熱激條件下家蠶血液30K蛋白磷酸化研究

李　娜　賈漫麗　楊貴明　李季生,2*

(1.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德067000；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州310029)

熱激條件下家蠶血液30K蛋白磷酸化研究

李娜1賈漫麗1楊貴明1李季生1,2*

(1.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德067000；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州310029)

摘要：本試驗旨在研究熱激條件下家蠶血液磷酸化蛋白的表達變化，為深入研究其功能提供參考。試驗設(shè)對照組和熱激組，每組選取五齡第3天家蠶幼蟲各30頭(雌雄各占1/2)，在40 ℃條件下分別熱激處理0、10 min，然后利用雙向電泳、Pro-Q Diamond染色、質(zhì)譜技術(shù)對表達差異的磷酸化蛋白進行研究。結(jié)果表明：1)銀染圖譜30 ku區(qū)積累了大量蛋白，經(jīng)Pro-Q Diamond染色后發(fā)現(xiàn)它們屬于磷酸化蛋白。2)經(jīng)過多次取樣和質(zhì)譜鑒定，最終獲得了3個30K蛋白，分別是PBMHPC-6、PBMHPC-19和PBMHPC-12。3)熱激處理10 min后，3個30K蛋白的表達量與熱激處理0 min相比顯著上調(diào)(P<0.05)。由此得出，五齡家蠶血液富含30K蛋白，它們不僅在脂質(zhì)運輸方面承擔(dān)著重要的角色，而且很可能參與熱激應(yīng)答。

關(guān)鍵詞：熱激；家蠶；血液；30K蛋白；磷酸化；雙向電泳

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是廣泛存在于生物體內(nèi)各種組織細胞中的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，機體大約30%的蛋白質(zhì)可發(fā)生不同形式的磷酸化[1]，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動。生物體通過蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達、細胞周期等諸多細胞過程。研究表明，植物體內(nèi)某些蛋白質(zhì)的磷酸化與溫度脅迫存在一定的關(guān)系，比如葉綠體D1蛋白和光系統(tǒng)Ⅱ蛋白等。因此，研究蛋白質(zhì)的磷酸化不僅可以了解其對蛋白質(zhì)功能的影響，而且還可以幫助我們更加深入地理解生命系統(tǒng)在分子水平的調(diào)控狀況[2]。

30K蛋白是一類在氨基酸組成及免疫學(xué)活性上相似的蛋白質(zhì)，理論等電點在6.1～8.4之間，分子質(zhì)量約為30 ku[3]。在家蠶(Bombyxmori)體中目前至少有35種分子質(zhì)量約為30 ku的脂蛋白登錄在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)上，有人推測其多樣化可能與蛋白質(zhì)的磷酸化有關(guān)。30K蛋白在五齡蠶幼蟲和蠶蛹的血液中大量積累，由脂肪體合成分泌，表達量受保幼激素的調(diào)節(jié)[4]。30K蛋白是家蠶生長發(fā)育過程中極其重要的儲藏蛋白，也有研究指出30K蛋白中的6G1和19G1可以特異性的與葡萄糖及葡聚糖結(jié)合，參與昆蟲的免疫反應(yīng)[5]；而且，19G1還可能是家蠶血液中抗細胞凋亡最強的成分[6]。盡管人們通過試驗的手段掌握了一些30K蛋白的功能，但是還有大量30K蛋白的功能處于未知狀態(tài)[7]。比如，30K蛋白是否參與熱激應(yīng)答，其磷酸化是否與熱激有關(guān)等，還需要進一步研究。

家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，同時也是鱗翅目昆蟲的代表和模式種[8]。溫度對家蠶尤其是壯蠶期的生長發(fā)育至關(guān)重要，高溫往往是造成夏秋季蠶繭減產(chǎn)和繭質(zhì)下降的主要原因。鑒于30K蛋白在五齡家蠶血液中的地位和角色以及蛋白質(zhì)磷酸化在生物活動中發(fā)揮的重要作用，本試驗利用高溫刺激家蠶，借助雙向電泳、Pro-Q Diamond熒光染色以及質(zhì)譜技術(shù)探討家蠶血液中30K蛋白的功能，分析其表達變化和磷酸化現(xiàn)象，進一步研究它們在環(huán)境脅迫中發(fā)揮的作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試家蠶品種為秋豐(Q)，由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蠶桑遺傳育種實驗室提供。家蠶幼蟲均用新鮮桑葉按照常規(guī)條件飼育至五齡第3天。試驗設(shè)對照組和熱激組，每組隨機選取30頭五齡第3天家蠶幼蟲(雌雄各占1/2)，放在40 ℃的培養(yǎng)箱中分別熱激0、10 min后，剪尾角取血，血液樣品經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2血液蛋白制備

