高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（J XA1-R株）微載體懸浮培養(yǎng)工藝研究

徐宏軍，韓　燾，岳豐雄，周　智，舒經(jīng)香，翟新驗(yàn)，胡來(lái)根，楊漢春（.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀009；.成都天邦生物制品有限公司，四川成都6000；.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京朝陽(yáng)005）

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高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（J XA1-R株）微載體懸浮培養(yǎng)工藝研究

徐宏軍1，2，韓燾3，岳豐雄2，周智3，舒經(jīng)香2，翟新驗(yàn)3，胡來(lái)根2，楊漢春1
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.成都天邦生物制品有限公司，四川成都610100；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京朝陽(yáng)100125）

摘要：為了建立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的Marc-145微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝以提高HPPRRSV抗原效價(jià)，以BC-7L生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，對(duì)HP-PRRSV接毒時(shí)間、接毒劑量、維持液血清濃度、溶氧量參數(shù)、病毒增殖溫度等工藝參數(shù)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)逐級(jí)放大工藝，在BC-100L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，以優(yōu)化后HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行3個(gè)批次的病毒懸浮培養(yǎng)。結(jié)果在Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的第4天按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1的劑量接毒，接毒后以2%新生牛血清的維持液進(jìn)行維持培養(yǎng)，溶氧參數(shù)設(shè)置為40%，最佳培養(yǎng)溫度為37℃，最佳收獲病毒時(shí)間為70～74 h。BC-100L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的3批病毒增殖曲線與BC-7L培養(yǎng)的病毒增殖曲線相近，在接毒后72 h左右達(dá)到病毒效價(jià)高峰，病毒含量均不低于108.0TCID50/mL。表明HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)工藝穩(wěn)定，可以實(shí)現(xiàn)逐級(jí)放大、規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；微載體；生物反應(yīng)器；懸浮培養(yǎng)

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的接觸性傳染病，主要引起母豬懷孕后期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙。20世紀(jì)80年代美國(guó)首先報(bào)道PRRSV，后迅速傳播至世界各個(gè)養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家。我國(guó)于1996年首次分離到該病毒。2006年，我國(guó)多個(gè)省份的養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情，其中商品豬的死亡率超過(guò)50%，母豬死亡率也高達(dá)5%以上，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。目前HP-PRRSV毒株已經(jīng)成為我國(guó)的主要流行（優(yōu)勢(shì)）株，并在我國(guó)周邊國(guó)家也出現(xiàn)該病的流行。

目前該病的主要防控措施為疫苗免疫，然而我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗種類多，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。本研究旨在通過(guò)微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)提高HP-PRRSV半成品培養(yǎng)效價(jià)，進(jìn)而提高該病疫苗質(zhì)量。誕生于20世紀(jì)60年代的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，能夠獲得大量的病毒產(chǎn)物和高質(zhì)量的疫苗產(chǎn)品，在國(guó)外疫苗生產(chǎn)中普遍應(yīng)用[1]。細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)不僅可以提高單位體積內(nèi)的細(xì)胞量、提高病毒產(chǎn)品效價(jià)，同時(shí)還具有勞動(dòng)成本低、產(chǎn)品批間差異小等優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)物細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)過(guò)近50年的發(fā)展，目前已成功應(yīng)用于流感等多種疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中[2-3]。在國(guó)外，細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達(dá)到6t反應(yīng)器自動(dòng)控制的生產(chǎn)規(guī)模，生產(chǎn)效能呈幾何級(jí)數(shù)放大，而我國(guó)微載體培養(yǎng)技術(shù)還處于起步階段，未來(lái)必將成為我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)的主流技術(shù)之一。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與毒種Marc-145細(xì)胞和HP-PRRSV （JXA1-R株）由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。HP-PRRSV（JXA1-R株）基礎(chǔ)種子批（編號(hào)JXA1-R-JC-0002），由成都天邦生物制品有限公司提供。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清，均購(gòu)自GIBCO公司；硅化劑PlusOne Repel-Silane ES，購(gòu)自GE公司；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭籆ytodexⅠ型微載體，購(gòu)自GE公司。

1.3主要器材BC-7L、BSISL-42L、BC-100L生物反應(yīng)器。

1.4Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)常規(guī)方法復(fù)蘇Marc-145細(xì)胞，按照已確定的Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝在BC-7L生物反應(yīng)器中進(jìn)行Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)見表1。

