西藏羊八井高溫地?zé)崽镏卸仁葻岱啪€菌多樣性及生物活性

尹明遠(yuǎn)，張格杰，何建清*，燕 飛

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

西藏羊八井高溫地?zé)崽镏卸仁葻岱啪€菌多樣性及生物活性

尹明遠(yuǎn)1，張格杰1，何建清1*，燕 飛2

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

摘要[目的]探明羊八井地?zé)崽锓啪€菌的數(shù)量、種類(lèi)組成、拮抗活性和酶活性。[方法]采用稀釋平板法對(duì)羊八井地?zé)崽锏啄嗪退畼臃啪€菌進(jìn)行分離，通過(guò)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和 16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析的方法研究樣品中度嗜熱放線菌的多樣性，并對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行抑菌、酶活性及溫度耐受試驗(yàn)。[結(jié)果]從羊八井溫泉底泥和水樣中分離到21株中度嗜熱放線菌，分布于放線菌門(mén)放線菌綱3個(gè)亞目3個(gè)科3個(gè)屬，即鏈霉菌屬(Streptomyces)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)和小單孢菌屬(Micromonospora)。21株中度嗜熱放線菌中，14.2%的菌株具有纖維素酶活性，52.3%的菌株具有過(guò)氧化氫酶活性，28.6%的菌株具有硝酸鹽還原活性，33.3%的菌株可產(chǎn)生硫化氫，只有1株菌對(duì)大腸桿菌(E.coil)有抑菌活性，21株中度嗜熱放線菌最適生長(zhǎng)溫度為45～55 ℃，超過(guò)65 ℃都不能生長(zhǎng)。[結(jié)論]羊八井地?zé)崽锓啪€菌多樣性較豐富，產(chǎn)酶特性良好，為開(kāi)發(fā)利用地?zé)岘h(huán)境放線菌資源奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞嗜熱放線菌；16S rRNA；生物活性；多樣性

世界上存在各種各樣適合嗜熱放線菌棲息的生境，如火山、地?zé)?、堆肥、溫泉等。?guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了溫泉里分離的嗜熱放線菌可產(chǎn)生一些具有重要價(jià)值的熱穩(wěn)定的酶，如脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、DNA聚合酶等，并已廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物技術(shù)行業(yè)[1-4]。目前，在以下屬中發(fā)現(xiàn)較多的高溫放線菌菌株：高溫單孢菌屬(Thermomonospora)[5-6]、糖單孢菌屬(Saccharomonospora)[7]、高溫雙岐菌屬(Thermobifida)[8]、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)[8]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[9]、假諾卡氏菌屬(Pseudonocarcardia)、類(lèi)諾卡氏菌屬(Nocardioides)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、小單孢菌屬(Micromonospora)、高溫多孢菌屬(Thermopolyspora)等。

羊八井地?zé)嵛挥谖覈?guó)西藏自治區(qū)拉薩市西北約90 km的當(dāng)雄縣羊八井鎮(zhèn)西側(cè)，地理坐標(biāo)為30°～31° N、90°～91°E，海拔高度在4 290～4 500 m。羊八井分布有規(guī)模宏大的噴泉與間歇噴泉、溫泉、熱泉、沸泉、熱水湖等，溫度保持在47 ℃左右，是研究嗜熱放線菌的理想之地。隨著人們對(duì)嗜熱放線菌關(guān)注度的日益增加，許多學(xué)者對(duì)國(guó)內(nèi)不同高溫環(huán)境的放線菌的資源進(jìn)行了研究，但對(duì)羊八井地?zé)崽锓啪€菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，筆者研究了羊八井地?zé)崽锸葻岱啪€菌的資源種類(lèi)、拮抗活性及其酶的應(yīng)用潛力，旨在為開(kāi)發(fā)高溫環(huán)境放線菌資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試樣品。從西藏羊八井采集了10份溫泉底泥和5份溫泉水樣(表1)，并保存于無(wú)菌塑料袋和無(wú)菌瓶中。

1.1.2培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基采用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基[10]，為抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中均加入質(zhì)量濃度為70 mg/L的重鉻酸鉀。

表1　羊八井地?zé)崽锃h(huán)境數(shù)據(jù)

1.1.3主要試劑與儀器。脫脂奶粉、酵母膏、蛋白胨、淀粉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；DNA Polymerase、dNTPs、DNA marker DL-2000、pMD18-T vector 購(gòu)自TaKaRa公司；PCR儀為東勝公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。

1.1.4病原菌。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、南瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)、粉紅聚端孢(Trichotheciumroseum)、小麥根腐菌(Bipolarissorokiniana)菌株由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院真菌實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理與菌株分離。用無(wú)菌袋盛取地?zé)崽锏啄鄻悠罚糜谑覂?nèi)風(fēng)干，充分研磨，過(guò)篩，稱(chēng)量10 g，轉(zhuǎn)移至盛有90.0 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于45 ℃恒溫振蕩箱中120 r/min振蕩，使蘊(yùn)藏在樣品中的微生物充分釋放，用移液槍分別取1.0 mL樣品至盛有9.0 mL無(wú)菌水的試管中，稀釋至1×10-2，取0.2 mL涂布于分離培養(yǎng)基上，于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7～14 d。