取出血液樣品，放在冰上低溫緩慢解凍，然后按1 μL血液加10 μL裂解緩沖液[8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(V/V)3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸、2%(V/V)載體兩性電解質(zhì)(pH 3～10)和30 mmol/L二硫蘇糖醇]的比例加入裂解緩沖液，25 ℃振蕩混勻，并在30 ℃搖床上搖動，每隔10 min振蕩混勻1次。室溫下放置10 min，超聲波處理30 s，冰浴30 s，重復(fù)4次，以使樣品充分裂解。于4 ℃下15 000 r/min離心2次，每次15 min，吸取上清液。血液蛋白定量方法采用Bradford[9]的方法，在595 nm處測定標準蛋白和樣品的吸光度，采用標準曲線法測定計算樣品蛋白濃度。最后，根據(jù)所需蛋白量分裝至離心管中，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3雙向電泳及染色

雙向電泳參考Zhou等[10]的報道，采用Ettan IPGphor3等電聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直電泳系統(tǒng)Ettan Daltsix (Amersham Biosciences)，膠條采用pH為3～10的24 cm線性干膠條。雙向電泳完成后，小心取出凝膠，清洗后進行硝酸銀和Pro-Q Diamond熒光染色。

1.4圖譜掃描和分析

銀染膠采用Image Scanner 2D掃描儀(Amersham Bioscience)進行掃描。通過Image Master 2D platinum分析軟件進行圖像分析，檢測蛋白斑點，計算蛋白點百分體積，并預(yù)測其分子質(zhì)量和等電點。

1.530K蛋白質(zhì)譜鑒定和表達分析

挖取Pro-Q Diamond熒光染色膠中對應(yīng)的30K蛋白點，送交浙江理工大學(xué)進行質(zhì)譜鑒定。膠內(nèi)酶解方法參照Gharahdaghi等[11]的報道。質(zhì)譜鑒定采用文獻[12]中的方法和參數(shù)，質(zhì)譜儀為ABI公司生產(chǎn)的4700 Proteomics Analyzer。數(shù)據(jù)庫選用NCBInr，搜庫軟件為GPS ExploreTMsoftware。

1.6鑒定蛋白磷酸化位點預(yù)測

首先登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，得到鑒定蛋白的Fasta序列。下載保存后，利用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)在線提交。預(yù)測參數(shù)的設(shè)定如下：預(yù)測位點選擇酪氨酸(Y)、絲氨酸(S)與蘇氨酸(T)3種氨基酸，激酶選擇非特定，特異性為100%，進行磷酸化位點的預(yù)測[13]。

2結(jié)果與分析

2.1血液磷酸化蛋白圖譜分析

圖1為Pro-Q Diamond染色后不同熱激時間五齡第3天家蠶血液磷酸化蛋白的雙向電泳圖譜。從圖中可以看出，對照組(Q1pi)和熱激組(Q2pi)中各發(fā)現(xiàn)磷酸化蛋白點5個(h1、p、h3、h4和h5)。通過分析分子質(zhì)量和等電點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，h4和h5的分子質(zhì)量在45 ku左右，等電點在4.6左右，因此可以推測它們是30K蛋白的可能性極小。另外，從著色深淺判斷，h1、h4和h5的顏色明顯比p和h3重，說明這3個蛋白的表達量較高，而且h1在性質(zhì)上可能與p和h3有一定的差異。圖2為30K蛋白銀染圖和Pro-Q Diamond染色圖。從銀染圖中可以看出，h1、p和h3這3個蛋白與其他蛋白處于膠著狀態(tài)，表明五齡家蠶血液中累積了大量的30K蛋白，可能在蠶體脂質(zhì)運輸方面承擔(dān)著重要的角色。