1.5HP-PRRSV微載體懸浮培養(yǎng)最佳工藝參數(shù)優(yōu)化按Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分別對(duì)（1）細(xì)胞接毒時(shí)間：在細(xì)胞生長(zhǎng)3、4、5日（方案1、2、3）接毒；（2）接毒劑量：按MOI= 0.01、MOI=0.05、MOI=0.1和MOI=0.2（方案1、2、3、4）接毒；（3）維持液血清濃度：以含1%、2%、4%血清的DMEM培養(yǎng)液（方案1、2、3）作為接毒后細(xì)胞維持液；（4）溶氧量：以30%、40%、50%的溶氧參數(shù)（方案1、2、3）進(jìn)行病毒增殖；（5）增殖溫度：以35℃、36℃、37℃的培養(yǎng)溫度（方案1、2、3）進(jìn)行病毒增殖；在優(yōu)化各參數(shù)時(shí)，其他對(duì)應(yīng)參數(shù)固定不變。接毒24 h后，每隔6 h取樣測(cè)定TCID50[4]，持續(xù)取樣到84 h，分別繪制病毒增殖曲線。

1.6HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)工藝重復(fù)性驗(yàn)證利用1.5試驗(yàn)中（1）～（5）篩選確定的病毒增殖參數(shù)，對(duì)HP-PRRSV（JXA1-R株）的增殖進(jìn)行驗(yàn)證，連續(xù)重復(fù)3批。

1.7HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)逐級(jí)放大工藝研究與驗(yàn)證以優(yōu)化好的Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝在BC-7L生物反應(yīng)器中進(jìn)行Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，按生物反應(yīng)器常規(guī)轉(zhuǎn)罐技術(shù)操作，轉(zhuǎn)入BSISL-42L生物反應(yīng)器進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到要求后，再入BC-100L生物反應(yīng)器進(jìn)行三級(jí)培養(yǎng)。待BC-100L生物反應(yīng)器細(xì)胞密度符合要求時(shí)，按優(yōu)化確定的HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行接毒與病毒培養(yǎng)，接毒48 h后每隔6 h進(jìn)行取樣測(cè)定病毒含量，監(jiān)測(cè)病毒增殖情況。按照以上方法重復(fù)開展3批HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)工藝驗(yàn)證。

2　結(jié)果

2.1病毒最佳接毒時(shí)間確定3批懸浮培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞分別在細(xì)胞生長(zhǎng)的第3天、4天、5天接毒，繪制3批病毒增殖曲線見圖1，細(xì)胞生長(zhǎng)3日觀察，長(zhǎng)滿單層，但不致密，細(xì)胞數(shù)為1.49×106個(gè)/mL，此時(shí)接毒進(jìn)行HP-RRSV增殖，毒價(jià)整體較低。細(xì)胞生長(zhǎng)4日后細(xì)胞數(shù)為2.43×106個(gè)/mL，培養(yǎng)第5天細(xì)胞數(shù)為2.78×106個(gè)/mL。從病毒增殖曲線可以看出，細(xì)胞生長(zhǎng)3日后接毒和4、5日后接毒病毒增殖曲線差異顯著，細(xì)胞生長(zhǎng)4日后和5日后接毒病毒增殖曲線差異不顯著。而細(xì)胞生長(zhǎng)5天后代謝產(chǎn)物較第4天多，死細(xì)胞數(shù)量增加，生產(chǎn)周期延長(zhǎng)。本試驗(yàn)確定最佳接毒時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)第4天。

圖1　不同時(shí)間接種HP-PRRSV病毒增殖曲線

2.2病毒增殖接毒劑量?jī)?yōu)化分別以不同MOI接種HP-PRRSV，接毒后不同時(shí)間取樣繪制4批病毒增殖曲線見圖2，從曲線圖上可以看出接毒劑量MOI=0.1時(shí)，病毒增殖效果最佳，與其他接毒劑量方案的病毒增殖曲線相比差異顯著。接毒后72 h病毒效價(jià)達(dá)到最高峰，隨后病毒效價(jià)出現(xiàn)降低。

