白菜游離小孢子培養(yǎng)研究進展

秦艷梅 王明霞 賈利 田紅梅 王艷 張其安 江海坤 嚴(yán)從生 方凌

摘 要：該文從影響小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的主要因素、胚狀體植株再生以及胚胎發(fā)生機理三方面綜述了白菜游離小孢子培養(yǎng)的研究進展。

關(guān)鍵詞：白菜；游離小孢子培養(yǎng)；胚胎發(fā)生；植株再生

中圖分類號 S63 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）11-0060-04

Research Progress on the Microspore Culture of Chinese Cabbage

Qin Yanmei et al.

（Horticulture Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031， China）

Abstract：The article reviews the research progress on the microspore culture of Chinese cabbage，including the main factors influencing the microspore culture embryogenesis，plants regeneration，and mechanism of embryogenesis.

Key words：Chinese cabbage； Isolated microspore culture； Embryogenesis； Plants regeneration

白菜是十字花科蕓薹屬重要的蔬菜作物，主要包括大白菜（結(jié)球白菜）、小白菜（不結(jié)球白菜）兩個亞種，以及烏塌菜、菜薹等多個栽培變種[1]。白菜在我國栽培面積大、分布范圍廣，是居民“菜籃子”的重要蔬菜之一。白菜是異花授粉植物，具有顯著的雜種優(yōu)勢。游離小孢子培養(yǎng)是在單細胞水平上快速大量獲得雙單倍體純系的有效手段，應(yīng)用于白菜育種中，可顯著提高白菜的育種效率。白菜游離小孢子培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)80年代[2]，之后許多學(xué)者對白菜小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響因素、胚狀體植株再生以及小孢子胚胎發(fā)生機理等方面都進行了深入研究。

1 白菜小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響因素

1.1 供試材料基因型 游離小孢子培養(yǎng)中胚胎發(fā)生能力是受基因控制的遺傳性狀[3]，不同基因型白菜胚狀體發(fā)生能力差異顯著，主要表現(xiàn)在反應(yīng)范圍和胚胎發(fā)生率方面。栗根義等[4]研究表明，在大白菜小孢子培養(yǎng)中，基因型反應(yīng)范圍為92.3%。陳曉峰[5]等研究表明，出胚率最高的基因型達38.25胚/蕾，是出胚率最低基因型的近30倍。姜鳳英等[6]對21個小白菜品種進行小孢子培養(yǎng)，有11個基因型得到了胚狀體，反應(yīng)范圍為52.4%，最高出胚率為2.3胚/蕾。蔣武生等[7]對24份小白菜品種進行游離小孢子培養(yǎng)，有20份材料誘導(dǎo)出胚，培養(yǎng)成功率為83.3%。包美麗等[8]對12個黃心春結(jié)球白菜進行培養(yǎng)，5個品種獲得胚狀體，胚誘導(dǎo)率最高的達到5.4個胚/蕾，不同基因型的春結(jié)球白菜成胚能力差異極大。申書興等[9]研究四倍體大白菜的游離小孢子培養(yǎng)，同樣發(fā)現(xiàn)基因型顯著影響小孢子胚胎發(fā)生。劉凡等[10]對28份不結(jié)球白菜、78份結(jié)球白菜進行小孢子培養(yǎng)，反應(yīng)范圍分別為60.7%、98.7%，另外，結(jié)球白菜的胚胎發(fā)生能力顯著高于不結(jié)球白菜，結(jié)球白菜中的疊抱類型比合抱類型、早熟類型比中晚熟類型胚胎發(fā)生能力高。成妍等[11]的研究表明，供試的10個不結(jié)球白菜基因型都獲得了胚狀體，出胚率最高為27.5胚/蕾，最低僅為0.14胚/蕾，且正反雜交組合基因型間小孢子胚誘導(dǎo)率無顯著差異。以上研究均表明，不同親本類型的材料其胚胎發(fā)生能力存在很大差別。

