GFAP單克隆抗體制備及ELISA檢測方法研究

王 珂， 張守濤， 郭亞楠

(鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

GFAP單克隆抗體制備及ELISA檢測方法研究

王 珂， 張守濤， 郭亞楠

(鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

制備抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) 單克隆抗體，并嘗試建立雙抗夾心ELISA 檢測方法，為出血性腦卒中早期診斷提供基礎(chǔ)材料.用重組人GFAP作為抗原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備抗GFAP單克隆抗體；用HRP標記單克隆抗體，ELISA 和Western blot檢測抗體的亞類、表位和特異性；采用ELISA 技術(shù)制備GFAP檢測試劑盒.獲得了7株抗GFAP單克隆抗體，抗體亞類為IgG2或IgG1，抗體特異性好.抗體配對成功，ELISA檢測重組人GFAP靈敏且穩(wěn)定.

GFAP； 出血性腦卒中； 抗體； 酶聯(lián)免疫吸附檢測

0 引言

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是分子量為55 kDa的胞漿蛋白，最初從慢性多發(fā)性硬化癥患者的白質(zhì)斑塊中發(fā)現(xiàn)[1].進一步研究發(fā)現(xiàn)，GFAP蛋白至少含有以下3個功能域：氨基端“頭部”、羧基端“尾部”和中部螺旋桿狀區(qū)，屬于III型中間絲蛋白家族[2].大鼠、小鼠和人的GFAP基因已被克隆并測序，序列比對顯示，大鼠、小鼠和人的GFAP高度同源.其中，人的GFAP基因定位于染色體17q21區(qū)域[3].GFAP基因含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，還有4個可選擇的外顯子和2個可選擇的內(nèi)含子[4].截至目前，共計發(fā)現(xiàn)人類6種不同的GFAP轉(zhuǎn)錄本，其中第一個被發(fā)現(xiàn)、表達量最高的是GFAPα.大部分描述GFAP表達及其調(diào)控的論文包括本研究實際上指的是GFAPα[1,3].

星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AS)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各個部位，約占正常成年人腦細胞總數(shù)的40%[5].GFAP則是星形膠質(zhì)細胞特有的中間絲蛋白.研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞在發(fā)育成熟后GFAP表達明顯增加并貫穿一生[6].GFAP(-/-)小鼠中，星形膠質(zhì)細胞的中間絲顯著減少甚至完全沒有[7].因此GFAP不僅被認為是星形膠質(zhì)細胞的成熟標志，也成為正常及病理情況下應用最廣泛的星形膠質(zhì)細胞標記物[6].正常情況下，在細胞胞質(zhì)內(nèi)的GFAP循環(huán)降解，血液中GFAP水平較穩(wěn)定；然而病理條件下，如病人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，其星形膠質(zhì)細胞遭受破傷或壞死時，GFAP從膠質(zhì)細胞中流出，穿過血腦屏障進入血液中，使GFAP濃度上調(diào)[6,8].

腦卒中是指由于急性腦血液循環(huán)障礙所致的局部或全腦性功能缺損綜合征，包括缺血性和出血性腦卒中.腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復發(fā)率高的特點.在腦卒中發(fā)病早期，快速準確地診斷，對患者的治療和預后皆有顯著的幫助和提高[9].作為腦部損傷的新型標志物GFAP已經(jīng)被廣泛研究.有研究表明，出血性腦卒中患者發(fā)病6小時內(nèi)血液GFAP水平明顯升高；而缺血性腦卒中患者6小時內(nèi)血液中GFAP水平與正常對照組無明顯差異.因此GFAP在發(fā)病早期對出血性及缺血性腦卒中患者也具有早期鑒別診斷意義[10].還有研究表明，急性腦出血患者血清中的GFAP含量與腦出血體積之間有一定的正相關(guān)關(guān)系.因此檢測血清GFAP含量在出血后早期判斷腦損傷的程度及患者的預后也具有重要的臨床意義[4,9].檢測血清GFAP最理想的方法是ELISA，但前提是必須制備針對GFAP的特異性抗體.本研究制備的多株單克隆抗體與GFAP有較好的結(jié)合能力，并可組裝成抗體通過ELISA檢測GFAP，為臨床診斷提供了基礎(chǔ)材料，有助于臨床醫(yī)生診斷和評估腦卒中進展情況，改善病人的預后.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細菌菌株和細胞株 原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)和真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1(+)由本實驗室保存；大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α和BL21(DE3)購自康為生物；Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞株為本室液氮保存.

