HDAC1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

馬珊珊， 張 琨， 邢 衢， 黃團(tuán)結(jié)， 程 康， 關(guān)方霞

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

HDAC1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

馬珊珊， 張 琨， 邢 衢， 黃團(tuán)結(jié)， 程 康， 關(guān)方霞

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

利用Ad-Easy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有人源性組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因的重組腺病毒，并檢測其在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)中的表達(dá)及對hUC-MSCs增殖的影響.RT-PCR擴(kuò)增人HDAC1 ORF序列，構(gòu)建pAdTrack-CMV-HDAC1重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，PmeI單切后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBJ5183與腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組，PacI單切線性化后轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中擴(kuò)增和包裝pAd-HDAC1，采用空斑法鑒定病毒滴度；pAd-HDAC1感染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，qRT-PCR和Western Blot分別檢測細(xì)胞中HDAC1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測HDAC1高表達(dá)對hUC-MSCs增殖的影響.結(jié)果顯示成功擴(kuò)增人 HDAC1 ORF 序列并構(gòu)建pAd-HDAC1重組腺病毒；病毒感染后hUC-MSCs中HDAC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高，并且促進(jìn)hUC-MSCs的增殖.成功構(gòu)建HDAC1高表達(dá)的腺病毒，可有效提高h(yuǎn)UC-MSCs中HDAC1的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖.

組蛋白去乙酰化酶1； 腺病毒載體； 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 增殖

0 引言

組蛋白乙?；揎検且环N表觀遺傳修飾，它不改變細(xì)胞DNA 序列，通過組蛋白乙?；?histone acetylases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，在干細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等多種生物過程中發(fā)揮重要作用[1].哺乳動物細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了18種HDACs[2]，在干細(xì)胞增殖和定向分化研究中關(guān)注較多的是HDAC1.目前研究較多的是使用基因缺失技術(shù)或者化學(xué)抑制劑抑制HDAC1的功能，分析其對干細(xì)胞分化的影響.研究表明，缺失HDAC1基因?qū)е?ESCs 分化水平提高，并提高 ESCs中心肌細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)記基因的表達(dá)[3].SAHA(HDAC抑制劑)通過提高心肌和平滑肌發(fā)育相關(guān)基因啟動子的乙?；?，促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌和平滑肌細(xì)胞定向分化[4].但是HDAC1高表達(dá)對人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)的增殖和分化的影響還未見明確報道.為此，本研究利用Ad-Easy腺病毒載體構(gòu)建含有HDAC1基因的重組腺病毒，并制備出病毒，感染hUC-MSCs，探究改變hUC-MSCs中HDAC1表達(dá)活性后對其增殖的影響，為深入研究HDAC1的雙向調(diào)控對hUC-MSCs增殖和神經(jīng)分化的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

引物合成、測序、鼠抗人HDAC1、鼠抗人GAPDH抗體在生工生物工程(上海)股份有限公司完成或購買； RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒和Western Blot等試劑購自TaKaRa公司.CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司； hUC-MSCs為實(shí)驗(yàn)室前期分離、鑒定和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞.

1.2 HDAC1重組腺病毒載體的構(gòu)建和包裝

使用Ad-Easy腺病毒載體系統(tǒng)制備HDAC1重組腺病毒載體.RNA提取試劑盒提取hUC-MSCs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以5′-GATAAGGTACCATGGCGCAGACGCAGGGCAC-3′(正向)和5′-CGGGCAAGCTTTCAGGCCAACTTGACCTCCT-3′(反向，下劃線的堿基表示引入的酶切位點(diǎn))為引物RT-PCR擴(kuò)增HDAC1 ORF.然后將其插入到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV的KpnI和HindIII位點(diǎn)之間，構(gòu)成pAdTrack-CMV-HDAC1；測序驗(yàn)證后提質(zhì)粒，PmeI單切使質(zhì)粒線性化并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBJ5183菌株中，與腺病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy1)進(jìn)行同源重組后獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HDAC1；pAd-HDAC1經(jīng)PacI單切線性化后利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝.

1.3 pAd-HDAC1重組腺病毒的擴(kuò)增

HDAC1基因隨著重組腺病毒在感染的HEK293細(xì)胞中大量擴(kuò)增.當(dāng)HEK293細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細(xì)胞，液氮反復(fù)凍融4次，12 000 rpm離心10 min后取上清即可收獲大量重組腺病毒.

1.4 重組腺病毒的滴度測定

采用空斑法測定病毒滴度.pAd-HDAC1病毒原液用DMEM/高糖培養(yǎng)基以10倍梯度依次稀釋，分別感染對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞，使病毒稀釋液與細(xì)胞充分接觸，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入1 mL配好的瓊脂培養(yǎng)基使其均勻覆蓋細(xì)胞，待瓊脂培養(yǎng)基凝固后將板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育.每天于固定的時間觀察各孔中空斑形成情況，計數(shù)一次，待空斑數(shù)目穩(wěn)定不變(約7～10 d)時停止.根據(jù)孔中發(fā)生完全病變的細(xì)胞數(shù)量，計算出收集的腺病毒滴度(pfu/L).病毒感染滴度(pfu/L)=相同稀釋度空斑均數(shù)×稀釋倍數(shù)/病毒液體積.