1.2 供試植株生理狀況 供體植株的生長環(huán)境決定著小孢子的生理狀態(tài)，直接影響小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生能力。生長在14～18h長日照、15～20℃環(huán)境下的供試植株（品種HoMei），出胚率和植株再生率顯著高于高溫短日照環(huán)境中生長的植株[12]。方淑桂等[13]也有相似的報道，認為大白菜供體植株生長在10～25℃氣溫條件下較適宜，最高氣溫超過28℃時小孢子胚狀體誘導(dǎo)率大大降低。為了提高小孢子胚胎發(fā)生率，應(yīng)把供體植株花期安排在冬季和早春[14]，自初花期起連續(xù)摘除植株上將開花的花蕾，可以有效提高生長在自然條件下的供試植株的小孢子胚胎發(fā)生率[15]。總之，供試植株的生長條件直接影響游離小孢子培養(yǎng)的成敗，應(yīng)避開高溫、短日照、病蟲害多發(fā)季節(jié)等不利條件，否則出胚率將大大降低且污染率倍增，影響試驗成功率。除生長環(huán)境條件外，小孢子胚胎發(fā)生能力也受供試植株株齡的影響。不結(jié)球白菜初花期是最佳取樣時期，隨著花期的延長，小孢子產(chǎn)胚能力幾乎呈直線下降趨勢[16]。成妍等[11]報道了相似的研究結(jié)果。但是，也有諸多研究表明，盛花期取蕾培養(yǎng)，出胚率高于初花期和末花期[17-19]，對于四倍體品種，盛花期也是最適取材時期[9]。軒正英等[20]則認為，在盛花期和末花期取材培養(yǎng)出胚率最高。

1.3 小孢子發(fā)育時期 小孢子發(fā)育過程經(jīng)歷單核期、雙核期和三核期，發(fā)育時期的選擇對胚胎發(fā)生影響很大。陳曉峰等[5]報道花蕾長度為2.1～3.0mm時，絕大部分小孢子處于單核晚期（單核靠邊期），小孢子胚誘導(dǎo)率最高，達到34.28胚/蕾，超過3.0mm或者低于2.0mm胚胎誘導(dǎo)率極低。王秀英等[21]試驗中選取長度為2.5～3.5mm的花蕾，其60%以上小孢子處于單核靠邊期，可獲得較高的胚產(chǎn)量。李巖等[22]也報道，小白菜小孢子處于單核中期至單核靠邊期易于誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。栗根義[4]、盧鋼等[23]、姜立容等[24]也有相似的研究結(jié)果?？梢?，單核中期至單核靠邊期是游離小孢子培養(yǎng)的最佳誘導(dǎo)時期。而小孢子單核靠邊期時花蕾長度因材料基因型而異，因此，游離小孢子培養(yǎng)前，應(yīng)先取供試植株的花蕾進行細胞觀察，以確定適宜時期花蕾長度，作為取材依據(jù)。

1.4 培養(yǎng)前預(yù)處理

1.4.1 低溫預(yù)處理 Sato等[25]報道低溫預(yù)處理花蕾能提高大白菜小孢子胚胎發(fā)生率。軒正英等[20]研究表明，4℃處理1～2d時，小孢子誘導(dǎo)率可明顯提高。其他學(xué)者也得到了相同的研究結(jié)果，未經(jīng)低溫處理或處理時間過長，胚狀體誘導(dǎo)率較低，以處理24～48h為佳[26-27]。耿建峰等[28]研究表明，低溫處理0～5d內(nèi)小孢子胚誘導(dǎo)率差異不大，超過5d則明顯降低。包美麗等[8]首次采用低溫缺氧的方法處理花序，發(fā)現(xiàn)其最佳時間為24h?？梢?，不同基因型的材料，低溫預(yù)處理的最佳時間有所差異。

