌照射處理,照射時(shí)間控制殺死率在90%左右，然后加入到平板培養(yǎng)基中28 ℃避光培養(yǎng)120 h，挑取水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株。

1.2.3.2NTG誘變處理。以紫外線誘變所得水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株為出發(fā)菌株，將菌株斜面孢子涂布于培養(yǎng)基平板(不含氯化鋰和羅丹明B)上，蘸取少量NTG顆粒置于平板中央，28 ℃培養(yǎng)48 h后刮下抑菌圈周圍的菌苔，稀釋后涂布于培養(yǎng)基平板上，28 ℃再培養(yǎng)10 d，挑取水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株進(jìn)行搖瓶初篩、復(fù)篩，獲得高產(chǎn)突變株。

1.2.4吉他霉素效價(jià)測(cè)定。采用管碟法[2]。參照《中國藥典》2010版附錄×IA依法測(cè)定，試驗(yàn)用菌為枯草芽孢桿菌， 用微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀測(cè)量并計(jì)算結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1菌株脂肪酶活力與產(chǎn)吉他霉素效價(jià)之間的關(guān)系吉他霉素產(chǎn)生菌菌體分泌的脂肪酶可將分離培養(yǎng)基中的豆油水解成甘油和脂肪酸，使羅丹明B呈粉色，產(chǎn)生水解圈。水解圈直徑與菌落直徑比值反映出脂肪酶活力的大小。選擇不同生產(chǎn)能力的菌株涂布在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)水解圈直徑與菌落直徑比值與效價(jià)的關(guān)系。

表1水解圈直徑與菌落直徑比值與效價(jià)的關(guān)系

Table 1Relationship between the hydrolytic circle and the colony diameter ratio and titer

菌株Stain效價(jià)Titer∥U/mL比值Ratio178601.16296501.433108651.604112641.655121161.756134621.90

植物油可提高藤倉赤霉菌合成赤霉素的能力，植物油減輕了碳代謝抑制，并有利于乙酰輔酶A和前體物供給[3-4]。植物油作為抗生素發(fā)酵碳源利用時(shí)，減輕了葡萄糖代謝所產(chǎn)生的抑制作用，但生產(chǎn)菌株脂肪酶活性的高低是影響抗生素效價(jià)提高的關(guān)鍵[5]。由表1可知，吉他霉素產(chǎn)生菌落直徑與水解圈直徑比值的大小與效價(jià)有一定的關(guān)系，呈正相關(guān)。也就是說，水解圈的大小反映出該菌株的效價(jià)高低，通過水解圈的大小來判斷菌株的生產(chǎn)能力是可靠的。

2.2NTG誘變獲得高產(chǎn)突變株經(jīng)NTG誘變，挑選出10株菌，搖瓶初篩后得到5株搖瓶效價(jià)比初始出發(fā)菌株高的菌。將效價(jià)提高8%以上的菌株進(jìn)行分離純化，菌落的一部分接斜面，一部分接搖瓶考察效價(jià)。搖瓶復(fù)篩后獲得1株發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株高且遺傳穩(wěn)定的菌株，其中最高的Zn14-12菌株的吉他霉素產(chǎn)量提高了10%。

2.3高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性考察 將篩選到的突變菌株Zn14-12用群體連續(xù)傳至第5代的方法考察其傳代穩(wěn)定性,測(cè)定每代的效價(jià)。由圖1可知，菌株連續(xù)群體傳至第3代斜面效價(jià)與F1代持平，第4代效價(jià)是F0代的95%，第5代降低較多，只有F0的88%，表明菌株Zn14-12的高產(chǎn)遺傳特性是穩(wěn)定的。

表1　傳代次數(shù)對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響 Fig. 1　Effects of passage number on fermentation titer

3結(jié)論與討論

該研究對(duì)吉他霉素產(chǎn)生菌株Zn14-05經(jīng)紫外線和氯化鋰、NTG復(fù)合誘變處理，以高脂肪酶活性為初篩指標(biāo)選育吉他霉素高產(chǎn)突變株，縮短了選育周期，減少了初篩工作量，提高了選育效率，突變株效價(jià)比出發(fā)菌株高出10%。經(jīng)連續(xù)5次群體傳代和效價(jià)考察，F(xiàn)4發(fā)酵水平穩(wěn)定在F0的95%以上。

在抗生素生物合成中,前體起著重要作用,一定條件下可控制菌體合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的方向并增加其產(chǎn)量。吉他霉素內(nèi)酯環(huán)是由5個(gè)乙酸單位、1個(gè)丙酸單位、1個(gè)丁酸單位、1個(gè)羥基乙酸單位通過與脂肪酸合成相似的聚酮體途徑縮合而成[6]，短鏈脂肪酸作為次級(jí)代謝生物合成的前體，而在含油培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，油是短鏈脂肪酸產(chǎn)物的主要來源。脂肪酶活力高的產(chǎn)生菌就可能為合成次級(jí)代謝物提供更多的短鏈脂肪酸作為生物合成的前體。脂肪酶的水解作用是吉他霉素產(chǎn)生菌吸收利用豆油的第1步。該研究表明，菌株脂肪酶的活力不同，其產(chǎn)生吉他霉素的能力也顯著不同，而且表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)，利用該性質(zhì)，可快速判斷菌株的發(fā)酵水平，指導(dǎo)菌種初篩，提高工作效率。

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Rapid Screening of Kitasamycin High-yield Strains with Lipase Activity as the Index

LIU Shou-qiang1, ZHAO Zhong2, WANG Xue-jie1et al

(1. Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian, Henan 463000; 2. Department of Mathematics, Huanghuai University, Zhumadian, Henan 463000)

Abstract[Objective] To screen a kitasamycin high-yield strain. [Method] With streptomyces kitasatoensis Zn14-05 as an original strain, UV and NTG compound mutagenesis was adopted. Lipase activity was used as the early screening index, shake-flask screening was used to obtain the kitasamycin high-yield strain. [Result] Fermentation titer of shake-flask enhanced by 10% compared with the original strain. Passage test proved that this strain had stable genetic characteristics. [Conclusion] High lipase activity is used to screen the kitasamycin high-yield mutant strain, which shortens the breeding cycle, reduces the workload of preliminary screening, and enhances the efficiency of breeding.

Key wordsUV; Mutant strain; Kitasamycin; Lipase

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1304104)。

作者簡介劉守強(qiáng)(1967- ),男，河南駐馬店人，高級(jí)工程師，從事抗生素發(fā)酵工藝研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號(hào)TQ 465

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-005-02