豬FcγRIII雙抗體夾心ELISA方法的建立及其在PRRSV感染豬中的初步應(yīng)用

谷偉紅，郭龍軍，牛軍偉，田志軍，馮　力，王玉娥

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001）

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豬FcγRIII雙抗體夾心ELISA方法的建立及其在PRRSV感染豬中的初步應(yīng)用

谷偉紅，郭龍軍，牛軍偉，田志軍，馮力，王玉娥

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001）

摘要：利用自行制備的FcγRIII多克隆抗體作為捕獲抗體，鼠源抗FcγRIII特異性單克隆抗體作為示蹤抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG作為檢測系統(tǒng)，建立了檢測可溶性FcγRIII（sFcγRIII）水平的雙抗體夾心ELISA方法。利用建立的該ELISA方法對感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，豬感染PRRSV后，血清中sFcγRIII的水平明顯增高，因此sFcγRIII的水平可能作為PRRSV感染的預(yù)警標(biāo)志。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡釋FcγRIII 在PRRSV感染中發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：FcγRIII；多克隆抗體；夾心ELISA；豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒

Fc受體（Fc receptor，F(xiàn)cR）是廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞的一類重要免疫細(xì)胞表面分子，通過特異親和抗體（Immunoglobulin，Ig）Fc區(qū)域，觸發(fā)和調(diào)控機(jī)體多種免疫學(xué)效應(yīng)，包括吞噬功能、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）、一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌等[1]。Fc受體主要有3種類型：FcγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII。其中FcγRIII是一種低親和力的IgG Fc受體，F(xiàn)cγRIII會(huì)在細(xì)胞表面水解，釋放出可溶性FcγRIII（sFcγRIII）。據(jù)報(bào)道，在人的血清中存在著約1.3 μg/mL sFcγRIII，這些大量存在的sFcγRIII主要是由嗜中性粒細(xì)胞釋放的作用[3]。血清中sFcγRIII水平可作為一些疾病的檢測標(biāo)志，在疾病的防控中發(fā)揮著重要作用。例如，多發(fā)性骨髓瘤病人血清中sFcγRIII的水平大大下降，并且減少的程度與發(fā)病的階段有關(guān)[4]，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清中sFcγRIII水平比正常水平高很多[5]，艾滋病病人血清中sFcγRIII水平遠(yuǎn)低于正常水平[6]。目前尚無豬的sFcγRIII的ELISA檢測方法的報(bào)道，為了探究豬在感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）后血清中sFcγRIII水平變化，本研究利用制備的豬FcγRIII多克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELISA法，來檢測豬的sFcγRIII水平。

1　材料與方法

1.1載體、質(zhì)粒、細(xì)胞、毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物pET-30a原核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存載體；豬的全長真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/FcγRIII為本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒；3只新西蘭雌性白兔，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑蛋白純化試劑盒，購自Novagen公司；BCA Protein Assay Kit，購自GenStar公司；FcγRIII單克隆抗體G7，購自AbD公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG，購自中衫金橋生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液，購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I，購自TaKaRa公司。

1.3FcγRIII原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建從全長真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/FcγRIII中，利用表1中引物F、R，PCR擴(kuò)增FcγRIII胞外域，PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，克隆到同樣經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切、回收處理的原核表達(dá)載體pET-30a中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a/FcγRIII。EcoR I和Xho I雙酶切鑒定陽性的重組質(zhì)粒由上海華大基因科技服務(wù)有限公司測序驗(yàn)證。

表1　PCR引物

1.4重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的純化將序列分析陽性的重組質(zhì)粒pET-30a/FcγRIII轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂板后過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落接種于Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，以1∶100菌液比例轉(zhuǎn)接入錐形瓶中，待OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入IPTG（1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，從0 h開始，每隔1 h收集菌液，直到7 h。將收集的菌液離心并進(jìn)行超聲破碎，上清和沉淀分別在SDS-PAGE電泳下檢測。選取目的蛋白表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行大量培養(yǎng)及蛋白純化，蛋白純化采用Novagen的His.Band蛋白純化試劑盒，按照試劑盒的說明書進(jìn)行純化，BCA試劑盒測定純化FcγRIII蛋白的濃度。

1.5多克隆抗體的制備將上述純化的FcγRIII蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合充分乳化，免疫家兔，每只家兔的劑量1 mg/次。初次免疫進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射，之后為皮下注射。2周后以等體積弗氏不完全佐劑與純化的FcγRIII蛋白充分乳化進(jìn)行第2，3，4次加強(qiáng)免疫。免疫4次后心臟采血，分離血清。

1.6夾心ELISA方法的建立與應(yīng)用將制備的多克隆抗體作為捕獲抗體，進(jìn)行系列稀釋包被酶標(biāo)板，確定最適濃度包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗5次。用2%胎牛血清白蛋白（BSA）300 μL/孔，室溫封閉2 h，PBST洗5次。純化的FcγRIII蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，室溫孵育2 h，PBST洗5次。FcγRIII單克隆抗體G7作為示蹤抗體，確定最佳濃度，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗5次。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為檢測系統(tǒng)，確定最適濃度，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗5次。TMB顯色，100 μL/孔，室溫5～10 min，以2 mol/L H2SO450 μL/孔終止顯色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上于波長450 nm測定吸光度值。利用建立的ELISA方法檢測豬感染PRRSV后，血清中sFcγRIII水平。