1.5 pAd-HDAC1重組腺病毒感染hUC-MSCs

取第3代的hUC-MSCs，待其達(dá)到80%融合時，PBS漂洗1次加入感染復(fù)數(shù)為10 的pAd-HDAC1病毒進(jìn)行感染(感染組)，以正常培養(yǎng)的P3 hUC-MSCs作為對照組，以pAd-GFP空病毒感染P3 hUC-MSCs作為陰性對照組.將2組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光表達(dá)情況.

1.6 qRT-PCR檢測HDAC1 mRNA的表達(dá)

收集上述感染的hUC-MSCs，按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參.按照試劑盒說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，每組3個重復(fù)孔，利用Fast7500 Real Time System進(jìn)行PCR，95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后記錄擴(kuò)增曲線和溶解曲線，HDAC1的相對表達(dá)量(RQ)=2-ΔΔCt，以Graphpad Prism 5作圖.

1.7 Western Blot檢測HDAC1蛋白的表達(dá)

對上述3組細(xì)胞提取總蛋白，測定蛋白濃度后各取100 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳.切割目的蛋白條帶，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后用50 g/L的脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，鼠抗人HDAC一抗(1∶1 000稀釋)或鼠抗人GAPDH一抗(1∶500稀釋，作為內(nèi)參)4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次洗去一抗,每次15 min.用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗在室溫條件下溫孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影成像.

1.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)hUC-MSCs的增殖

將上述3組細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104/mL,分別取100 μL細(xì)胞接種于96孔板，每孔各接種3 000個細(xì)胞，每組設(shè)5個復(fù)孔.分別于1、2、3、4、5天后換成新鮮培養(yǎng)基，避光條件下每孔加10 μL CCK-8溶液并繼續(xù)培養(yǎng)2 h.酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞的生長曲線.

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用單因素方差分析 3組細(xì)胞中HDAC1 mRNA相對表達(dá)量和細(xì)胞吸光值的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 pAd-HDAC1重組腺病毒的構(gòu)建

提取hUC-MSCs的總RNA，獲得濃度較高純度較好的總RNA(圖1A).RT-PCR擴(kuò)增出大小為1 400 bp左右的條帶(圖1B)，測序后確定為人HDAC1序列.pAdTrack-CMV-HDAC1質(zhì)粒與pAdEasy1在BJ5183菌體內(nèi)同源重組后，PacI酶切鑒定得到1條大于23 kb的腺病毒基因組片段和1條4.5 kb的Ori和氨芐青霉素抗性編碼基因片段(圖1C)，表明 pAd-HDAC1重組腺病毒質(zhì)粒已成功構(gòu)建.

A：P0和P3代表hUC-MSCs總RNA的提取; B:RT-PCR擴(kuò)增人HDAC1 ORF序列; C: pAd-HDAC1質(zhì)粒電泳圖譜.M：marker；1：pAd-HDAC1重組質(zhì)粒；2：PacI單切線性化重組質(zhì)粒pAd-HDAC1.圖1 pAd-HDAC1重組腺病毒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant adenovirus pAd-HDAC1

2.2 重組腺病毒pAd-HDAC1的滴度測定

PacI線性化后的pAd-HDAC1，經(jīng)Lip2000轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝和大量擴(kuò)增.然后利用空斑法計算病毒滴度.在24孔板中接種293細(xì)胞，然后用不同濃度的病毒感染細(xì)胞，根據(jù)孔中發(fā)生細(xì)胞完全病變的細(xì)胞數(shù)量，計算出收集的pAd-HDAC1重組腺病毒滴度(pfu/L)約為2.1×1010pfu/ L.

2.3 pAd-HDAC1感染hUC-MSCs及HDAC的表達(dá)檢測

pAd-GFP和pAd-HDAC1感染hUC-MSCs 48 h后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到明顯的熒光(圖2B、C)，說明腺病毒已經(jīng)進(jìn)入hUC-MSCs.qRT-PCR和Western Blot檢測顯示pAd-HDAC1感染組中HDAC1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于空病毒組和對照組中的表達(dá)(圖2D、E).該結(jié)果說明pAd-HDAC1腺病毒已經(jīng)進(jìn)入hUC-MSCs并在細(xì)胞中成功表達(dá).

A:正常對照組；B：pAd-GFP組；C：pAd-HDAC1組；D：qRT-PCR檢測各組細(xì)胞HDAC1 mRNA的表達(dá)；E：Western Blot檢測HDAC1蛋白的表達(dá).圖2 pAd-HDAC1感染hUC-MSCs 48 h后熒光、qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果(100×)Fig.2 Fluorescence, qRT-PCR and Western Blot of hUC-MSCs infected by pAd-HDAC1 about 48 h (100×)

2.4 pAd-HDAC1對hUC-MSCs增殖的影響

如圖3所示，pAd-HDAC1感染組細(xì)胞的增殖速率明顯高于對照組細(xì)胞(P<0.05)，該結(jié)果說明HDAC1高表達(dá)能夠促進(jìn)hUC-MSCs的增殖.