2.230K蛋白的質(zhì)譜鑒定

通過多次取樣和重復(fù)測定，成功鑒定了h1、p和h3這3個蛋白(表1)，它們分別是30K蛋白中的PBMHPC-6 (h1)、PBMHPC-19 (p)和PBMHPC-12 (h3)。

質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明(表1)，3個蛋白的序列覆蓋度都在42.5%以上，蛋白得分最低為80分，匹配肽段數(shù)都在11個之上，等電點、分子質(zhì)量和理論值相差不大，說明了鑒定結(jié)果的可靠性。

Q1pi、Q2pi中，Q表示品種秋豐，阿拉伯數(shù)字1、2分別代表對照組和熱激組，pi表示磷酸化。下圖同。

In Q1pi,Q2pi and Q standed for the variety ofQiufeng, while the Arabic numerals 1 and 2 represented control group and heat shock group, respectively, and pi standed for phosphorylation. The same as below.

圖1家蠶血液磷酸化蛋白雙向電泳圖譜

Fig.1Two-dimensional electrophoresis map of

phosphorylation proteins from

silkworm haemolymph

圖2　30K蛋白銀染圖(左)和

2.330K蛋白差異分析及磷酸化位點預(yù)測

從圖2左側(cè)的銀染圖可以看出，3個蛋白點幾乎聚集在一起，和周圍蛋白呈現(xiàn)膠著狀態(tài)，所以無法進行表達差異分析。Pro-Q Diamond熒光染色解決了這個問題，從圖2右側(cè)的Pro-Q Diamond染色圖上看，3個蛋白得到了很好的分離，尤其是h1著色明顯，表達量大。通過Image Master 2D platinum分析軟件計算蛋白點百分體積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱激處理10 min后3個蛋白(PBMHPC-6、PBMHPC-19和PBMHPC-12)的百分體積分別是對照組的2.15、1.86和1.81倍。根據(jù)慣例，把蛋白百分體積比值大于1.80或小于0.55作為差異顯著的判定標準，這說明3個30K蛋白的表達量在熱激處理后顯著上調(diào)，意味著它們很可能參與熱激應(yīng)答。

采用KinasePhos軟件預(yù)測3個蛋白的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)PBMHPC-6和PBMHPC-12各有6個位點可能會發(fā)生磷酸化，PBMHPC-19有4個位點(表2)。以PBMHPC-6為例，6個位點共預(yù)測出10個可選修飾。根據(jù)E值和隱馬爾科夫得分剔除假陽性率高的修飾，得到了第34、76、140、169、217和239位氨基酸上的可能修飾，以及5種磷酸化蛋白激酶(表3)。

3討論

30K蛋白是家蠶血液中豐度比較高的一類蛋白質(zhì)，其表達具有時空特異性[14]。半定量PCR結(jié)果顯示，家蠶大部分的30K蛋白基因活性在五齡第3天起上升，五齡第4天開始到吐絲期活性最高[15]。Sun等[14]對家蠶血液進行了雙向電泳和質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個不同的30K蛋白被多次檢測到，推測其多樣化可能與蛋白質(zhì)的磷酸化有關(guān)。隨后，他們用SignalP程序?qū)?0K蛋白的氨基酸序列信號肽進行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的基因都含有信號肽，說明它們具有分泌性蛋白的屬性。因為30K蛋白序列同源性較高，加之分子質(zhì)量大小相似，所以其分離純化是一個復(fù)雜的過程。從本試驗的結(jié)果來看，30K蛋白聚集在一起呈現(xiàn)膠著狀態(tài)(圖2)，很難通過Imagemaster軟件對銀染圖進行定量分析。而本試驗借鑒前人的研究，采用Pro-Q Diamond染料對這些蛋白進行特異性染色，既保證了試驗較高的靈敏性，還可以與質(zhì)譜鑒定兼容[15]。本試驗正是借助了Pro-Q Diamond熒光染色法的優(yōu)點使得30K蛋白得以分開。