1.1.2 試劑 高保真Pfu酶、內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和柱式質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物；DNA marker、蛋白marker，異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)等分子生物學常用試劑購自康為生物；HRP標記的兔抗鼠IgG抗體購自優(yōu)寧維生物；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒，PEG4000、HT、HAT、弗氏完全和不完全佐劑購自Sigma；血清及培養(yǎng)基購自生工生物(上海)公司；引物或基因由金維智生物(北京)公司合成.親和層析柱料購自GE Healthcare(美國).

1.1.3 實驗動物 SPF 級BALB/C小鼠4只，4～6周齡由北京維通利華實驗動物有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 表達載體pET-28a(+)-GFAP和pCDNA3.1(+)-GFAP的構(gòu)建及鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫中查到人GFAP基因序列(登陸號：J04569.1)委托金維智生物(北京)公司合成GFAP基因部分序列(編碼氨基酸292-432).以合成基因為模板，序列28F：ATATGGATCCTTGACCTGCGACCTGGAG、28R：ATATCTCGAGCATCACATCCTTGTG為引物，通過PCR擴增目的片斷；然后用內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對PCR 產(chǎn)物和載體pET-28a(+)分別進行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，涂平板、篩選陽性克??；隨后提質(zhì)粒、BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證，陽性質(zhì)粒測序，保存測序正確的pET-28a(+)-GFAP質(zhì)粒和菌種.質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GFAP構(gòu)建方法同上，所用引物為28F和3.1R：ATATCTCGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATCACATCCTTGTG，保存測序正確的質(zhì)粒和菌種.上述所有引物中下劃線序列皆為酶切位點.

1.2.2 表達GFAP融合蛋白 將pET-28a(+)-GFAP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并涂布到LB 固體(Amp 50 μg/mL)平板上，37 ℃過夜培養(yǎng).第二天挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp 50 μg/mL)中培養(yǎng)16小時.隨后，按1∶100的體積比接種到LB液體培養(yǎng)基(Amp 50 μg/mL)中培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8 時，加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/mL)誘導GFAP融合蛋白的表達.

用含10%FBS、DMEM和雙抗的培養(yǎng)基，在5%CO2的37 ℃溫箱中培養(yǎng)293T細胞.待細胞鋪滿培養(yǎng)皿約60%～70%的時候，將陽性pCDNA3.1(+)-GFAP質(zhì)粒通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞.

1.2.3 GFAP融合蛋白的純化 通過大腸肝菌大量誘導表達GFAP融合蛋白用作抗原免疫小鼠.IPTG誘導結(jié)束后，離心收集菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，在冰浴中進行超聲波破碎.細胞破碎后離心收集上清，0.22 μm濾膜過濾后，使用Ni Sepharose 6親和純化柱通過親和層析純化目標蛋白(詳細步驟按生產(chǎn)商說明書進行)，純化結(jié)束后通過SDS-PAGE分析檢測蛋白純化結(jié)果.

通過293T少量表達GFAP融合蛋白用作抗體檢測.磷酸鈣轉(zhuǎn)染24小時后，每隔一天收集培養(yǎng)基一次共計收集6次.然后離心收集上清，0.22 μm濾膜過濾后，使用Ni Sepharose 6親和純化柱通過親和層析作用純化目標蛋白(純化詳細步驟生產(chǎn)商按說明書進行)，純化結(jié)束后通過SDS-PAGE分析檢測蛋白純化結(jié)果.