1.4.2 熱激處理 高溫?zé)峒ふT發(fā)小孢子向胚胎方向發(fā)育，適宜的熱激處理時間和溫度，可提高小孢子的產(chǎn)胚率。栗根義等[4，29]認為35℃高溫預(yù)處理的作用機制可能是誘導(dǎo)小孢子沿胚胎發(fā)育途徑發(fā)展。但不同基因型的材料，在熱激處理溫度及時間上存在明顯差異。李菲等[30]研究表明，33℃高溫預(yù)處理24h后小孢子膨大，染色體自然加倍，小孢子進入孢子體發(fā)育途徑，胚胎發(fā)生啟動。熱激24～48h出胚率有較大提高[26]，較易誘導(dǎo)的基因型33℃高溫處理24h的效果最好，對于較難誘導(dǎo)的基因型處理48h后胚誘導(dǎo)率可提高[31]，持續(xù)的高溫環(huán)境會阻礙小孢子胚胎發(fā)育進程。

1.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分 誘導(dǎo)培養(yǎng)基是胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，直接影響細胞分化和發(fā)育。目前，在白菜游離小孢子培養(yǎng)中，普遍使用NLN培養(yǎng)基。有研究認為，在NLN培養(yǎng)基中添加適量的6-BA對胚胎發(fā)生有促進作用[32-33]。高濃度的6-BA和NAA抑制小孢子胚胎發(fā)生，而低濃度則起促進作用，且NAA可促進小孢子胚進一步發(fā)育，提高成熟胚比例[6，28]。吳藝飛等[34]報道菜薹小孢子培養(yǎng)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NLN-13+1.0mg·L-16-BA+0.4mg·L-1NAA；添加6-BA可提高胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)率，但隨著濃度的升高，畸形胚的比例呈上升趨勢；添加NAA在一定范圍內(nèi)可以降低畸形胚所占比例[34-35]，但濃度過高會抑制胚胎發(fā)生。蔣武生等[31]則認為加入6-BA 0.5mg·L-1和NAA 0.lmg·L-1即抑制大白菜小孢子胚發(fā)生。韓陽等[36]報道低濃度的細胞分裂素可促進胚狀體的發(fā)生，且6-BA的作用大于ZT。多數(shù)白菜材料較易出胚，在培養(yǎng)中無需添加激素也可得到大量的胚狀體；部分難出胚的材料可以通過添加適量的激素誘導(dǎo)出胚，但也存在依然無法誘導(dǎo)出胚或出胚率很低的情況，可能是因為不同基因型材料對激素要求不同。

除激素外，在培養(yǎng)基中添加活性炭也有報道，適量的活性炭提高小孢子出胚率、子葉形胚比例以及胚發(fā)育同步性，但活性炭適宜濃度的報道不盡相同。徐艷輝等[32]報道，培養(yǎng)基中活性炭濃度為0.02g·L-1時各基因型產(chǎn)胚量最高，超過0.04g·L-1時，則抑制胚狀體發(fā)生。而盛鵬等[37]認為，活性炭適宜濃度為0.1g·L-1，胚誘導(dǎo)率達11.33胚/蕾，較對照提高66.61%，作用顯著。蔣武生等[38]研究表明，0.5g·L-1的活性炭有利于小孢子胚誘導(dǎo)和形成。在二倍體及四倍體大白菜小孢子培養(yǎng)中，申書興等報道添加0.05～0.1g·L-1的活性炭明顯提高胚胎發(fā)生率和發(fā)育同步性，并提高子葉型胚比例[9，15]。活性炭吸附孢子發(fā)育過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，消除其對小孢子發(fā)育的負面影響，但還會吸附培養(yǎng)基中的礦質(zhì)元素、鐵鹽、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。筆者在大白菜和烏菜游離小孢子培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的活性炭有利于胚狀體發(fā)生，而高濃度的活性炭會降低胚狀體的數(shù)量和質(zhì)量。