表1　家蠶血液中30K蛋白的質(zhì)譜鑒定

表2　3個30K蛋白磷酸化預(yù)測位點

表3　PBMHPC-6磷酸化預(yù)測位點

Sun等[14]基于家蠶基因組圖譜和30K蛋白基因序列整合了10個30K蛋白的基因，發(fā)現(xiàn)5個基因Bmlp1、Bmlp4、Bmlp7、Bmlp8和Bmlp10都有1個核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)結(jié)合位點，該因子的主要功能是調(diào)節(jié)與免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達。Yang等[15]對家蠶血漿30K蛋白進行了天然分離、重組表達和結(jié)構(gòu)解析，認為Bmlp7的N段區(qū)域(NTD)可能具有結(jié)合脂的能力，而C段區(qū)域(CTD)存在結(jié)合糖的潛在位點，因而可能間接的參與昆蟲的天然免疫反應(yīng)。通過本試驗對熒光圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)30K蛋白在短時間的熱激之后都呈現(xiàn)表達顯著上調(diào)的趨勢。這是否暗示著30K蛋白的功能可能與脅迫應(yīng)答有關(guān)？有研究發(fā)現(xiàn)溫度脅迫可以引起甘藍22.9K蛋白的磷酸化現(xiàn)象，而且在逆境溫度處理10 min內(nèi)，磷酸化蛋白含量升高[16]。這個結(jié)果在本試驗中得到了進一步的驗證，暗示了蛋白質(zhì)磷酸化在逆境脅迫中的作用。另外，由于蛋白質(zhì)的磷酸化和激酶有關(guān)，而且磷酸化位點主要發(fā)生于酪氨酸、絲氨酸與蘇氨酸殘基上[17]，因此大量的預(yù)測磷酸化位點的工具得到了開發(fā)。本試驗借助KinasePhos軟件對3個30K蛋白(PBMHPC-6、PBMHPC-19和PBMHPC-12)的磷酸化位點進行了預(yù)測，為進一步研究它們的磷酸化提供了參考，但是具體位點和作用激酶仍需要經(jīng)過試驗的驗證。

4結(jié)論

① 40 ℃熱激家蠶10 min后有3個30K蛋白(PBMHPC-6、PBMHPC-19和PBMHPC-12)發(fā)生了磷酸化。這3個30K蛋白熱激后表達量顯著上調(diào)，說明30K蛋白很可能參與熱激應(yīng)答。

② KinasePhos軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)30K蛋白PBMHPC-6和PBMHPC-12各有6個位點可能會發(fā)生磷酸化，而PBMHPC-19僅有4個位點可能會發(fā)生磷酸化。

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(責(zé)任編輯菅景穎)

Study on 30K Protein Phosphorylation of Silkworm Haemolymph under Heat Shock

LI Na1JIA Manli1YANG Guiming1LI Jisheng1,2*

(1. Sericulture Institute of Chengde Medical University, Hebei Universities R&D Centre for Sericulture and Specialty Enabling Technologies, Chengde 067000, China; 2. College of Animal Sciences,Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

Abstract:This experiment was conducted to investigate the expression changes of phosphorylated protein in silkworm haemolymph under heat shock, and provided a reference for further study of its function. Two groups were designed, and 30 fifth-instar silkworms (half male and half female) were randomly divided in each group, and treated with heat shock under 40 ℃ for 0 (control group) and 10 min (heat shock group), respectively. The differentially expressed phosphorylation proteins were studied utilizing two-dimensional electrophoresis, Pro-Q Diamond dye and mass spectrometry. The results showed as follows: 1) amount of proteins were accumulated in the 30 ku area of silver staining map and revealed as phosphorylated proteins by Pro-Q Diamond dyeing. 2) Three 30K proteins were identified as PBMHPC-6, PBMHPC-19 and PBMHPC-12 by multiple sampling and mass spectrometry identification. 3) Compared with 0 min heat shock, the expression levels of three 30K proteins were significantly up-regulated after 10 min heat shock (P<0.05). It is concluded that fifth-instar silkworm haemolymph are rich in 30K proteins. These proteins not only play important roles in lipid transport, but also may involve in heat shock response.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(6)：1720-1725]

Key words:heat shock; silkworm; haemolymph; 30K proteins; phosphorylation； two-dimensional electrophoresis

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.012

收稿日期：2015-12-18

基金項目：河北省教育廳資助項目(Q2012026,ZD2016044)

作者簡介：李娜(1981—)，女，河北邢臺人，助理研究員，碩士，主要研究方向動物遺傳學(xué)。E-mail： liyunxiao2008@163.com *通信作者：李季生，副研究員，E-mail: jshlee@163.com

中圖分類號：S881.24

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)06-1720-06

*Corresponding author, associate professor, E-mail: jshlee@163.com