1.2.4 單克隆抗體的制備 免疫BALB/C小鼠使用細菌表達GFAP融合蛋白，BALB/C小鼠初次免疫取100 μg GFAP融合蛋白與等體積完全弗氏佐劑相混合，乳化后通過腹腔注射免疫小鼠(每只小鼠注射體積不超過200 μL).2周后取50 μg GFAP融合蛋白與等體積不完全弗氏佐劑相混合，乳化后通過腹腔注射對小鼠加強免疫.每次加強免疫使用劑量相同，間隔時間為兩周.第4次加強免疫兩周后，從小鼠尾靜脈少量取血，通過間接ELISA檢測血清效價.效價檢測合格后，取100 μg GFAP融合蛋白再次加強免疫，加強免疫3天后分離陽性小鼠脾細胞按5∶1比例與SP2/0混合，通過PEG4000融合細胞.然后通過HAT選擇培養(yǎng)基篩選陽性雜交瘤細胞系，進一步通過間接ELISA篩選出所需要的陽性雜交瘤細胞系.隨后通過有限釋洗法得到GFAP的單克隆抗體細胞株.進一步采用小鼠腹腔接種法大量制備GFAP單克隆抗體：選用BALB/C小鼠，先腹腔注射降植烷，一周后將GFAP單克隆抗體細胞株接種到小鼠腹腔中去，收集腹水純化抗體.

1.2.5 間接ELSIA 檢測血清或抗體時使用293T細胞表達的GFAP融合蛋白，用PBS稀釋蛋白到2 μg/mL，96 孔ELISA板中每孔加入100 μL，4 ℃放置過夜.然后每孔加入200 μL 3%BSA，37 ℃放置1 h封閉.洗滌3次后，每孔加100 μL待測血清或抗體，37 ℃溫育1 h.洗滌3次后，每孔加入100 μL HRP 標記兔抗鼠抗體(1∶5 000，酶稀釋液稀釋)，室溫孵育30 min.洗滌液洗滌6次后，每孔100 μL加新鮮配制的底物溶液，避光放置5～30 min顯色.最后用酶標儀測定450 nm 處各孔的吸光值.

1.2.6 抗體純化 用10倍柱體積的PBS洗滌平衡層析柱.將含抗體的腹水高速離心后，將上清與等體積2×PBS緩沖液混合，調(diào)整pH以及離子濃度后，緩慢加入層析柱.用10倍柱體積以上的PBS洗滌，至流出液無蛋白檢出.加入0.1 mol/L檸檬酸(pH 2.7)洗脫.洗脫后的抗體加入2/5體積的1 mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)中和，使用Millipore 超濾管切換到所需緩沖液、所需體積，經(jīng)過SDS-PAGE 檢測純度，-20 ℃保存.

1.2.7 Western blot檢測 各組樣品加入適量蛋白裂解液充分裂解后離心收集上清，BCA法測量蛋白濃度.取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離.轉(zhuǎn)膜后置于5%的脫脂奶粉溶液中室溫封閉0.5 h；加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST充分洗5次，用HRP標記的二抗室溫孵育1 h后充分洗膜，然后ECL發(fā)光成像.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pET-28a(+)-GFAP和pCDNA3.1(+)-GFAP的構(gòu)建及鑒定

文獻報道、序列比對及同源建模等揭示GFAP蛋白的羧基端“尾部”氨基酸水溶性較好.另一方面，雖然GFAP主要表達于星形膠質(zhì)細胞，但已在人類中共計發(fā)現(xiàn)6種不同的GFAP轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本的羧基端氨基酸序列并不相同.綜合考慮，選擇GFAP羧基端292～432序列作為抗原免疫動物，以提高所制備單克隆抗體的特異性.免疫小鼠需要的蛋白量相對較大，采用原核細胞表達.篩選血清或抗體需要的蛋白量較少，同時也為提高篩選制備抗體的特異性，采用真核細胞表達.從NCBI數(shù)據(jù)庫中查到人GFAP基因序列，然后委托公司合成GFAP基因(編碼氨基酸292～432).進一步通過PCR擴增GFAP基因，產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果顯示目的片段大小為430 bp，與預期值相符(見圖1).回收的PCR產(chǎn)物與表達載體pET-28a(+)和pCDNA3.1(+)經(jīng)雙酶切、連接酶連接后構(gòu)建pET-28a(+)-GFAP和pCDNA3.1(+)-GFAP重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后挑取陽性單克隆質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示電泳條帶與預期值相符.選取陽性克隆進行測序鑒定，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列一致，確定重組表達載體pET-28a(+)-GFAP和pCDNA3.1(+)-GFAP構(gòu)建正確.