2 小孢子培養(yǎng)胚狀體植株再生

不同發(fā)育時期的胚接種到成苗培養(yǎng)基中成苗率不同，子葉形胚成苗率最高，其他胚型能部分成苗甚至不能成苗。提高小孢子胚狀體植株再生率是有效利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵問題之一。

小孢子在胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間稱為胚齡。劉凡等[39]在研究中發(fā)現(xiàn)，14～21d胚齡的子葉型胚植株再生率較高。付文婷等[33]對大白菜的研究也得到了類似結(jié)果，以21d胚齡的子葉型胚植株再生率最高，隨著培養(yǎng)時間延長，植株再生率顯著下降。王濤濤等[40]則認為大白菜、紅菜薹胚狀體植株再生的最佳胚齡為20～29d，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基后，成苗率分別達到65.6%和63.3%。

玻璃化是小孢子胚成苗過程中的普遍現(xiàn)象，嚴(yán)重影響植株再生率。當(dāng)瓊脂為8g·L-1時，僅少數(shù)胚狀體能成苗，玻璃化、甚至褐化死亡現(xiàn)象嚴(yán)重；在8～12g·L-1范圍內(nèi)，隨著瓊脂質(zhì)量濃度的提高，小孢子胚再生率顯著提高[11，39-40]。高素燕等[41]報道，在培養(yǎng)基中添加5mg·L-1AgNO3，對不結(jié)球小白菜小孢子胚成苗有顯著效果，添加活性炭胚狀體出現(xiàn)玻璃化的比例降低。筆者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)胚齡20～25d，瓊脂濃度為10g·L-1時，大白菜胚狀體成苗率較高，鮮有玻璃化現(xiàn)象。

3 游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生機理

游離小孢子在培養(yǎng)過程中，誘使游離的小孢子中斷配子體發(fā)育途徑，進行孢子體發(fā)育，從而產(chǎn)生胚狀體發(fā)育成完整植株。根據(jù)小孢子啟動后第一次分裂特征將胚胎發(fā)育途徑分為A途徑（不均等分裂）和B途徑（均等分裂）兩大類。

大白菜小孢子以B途徑為主要發(fā)育途徑，胚胎自然加倍發(fā)生在胚誘導(dǎo)初期[42]。游離的不結(jié)球白菜小孢子多數(shù)經(jīng)歷的發(fā)育過程與合子胚相似，胚胎發(fā)育迅速，A途徑與B途徑同時存在，不同品種胚胎發(fā)育的途徑存在一定的差異[43]，小孢子胚胎可能在第1次不均等分裂或四細胞時期就已建立發(fā)育極性[44]。姜立榮等[24]觀察大白菜小孢子培養(yǎng)中小孢子分裂方式以及細胞超微結(jié)構(gòu)，揭示了小孢子胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)變化與結(jié)構(gòu)變化。高素燕等[45]對與小孢子胚胎發(fā)生相關(guān)的特異表達片段進行分離、克隆與分析，得到94個與小孢子胚胎發(fā)生相關(guān)的表達序列標(biāo)簽（EST），初步判斷與小孢子胚胎發(fā)生有關(guān)，但未明確其在胚胎發(fā)生過程中的功能。

4 小結(jié)與展望

小孢子培養(yǎng)是單倍體育種的重要手段之一，除了可以縮短育種年限、提高育種效率外，培養(yǎng)所得雙單倍體群體還是分子標(biāo)記和構(gòu)建基因圖譜的理想材料，具有廣泛的應(yīng)用前景。小孢子培養(yǎng)研究在短短的幾十年間進展很大，但仍存在一些不足，距離高效應(yīng)用還有一定的差距。游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生是一個非常復(fù)雜的過程，受到一系列相關(guān)基因和蛋白的共同調(diào)控。如何更加有效地提高小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生率、植株再生率以及明確胚胎發(fā)生機制、建立高效完善的培養(yǎng)體系還有待更深入的研究。

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