圖2　不同接種HP-PRRSV劑量病毒增殖曲線

2.3病毒增殖維持液血清濃度優(yōu)化以不同血清濃度的DMEM作為維持液，接毒后不同時(shí)間取樣繪制病毒增殖曲線見圖3。從病毒生長(zhǎng)曲線看出，維持液血清濃度為2%和4%的病毒效價(jià)較1%高，差異顯著。2%血清濃度與4%血清濃度病毒增殖曲線相近，差異不顯著。但考慮生產(chǎn)實(shí)際的成本問(wèn)題，本試驗(yàn)確定最佳維持液血清濃度為2%。

圖3　不同血清濃度實(shí)驗(yàn)病毒增殖曲線

2.4病毒增殖最佳溶氧參數(shù)確定以不同DO值進(jìn)行病毒增殖，接毒后不同時(shí)間取樣繪制病毒增殖曲線見圖4。從病毒增殖曲線看出，當(dāng)DO值為40%以上時(shí)病毒增殖效價(jià)高于30%，差異顯著。與50%時(shí)病毒增殖效價(jià)相近，無(wú)顯著差異?？紤]生產(chǎn)成本因素，確定40%的DO值為病毒增殖的最佳溶氧參數(shù)。

圖4　DO值參數(shù)影響病毒增殖曲線

2.5病毒增殖溫度優(yōu)化以不同病毒培養(yǎng)溫度進(jìn)行病毒增殖，接毒后不同時(shí)間取樣繪制病毒增殖曲線見圖5。從病毒增殖曲線看出，35℃的病毒增殖效果最差，差異極顯著。36℃和37℃病毒增殖曲線相近，無(wú)顯著差異?？紤]到環(huán)境溫度變化對(duì)細(xì)胞有一定影響，選用37℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.6病毒增殖最優(yōu)參數(shù)重復(fù)驗(yàn)證驗(yàn)證結(jié)果見圖6。圖中可見3批病毒增殖曲線較為接近，毒價(jià)最高達(dá)到108.5TCID50/mL，最佳收毒時(shí)間為接毒后70～74 h，3批次病毒培養(yǎng)參數(shù)重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果無(wú)顯著差異。

2.7HP-PRRSV懸浮培養(yǎng)逐級(jí)放大工藝研究工藝放大和重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果顯示，病毒增殖情況良好，增殖趨勢(shì)一致。在接毒70～74 h內(nèi)病毒增殖達(dá)到高峰，且病毒含量均不低于108.0TCID50/mL。批間培養(yǎng)效果差異不顯著。病毒增殖曲線見圖7。

3　討論

應(yīng)用新型現(xiàn)代化的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制造動(dòng)物疫苗抗原是當(dāng)前我國(guó)動(dòng)物疫苗的主流發(fā)展趨勢(shì)之一。豬繁殖與呼吸綜合征作為我國(guó)核心的動(dòng)物疫病之一，其疫苗生產(chǎn)工藝的懸浮化對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本具有重要的意義。HP-PRRS弱毒活疫苗因具有比滅活疫苗抗體產(chǎn)生快、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、保護(hù)力強(qiáng)等[5-6]諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)目前預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的主要疫苗產(chǎn)品。本研究通過(guò)對(duì)HP-PRRSV疫苗毒懸浮培養(yǎng)工藝研究，摸索出科學(xué)、穩(wěn)定的PRRSV細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝替代現(xiàn)有的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，克服其病毒培養(yǎng)效價(jià)低、批間差異大、污染因素多、難于控制等缺陷[7]，顯著提高HP-PRRSV半成品培養(yǎng)效價(jià)和生產(chǎn)效率，為最終全面提高HP-PRRSV活疫苗質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