圖3 各組hUC-MSCs細(xì)胞生長曲線Fig.3 The growth curves of hUC-MSCs in different groups

3 討論

HDACs 通過使組蛋白去乙?；c其他多種轉(zhuǎn)錄因子形成特定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致基因沉默，參與細(xì)胞增殖、分化等多種活動[1].研究表明MSCs定向誘導(dǎo)分化過程中，伴隨著HDAC1表達(dá)水平的下調(diào)[5].研究人員發(fā)現(xiàn)抑制HDAC的活性能夠促進(jìn)ESCs、NSCs或者M(jìn)SCs向神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等多種細(xì)胞定向分化[3,4,6-8].因此，為了體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的MSCs而避免MSCs的自發(fā)分化，可以通過提高HDAC1的表達(dá)而調(diào)控干細(xì)胞的增殖.

與脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，重組腺病毒表達(dá)載體[9]具有宿主范圍廣，感染效率高，毒性低、非整合宿主染色體等優(yōu)點(diǎn)[10].因此，本研究應(yīng)用Ad-Easy腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)[11]，即以攜帶 GFP 的腺病毒穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)和腺病毒骨架質(zhì)粒(pAd-Easy1)作為載體成功制備含有HDAC1基因的腺病毒.該病毒含有CMV 啟動子和GFP基因，可在熒光鏡下直接觀察感染效果，同時不會整合到宿主細(xì)胞基因組中，保證了實(shí)驗(yàn)的安全性.qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，pAd-HDAC1感染hUC-MSCs后,HDAC1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯提高，表明本研究成功構(gòu)建了HDAC1高表達(dá)的腺病毒(pAd-HDAC1)，并在干細(xì)胞中表達(dá).CCK-8結(jié)果顯示,HDAC1高表達(dá)能夠促進(jìn)hUC-MSCs的增殖，但是對hUC-MSCs定向分化的影響還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

因此，本研究采用Ad-Easy系統(tǒng)成功構(gòu)建了攜帶 GFP 的pAd-HDAC1重組腺病毒，pAd-HDAC1能有效感染hUC-MSCs，并促進(jìn)MSCs在體外的增殖.該結(jié)果為下一步在體內(nèi)水平研究pAd-HDAC1對hUC-MSCs增殖、定向分化和對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用奠定基礎(chǔ)，具有重要的研究意義.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Construction and Identification of Adenoviral Vector Containing Human HDAC1 Gene

MA Shanshan， ZHANG Kun， XING Qu， HUANG Tuanjie，CHENG Kang， GUAN Fangxia

(SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

It was aimed to construct a recombinant adenovirus containing human histone deacetylase 1 (HDAC1) gene by using Ad-Easy system and detect its effect on the proliferation of hUC-MSCs. Human HDAC1 ORF was generated by RT-PCR and inserted into the shuttle adenovirus plasmid to construct recombinant shuttle adenovirus plasmid (pAdTrack-CMV-HDAC1).The pAdTrack-CMV-HDAC1 was linearized byPmeI and transformed into BJ5183 to homologously recombine with pAdEasy1. After linearized byPacI, pAd-HDAC1 was transfected into HEK293 to package and amplify. The viral titer was determined by air-dilution method. After transfected into hUC-MSCs, the green fluorescence was observed by using fluorescent microscope. qRT-PCR and Western Blot were used to analyze the mRNA and protein expression of HDAC1 and CCK-8 assay was performed to detect the proliferation of hUC-MSCs. Recombinant adenovirus pAd-HDAC1 containing HDAC1 gene was successfully constructed. After transfected into hUC-MSCs, the mRNA and protein expression of HDAC1 in hUC-MSCs were increased significantly, and HDAC1 could promote the proliferation of hUC-MSCs. pAd-HDAC1 was successfully constructed, which can effectively improve expression of HDAC1 in hUC-MSCs and promote hUC-MSCs proliferation.

histone deacetylase 1; adenoviral vectors; umbilical cord mesenchymal stem cells; proliferation

2015-11-15

NSFC-河南人才聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1404313)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471306)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊項(xiàng)目(15IRTSTHN022)；河南省科技創(chuàng)新人才計劃項(xiàng)目(154200510008).

馬珊珊(1984—)，女，河南開封人，副教授，博士，主要從事干細(xì)胞與神經(jīng)修復(fù)研究，E-mail: mashanshan84@163.com；通訊作者：關(guān)方霞(1969—)，女，河南洛陽人，教授，博士，主要從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究，E-mail: guanfangxia@126.com．

馬珊珊，張琨，邢衢，等．HDAC1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2016，48(2)：101-104．

R394.2

A

1671-6841(2016)02-0101-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2015259