2.2 融合蛋白的表達及鑒定

測序正確的原核表達載體pET-28a(+)-GFAP經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、誘導等處理后，離心收集菌體沉淀，重懸沉淀、菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清，0.22 μm濾膜過濾后，使用Ni柱親和純化目的融合蛋白，通過SDS-PAGE分析檢測蛋白純化結(jié)果，結(jié)果顯示電泳條帶與預期值相符(見圖2).

測序正確的真核表達載體pCDNA3.1(+)-GFAP轉(zhuǎn)染293T細胞后，離心收集培養(yǎng)基，過濾后使用Ni柱親和純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果，結(jié)果顯示電泳條帶與預期值相符.

2.3 免疫及抗GFAP血清效價檢測

將GFAP純化蛋白經(jīng)腹腔注射的方式免疫4只雌性BALB/C小鼠，第4次免疫后采集小鼠尾靜脈血，通過間接ELISA檢測抗GFAP血清效價，結(jié)果見圖3.進一步通過Western blot檢測抗GFAP血清特異性，結(jié)果見圖4.間接ELISA和Western blot結(jié)果皆說明小鼠免疫成功.

M：DNA marker；1：PCR擴增GFAP基因.

注：這里僅給出原核表達GFAP重組蛋白純化分析結(jié)果，其分子量約為20 kD. M：蛋白 marker；1：GFAP重組蛋白.M：protein marker；1：recombinant GFAP protein.

圖2 SDS-PAGE檢測純化的GFAP蛋白

Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant GFAP protein

注：CTL注射PBS小鼠血清; MS(R1)：右耳打孔一次免疫小鼠血清; MS(L1)：左耳打孔一次免疫小鼠血清; MS(R2)：右耳打孔二次免疫小鼠血清; MS(L2)：左耳打孔二次免疫小鼠血清.

圖3 間接ELISA檢測免疫小鼠抗GFAP血清效價

Fig.3 The titer detection of the anti-GFAP mice serum by indirect ELISA

注：抗原為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GFAP的293T細胞裂解液，血清稀釋比為1∶2 000. 1: 陽性抗體對照;2: 小鼠R2血清; 3: 對照小鼠血清; 4: 小鼠L1血清; 5: 小鼠R1血清

圖4 Western Blot檢測免疫小鼠抗GFAP血清特異性

Fig.4 The specificity of anti-GFAP serum detected by Western blot

注：這里僅給出1D7稀釋比為1∶4 000單克隆抗體檢測結(jié)果.M: 蛋白marker; 1: 細菌表達GFAP重組蛋白(上樣蛋白30 ng); 2: 為U251細胞裂解液(30 ng); 3: 小鼠腦組織裂解液.圖5 Western blot檢測GFAP單克隆抗體Fig.5 The specificity of anti-GFAP monoclonal antibody detected by Western blot

2.4 雜交瘤細胞株的建立及抗體純化

免疫小鼠血清效價及Western blot檢測免疫成功后，再次加強免疫后分離陽性小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合.HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞系，間接ELISA篩選出所需要的陽性雜交瘤細胞系.隨后通過有限釋洗法得到單克隆細胞株.共篩選7株GFAP的單克隆抗體細胞株，分別命名為1D2、3C9、1D7、1E2、1G5、3A4和1H5.進一步采用小鼠腹腔接種法大量制備GFAP單克隆抗體：選用BALB/C小鼠，先腹腔注射降植烷，一周后將GFAP單克隆抗體細胞株接種到小鼠腹腔中去，收集腹水純化抗體.

2.5 Western blot分析抗體特性

對在小鼠腦組織、U251細胞中表達的內(nèi)源GFAP蛋白和在大腸桿菌中表達的重組GFAP蛋白，使用Western blot分析GFAP單克隆抗體的特性.結(jié)果顯示所制備的7 株單克隆抗體細胞株，其中6 株在Western blot中能很好地識別組織及細胞裂解液中的內(nèi)源蛋白，另外1株3A4只能識別重組GFAP蛋白.Western blot結(jié)果見圖5.