圖1　pET-30a/FcγRIII質(zhì)粒的構(gòu)建

2　結(jié)果

2.1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定從質(zhì)粒pcD?NA3.1/FcγRIII中，利用引物F、R，進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1a所示，擴(kuò)增產(chǎn)物約570 bp，與預(yù)期大小相符。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切后獲得約5 422 bp與570 bp的兩條片段，與預(yù)期長度相符，命名為pET-30a/FcγRIII（圖1b），且重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明目的基因被正確無誤地克隆至原核表達(dá)載體，可用于下游工作。

2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a/FcγRIII轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Rosetta中，經(jīng)IPTG（1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示目的蛋白CD16高效表達(dá)，大小約為25 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，且主要存在于包涵體中（圖2a）。利用Novagen的His.Bind蛋白純化試劑盒，對融合蛋白FcγRIII進(jìn)行純化，取少量純化后的蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白純化效果，結(jié)果顯示，純化的蛋白FcγRIII純度較好，濃度較高（圖2b）。

2.3夾心ELISA方法的建立與初步應(yīng)用確定FcγRIII多克隆抗體最適包被濃度為1∶1 000，F(xiàn)cγRIII單克隆抗體最適濃度為1∶2 500，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG最適濃度為1∶10 000。BCA法測定的純化的蛋白濃度為1 mg/mL，將純化的蛋白進(jìn)行倍比稀釋，確定最適稀釋度為從31.25 ng/mL進(jìn)行2倍的倍比稀釋，直到0.06 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線形成良好，R值為0.999（圖3a）。利用建立的夾心ELISA方法檢測12份PRRSV陽性與陰性血清，結(jié)果顯示，豬感染PRRSV后，血清中sFcγRIII的水平明顯高于陰性豬（圖3b）。

圖2　重組蛋白的表達(dá)與純化

圖3　a標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　b ELISA檢測豬血清中sFcγRIII水平

3　討論

在HIV的研究中發(fā)現(xiàn)HIV病人血清中sFcγRIII水平遠(yuǎn)低于正常人，而sFcγRIII能抑制HIV病毒的復(fù)制，在控制HIV的傳播中發(fā)揮著重要作用[7]。PRRSV感染豬體后，感染豬的多形核白細(xì)胞（PMN）細(xì)胞表面FcγRIII水平下降，PMN的吞噬能力下降[8]?？梢奆cγRIII在一些疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)cγRIII可在細(xì)胞表面發(fā)生水解，在上清中產(chǎn)生sFcγRIII，檢測sFcγRIII的水平就尤為重要。目前常用的檢測sFcγRIII的水平方法是將上清濃縮后進(jìn)行Western-Blot[9]和ELI?SA[7]的方法，但前者敏感性比較低，低水平的sFcγRIII難以檢測到，而ELISA方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，但目前尚無豬的sFcγRIII的ELISA檢測方法的報(bào)道。本研究利用制備的FcγRIII的多克隆抗體作為捕獲抗體，F(xiàn)cγRIII單克隆抗體又作為示蹤抗體，建立了ELISA方法。利用建立的豬的sFcγRIII的雙抗體夾心ELISA方法檢測感染PRRSV的豬體內(nèi)血清中sFcγRIII水平，結(jié)果顯示，感染PRRSV的豬體內(nèi)血清中sFcγRIII水平明顯高于對照組，因此推測在PRRSV的感染中，豬體內(nèi)sFcγRIII水平可起到預(yù)警的作用，為PRRSV的防控提供新的思路。

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Development a doubleantibody sandwich ELISA to detect porcine FcγRIII and primary application in pigs infected with PRRSV

GU Wei-hong，GUO Long-jun，NIU Jun-wei，TIAN Zhi-jun，F(xiàn)ENG Li，WANG Yu-e （State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

Abstract：A double antibody sandwich ELISA was developed using rabbit anti-FcγRIII polyclonal antibody as the capture an?tibody，mouse anti-FcγRIII monoclonal antibody as the trace antibody and HRP-conjugated goat anti-mouse IgG as the detection system.The sandwich ELISA was used to detect porcine FcγRIII levels in serum from pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）.Our the results revealed that sFcγRIII levels in serum were significantly increased in pigs in?fected with PRRSV，suggesting that sFcγRIII may be referred as early warning of PRRSV infection.These results have laid a foun?dation for futher study on interpretation of FcγRIII in PRRSV infection.

Key words：FcγRIII；polyclonal antibody；sandwich ELISA；porcine reproductive and respiratory syndrome virus

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0003-03

收稿日期：2015-04-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31372416）

作者簡介：谷偉紅（1988-），女，碩士生，主要從事動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)研究，E-mail：weihgu@163.com

通訊作者：王玉娥，E-mail：wangyue@caas.cn

Corresponding author：WANG Yu-e