圖6　病毒增殖工藝驗(yàn)證病毒增殖曲線圖

圖7　BC-100L生物反應(yīng)器培養(yǎng)HP-PRRSV病毒增殖曲線圖

本試驗(yàn)基于Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的技術(shù)上開展高致病性豬繁殖與呼吸綜合征懸浮培養(yǎng)工藝研究。系列試驗(yàn)結(jié)果顯示，在Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的第4天按照MOI=0.1的劑量接毒，接毒后以2%新生牛血清的維持液進(jìn)行維持培養(yǎng)，以40%溶氧量在37℃進(jìn)行病毒增殖，可以在接毒后70～74 h收獲到高效價(jià)HP-PRRSV病毒液，病毒效價(jià)在108.0TCID50/mL以上，最高效價(jià)可達(dá)108.5TCID50/mL，比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝制備的HPPRRSV抗原效價(jià)提高了10倍以上。為適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)，本試驗(yàn)還進(jìn)行了懸浮工藝放大研究，在BC-100L生物反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)的3批HPPRRSV，病毒增殖曲線與BC-7L培養(yǎng)的病毒增殖曲線相近，在接毒后72 h左右達(dá)到病毒效價(jià)高峰，病毒含量均不低于108.0TCID50/mL，證實(shí)了該懸浮培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定性和可放大性。本次工藝放大和重復(fù)性驗(yàn)證過(guò)程中3次培養(yǎng)的病毒增殖曲線雖然整體趨勢(shì)一致，且培養(yǎng)效果均達(dá)到了預(yù)期水平，但在同一采樣時(shí)間點(diǎn)上的病毒效價(jià)測(cè)定結(jié)果仍然存在一定差異（<0.5TCID50/mL），經(jīng)分析造成這種差異的可能原因是：不同批次各采樣時(shí)間點(diǎn)樣品在測(cè)定TCID50時(shí)的系統(tǒng)誤差及結(jié)果判定時(shí)人為誤差導(dǎo)致的，后續(xù)仍需要通過(guò)生產(chǎn)及檢驗(yàn)控制加以改進(jìn)。

本試驗(yàn)利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)適用于多數(shù)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加微載體，讓細(xì)胞貼附在微載體表面進(jìn)行生長(zhǎng)，可以有效提高單位體積內(nèi)的細(xì)胞量，提高接種病毒效價(jià)。高效價(jià)的半成品抗原，可以通過(guò)稀釋進(jìn)行配苗，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性提供了有效保障，同時(shí)可以減少每頭份疫苗中雜蛋白含量，減少疫苗免疫的副反應(yīng)。無(wú)論是對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的提升以及對(duì)成本的控制，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝相比都具有較大的優(yōu)勢(shì)[8]。

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Study on the Process of Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus（HP-PRRSV J XA1-R strain）Microcarrier Suspension Culture

XU Hong-jun1，2，HAN Tao3，YUE Feng-xiong2，ZHOU Zhi3，SHU Jing-xiang2，ZHAI Xin-yan3，HU Lai-gen2，YANG Han-chun1
（1.China agricultural university college of Veterinary Medicine，Beijing 100193，China；2.Chengdu Teck-bank bio-products co.，LTD，Chengdu 610100，China；3.Chinese animal disease center，Beijing 100125，China）

Abstract：To increase the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus（HP-PRRSV）titer by the es?tablishment of Marc-145 cell microcarrier suspension culture process.The optimal tests for HP-PRRSV inoculated timeand quanti?ty，serum concentration of maintaining medium dissolved oxygen（DO），and culture temperature were performed on microcarrier suspension cultured Marc-145 cells in BC-7L bioreactor.The optimized parameters were also verified in BC-100L bioreactor fol?lowing Marc-145 cell suspension culture amplifying process.The results showed that the best viral inoculation time was 4 h after Marc-145 cell suspension culture，and the best viral inoculation quantity was 0.1 of MOI.The suspending cells were cultured with DMEM medium containing 2% of newborn calf serum at 37℃and the DO parameter was set to 40%.The viral proliferation curves of HP-PRRSV in BC-100L bioreactor were similar to that in BC-7L biological reactor .The viral titer peak appeared around 72 h after inoculation and the viral titer was more than 108.0TCID50/mL.HP-PRRSV suspension culture process is stable and can be used to produce large-scale virus particles in BC-100L bioreactor.

Key words：HP-PRRSV；Microcarrier；Biological Reactor；Suspension Culture Corresponding author：YANG Han-chun

中圖分類號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0024-04

收稿日期：2016-01-20

作者簡(jiǎn)介：徐宏軍（1975-），男，獸醫(yī)師，博士，從事動(dòng)物疫苗研發(fā)工作，E-mail：5401737@qq.com

通訊作者：楊漢春，E-mail：yanghanchun1@cau.edu.cn