2.6 抗體亞型鑒定及初步表位分析

通過BD小鼠抗體亞型鑒定試劑盒鑒定7株單克隆抗體重鏈的亞型.然后通過競爭法分析單克隆抗體的表位.結(jié)果表明7株單抗共識別抗原6個不同的表位，其中3C9和1D7識別相同表位，概括如表1.

2.7 抗體配對及夾心ELISA檢測方法的建立和評價

表位分析揭示7株單克隆抗體共識別5種抗原表位.抗體配對結(jié)果顯示，1E2和1H5兩種抗體可以配對.配對抗體中，4 μg/mL的1E2作為包被抗體、HRP標記的1H5(1∶2 000稀釋)作為檢測抗體，雙抗夾心檢測重組GFAP蛋白的標曲很好且非常穩(wěn)定(見圖6，表2).結(jié)果顯示雙抗夾心ELISA檢測重組GFAP標準曲線很好，ELISA檢測顯示重組GFAP標準曲線很好.從醫(yī)院收集人急性腦出血陽性血清樣本2份，用來初步分析試劑盒的臨床應用，但是，本研究組裝的夾心ELISA試劑盒測樣無陽性值.

表1 抗體初步表位分析及重鏈亞型鑒定

圖6 雙抗夾心ELISA檢測重組GFAP蛋白的標準曲線

表2 雙抗夾心ELISA檢測重組GFAP蛋白及急性腦出血陽性血清樣本原始數(shù)據(jù)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計我國新發(fā)腦卒中患者每年超過150萬；死于腦卒中的病人每年在120萬以上；腦卒中存活患者已達500～600萬，其中3/4以上患者帶有不同程度的后遺癥.腦卒中不但給患者生活帶來嚴重的不便和痛苦，也給患者家庭、國家和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔、巨大的經(jīng)濟損失[11].腦卒中可簡單分為以下兩類：一類為出血性腦血管病，另一類是缺血性腦血管病,腦卒中的準確和快速診斷，對患者治療和預后皆有顯著的幫助和提高[1,3,8].

目前，診斷腦卒中主要依靠影像學檢查，如核磁共振和CT.最近，關(guān)于腦卒中血清學標志物的研究顯示，檢測血清標志物可提高腦卒中患者診斷的及時性和準確度[12].GFAP作為一個新的出血性腦卒中的標志物，可反映神經(jīng)膠質(zhì)細胞的損害程度，為判斷出血性腦卒中患者的梗死面積及神經(jīng)系統(tǒng)受損信息提供輔助數(shù)據(jù)，GFAP檢測也可用于預后估計.

本研究成功制備了多株GFAP特異性單克隆抗體，經(jīng)過檢測所制抗體與GFAP有較好的結(jié)合能力，并可組裝成抗體對通過雙抗夾心ELISA檢測GFAP.實測兩例人急性腦出血陽性血清樣本，新組裝的ELISA試劑盒沒有檢測出陽性值.分析不能檢出的原因如下：1) 不排除選取的樣本為陰性；2) 抗體配對識別的表位在天然樣本中被阻斷；3) 抗體只識別內(nèi)源蛋白的線性表位，不識別構(gòu)象表位.多次檢測證實配對抗體對通過雙抗夾心ELISA檢測重組GFAP的標準曲線很好，且非常穩(wěn)定.進一步工作通過增加測樣數(shù)量，排除陰性樣本的可能；同時制備識別天然樣本的多抗，增加識別的靶位點，再和單抗配對測樣組裝ELISA試劑盒.無論如何本研究成功制備了多株GFAP特異性單克隆抗體，為臨床診斷提供了基礎(chǔ)材料，有助于臨床醫(yī)生診斷和評估腦卒中進展情況，改善病人的預后.

[1] MIDDELDORP J, HOL E M. GFAP in health and disease[J]. Progress in neurobiology, 2011, 93(3):421-443.