取一定體積的水樣通過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜富集，取下濾膜放在平板上，用1.0 mL無(wú)菌水將濾膜上的沉積洗掉，采用傾注平板法將適當(dāng)溫度的培養(yǎng)基倒入相應(yīng)平板，搖勻冷卻后于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7～21 d。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色初步分離篩選，利用高氏培養(yǎng)基純化并保藏。

1.2.2嗜熱放線菌鑒定。經(jīng)純化后的嗜熱放線菌，采用插片法適時(shí)取片，用番紅染色在光學(xué)顯微鏡下觀察和初步鑒定[11]。同時(shí)按照參考文獻(xiàn)[12]的方法提取總DNA，用細(xì)菌16S rRNA通用引物PA5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’和PB 5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物直接送浙江杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)ClustalX軟件[13]進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA4軟件[14]中的Neighbour-Joining法[15]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)置的重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000次。

1.2.3酶活測(cè)定。淀粉酶水解、硝酸鹽還原、纖維素分解、明膠利用、氧化酶、硫化氫、過(guò)氧化氫酶活性篩選均參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。

1.2.4拮抗活性測(cè)定。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試嗜熱放線菌發(fā)酵液的皿內(nèi)抑菌作用，選用的細(xì)菌為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，植物病原真菌為小麥赤霉菌、番茄灰霉菌、南瓜枯萎菌、粉紅聚端孢和小麥根腐菌。

1.2.5生長(zhǎng)溫度測(cè)定。以高氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基檢測(cè)不同試驗(yàn)菌株在30～75 ℃下的生長(zhǎng)情況。

2結(jié)果與分析

2.1羊八井地?zé)崽锏啄喾啪€菌數(shù)量分布 3種培養(yǎng)基對(duì)不同樣品中的放線菌出菌率明顯不同。由表2可知，精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量最大，菌落形態(tài)較豐富，高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基和蔗糖察氏培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量相對(duì)較少，種類(lèi)單一。因此，精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基的分離效果最好，分離的放線菌種類(lèi)及數(shù)量均最多。

2.2中度嗜熱放線菌的多樣性從羊八井地?zé)崽锊杉?0份底泥和5份水樣，采用稀釋平板法分離出21株嗜熱放線菌，其中底泥19株，水樣2株，測(cè)定其16S rRNA序列。由圖1可知，分離菌株分布于放線菌綱3個(gè)亞目3個(gè)科3個(gè)屬，即鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬和小單孢菌屬。其中，鏈霉菌屬為羊八井地?zé)崽锏啄嘀械膬?yōu)勢(shì)放線菌，占分離菌株數(shù)的89.50%，其次是擬諾卡氏菌屬，占分離菌株數(shù)的10.50%；水樣中全部為小單孢菌屬。

表2樣區(qū)土壤嗜熱放線菌數(shù)量

Table 2The quantity of thermophilic actinomycetes in sample plot soil×103個(gè)/g

樣區(qū)號(hào)PlotNo.高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基GaoshiNo.1agarculturemedium蔗糖察氏培養(yǎng)基Sucroseculturemedium精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基Arginineglycerinagarculturemedium14.293.428.4211.5136.717.534.5133.0225.3412.5121.228.954.576.836.7612.5283.818.4713.5152.110.0828.0181.74.594.5226.48.4103.4159.478.0

注：高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基含鏈霉菌屬(4)；蔗糖察氏培養(yǎng)基含鏈霉菌屬(3)、小單孢菌屬(1)；精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基含鏈霉菌屬(10)、小單孢菌屬(1)、擬諾卡氏菌屬(2)。

Note：Gaoshi No.1 arar culture medium containsStreptomyces；Sucrose culture medium containsStreptomyces，Micromonospora；Arginine glycerin agar culture medium containsStreptomyces，Micromonospora，Nocardiopsis.

2.3酶活及拮抗活性測(cè)定結(jié)果由表3可知，21株嗜熱放線菌中，14.2%的菌株具有纖維素酶活性，52.3%的菌株具有過(guò)氧化氫酶活性，28.6%的菌株可把硝酸鹽還原，33.3%的菌株可產(chǎn)生硫化氫，其中菌株R5、R10、R20具有高活性的纖維素酶活性，說(shuō)明羊八井地?zé)崽锓啪€菌具有較強(qiáng)的酶活性。拮抗測(cè)定結(jié)果顯示，只有1株菌對(duì)大腸桿菌有拮抗活性，說(shuō)明羊八井地?zé)崽锓啪€菌產(chǎn)拮抗活性能力較弱。

2.4分離菌株的生長(zhǎng)溫度21株嗜熱放線菌在30～60 ℃下都可生長(zhǎng)，65～75 ℃下均不能生長(zhǎng)，45～55 ℃下生長(zhǎng)狀況最好，因此，最適生長(zhǎng)溫度范圍為45～55 ℃。