[2] SZEVERENYI I, CASSIDY A J,CHUNG C W, et al．The human intermediate filament database: comprehensive information on a gene family involved in many human diseases[J]. Hum Mutat, 2008, 29(3):351-360.

[3] 張輝,饒志仁,黃文晉.膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的研究進展[J].生理科學進展,2001,32(4):353-355.

[4] BRENNER M. Structure and transcriptional regulation of the GFAP gene[J]. Brain Pathol, 1994, 4(3):245-257.

[5] TEMPLE S. The development of neural stem cells[J]. Nature, 2001, 414(6859): 112-117.

[6] GOMES F C, PAULIN D, MOURA N V,et al. Glial fibrillary acidic protein(GFAP): modulation by growth factors and its implication in astrocyte differentiation[J]. Braz J Med Biol Res, 1999, 32(5):619-631.

[7] GIMENEZ Y, RIBOTTA M, MENETV, et al. Comparative anatomy of the cerebellar cortex in mice lacking vimentin, GFAP, and both vimentin and GFAP[J]. Glia, 2000, 31(1):69-83.

[8] CHRISTIAN F, MARION N, BACK T, et al. Diagnostic accuracy of plasma glial fibrillary acidic protein for differentiating intracerebral hemorrhage and cerebral ischemia in patients with symptoms of acute stroke[J]. Clin Chemi, 2012, 58(1):237-245.

[9] 趙冬.我國人群腦卒中發(fā)病率、死亡率的流行病學研究[J].中華流行病學雜志,2003,23(3):236-239.

[10] 賈楠,張國軍,康熙雄.GFAP對急性腦卒中早期鑒別診斷意義的初步探討[J].中國免疫學雜志,2011,27(4):368-370.

[11] 崔桂萍,劉萍.腦卒中患者血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白含量的動態(tài)變化及臨床意義[J].中華老年心腦血管病雜志,2011,13(3):238-241.

[12] FLORIAN D, ISABEL H, SITZER M， et al. Characterisation of the diagnostic window of serum glial fibrillary acidic protein for the differentiation of intracerebral haemorrhage and ischaemic stroke[J]. Cerebrovasc Dis, 2009, 27(1):37-41.

(責任編輯：王浩毅)

Preparation of Anti-GFAP Monoclonal Antibodies and Development of Double Antibody Sandwich ELISA for GFAP

WANG Ke, ZHANG Shoutao, GUO Ya’nan

(SchoolofLifeScience，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001，China)

Preparing monoclonal antibodies against GFAP and an ELISA kit for GFAP could provide reliable tools for early diagnosis of hemorrhagic stroke. Hybridomacells were obtained by fusing myeloma cells (SP2/0) with spleen cells from BALB/C mice immunized with GFAP from human. After screened and subcloned, the seven hybridoma cell lines against human GFAP were obtained. The mcAbs from mice injected with hybridomacells were purified and conjugated to HRP. The subtype, epitopes and specificity of monoclonal antibodies were determined by ELISA and Western blot. All hybridoma cells obtained were high specifically bound to GFAP,which were belonged to IgG1or IgG2. Based on epitopes of GFAP mcAbs, the sandwich ELISA kit for GFAP was developed. All the results indicated that the high specific mcAbs against GFAP had been prepared, and a rapid, sensitive and specific ELISA for recombinant GFAP detection was established successfully.

GFAP; hemorrhagic stroke; antibody; ELISA

2016-12-06

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31501094)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目(152300410032).

王珂(1990—)，男，北京人，碩士研究生，主要從事分子免疫學及免疫診斷檢測技術(shù)研究，E-mail: 334160330@qq.com；通訊作者：郭亞楠(1983—)，男，河南沈丘人，講師，博士，主要從事分子免疫學、抗體制備及免疫診斷檢測技術(shù)研究，E-mail: guoyn@zzu.edu.cn.

王珂,張守濤,郭亞楠.GFAP單克隆抗體制備及ELISA檢測方法研究[J].鄭州大學學報(理學版),2016,48(2):95-100.

Q813.2;R392.12

A

1671-6841(2016)02-0095-06

10.13705/j.issn.1671-6841.2016297