3結(jié)論與討論

該研究從羊八井地?zé)崽镏蟹蛛x得到21株放線菌，分布于放線菌綱3亞目3科3屬，即鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬和小單孢菌屬，表明羊八井地?zé)崽锓啪€菌數(shù)量少，種類(lèi)較單一，這可能與分離培養(yǎng)基的種類(lèi)及樣品的分析量較少有關(guān)，或者羊八井地?zé)崽锏奈⑸镆约?xì)菌為主[17]。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)羊八井地?zé)崽锓啪€菌中以鏈霉菌為優(yōu)勢(shì)菌種，這與Thawai[18]對(duì)泰國(guó)溫泉放線菌的多樣性研究結(jié)果一致，Thawai在泰國(guó)某溫泉分離到鏈霉菌屬和小單孢菌屬，與Song等[19]對(duì)中國(guó)云南騰沖、俄羅斯堪察加半島和美國(guó)內(nèi)華達(dá)溫泉放線菌多樣性研究結(jié)果不一致，分析原因是由很多因素造成，如溫度、光照、氧氣、pH、水的理化性質(zhì)、地理位置等生態(tài)因子[20]。主要原因可能是由于羊八井溫泉與其他溫泉溫度具有一定差異，而溫度是影響放線菌多樣性的重要因素[19，21-22]。該研究分離的21個(gè)菌株具有纖維素酶、過(guò)氧化氫酶、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生的比率分別為14.2%、52.3%、28.6%、33.3%，其中菌株R5、R10、R20具有較高的纖維素酶活性，后續(xù)工作將對(duì)這3株菌產(chǎn)生的纖維素分解酶進(jìn)一步研究和利用，個(gè)別菌株可產(chǎn)生2種酶。綜上所述，西藏羊八井高溫地?zé)崽锸谦@得酶的潛在資源。分離的21株菌中只有1株菌對(duì)大腸桿菌有抑菌活性，對(duì)其他5種植物病原真菌和金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌活性，這可能與供試菌株數(shù)量較小有關(guān)，曹艷茹等[23]發(fā)現(xiàn)具有合成抗生素相關(guān)基因的菌株只有在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下才會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)的抗性，而該研究中21株供試菌的發(fā)酵條件可能由于不適合從而導(dǎo)致拮抗活性較低。

圖1　基于16S rRNA 序列的西藏羊八井地?zé)崽锓啪€菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree of tested strains based on 16S rRNA sequence

菌株號(hào)StrainNo.纖維素酶Cellulase淀粉酶Amylase硝酸鹽還原Nitratereduction明膠液化Gelatinliquefaction硫化氫產(chǎn)生H2Sproduction過(guò)氧化氫酶CatalaseR1--+--+R2----++R3--+---R4--+---R5+++----+R7----++R8----++R9------R10+++-----R11------R12----++R13------R14--+--+R15------R16-----+R17----+-R18----++R19--+-++R20+++----+R21--+---

注：“-” 表示無(wú)酶活性；“+”表示有活性；“+++”為濾紙條降解≥2/3。

Note：“-”.negative.“+”.positive.“+++” Degradation of the filter paper≥2/3.

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Biological Activity and Diversity of Moderately Thermophilic Actinomyccetes from Geothermal Field in the Yangbajing of Tibet

YIN Ming-yuan, ZHANG Ge-jie, HE Jian-qing*et al

(College of Agriculture and Animal Husbandry, Tibet University, Linzhi, Tibet 860000)

Abstract[Objective] The aim was to explore the quantity, composition, antagonistic activity and enzyme activity of actinomyccetes from geothermal field in Yangbajing. [Method] Thermophilic actinomycetes were isolated via plate dilution from the sediment and water of Yangbajing geothermal field in Tibet Province. Based on the morphology, cultural characteristics and 16S rRNA sequence, diversity of thermophilic actinomycetes were studied, antibacterial activity, enzyme activity and temperature tolerance tests were conducted on isolates. [Result] The results showed that 21 isolates were identified and found to distribute into 3 genus: Streptomyce, Micromonospora and Nocardiopsis. Among those,14.2% produced cellulase, 52.3% produced catalase, 33.3% produced H2S and 28.6% could reduce nitrate, and 1 strain had antibacterial activity against Escherichia coil. The optimal growth temperature range for strains was 45-55 ℃ and temperature over 65 ℃ totally blocked the growth. [Conclusion] The discovery of diverse thermophilic actinobacteria from Yangbajing geothermal field indicates a potential source for enzymes.This study lays a foundation for the exploration and utilization of thermophilic actinobacteria resource.

Key wordsThermophilic actinomycetes; 16S rRNA; Biological activity; Diversity

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260005)。

作者簡(jiǎn)介尹明遠(yuǎn)(1991- )，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：極端環(huán)境放線菌。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事放線菌和生物防治研究。

收稿日期2016-02-24

中圖分類(lèi)號(hào)Q 938

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-001-04