紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）干擾素調(diào)節(jié)因子2基因的克隆及原核表達(dá)

孫賽紅馬普孫鶴孔德榮李慧仇雪梅姜志強(qiáng)劉海映劉洋劉圣聰孟雪松王秀利

（1. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023；3. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023；4. 大連天正實(shí)業(yè)有限公司，大連 116011）

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）干擾素調(diào)節(jié)因子2基因的克隆及原核表達(dá)

孫賽紅1，2馬普2孫鶴2孔德榮2李慧2仇雪梅2姜志強(qiáng)1劉海映3劉洋2劉圣聰4孟雪松4王秀利1，2

（1. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023；3. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023；4. 大連天正實(shí)業(yè)有限公司，大連 116011）

干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factor，IRF）是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆了紅鰭東方鲀干擾素調(diào)節(jié)因子2（Interferon regulatory factor 2，IRF2）基因的全長(zhǎng)cDNA。該基因全長(zhǎng)為1 552 bp，其中5'非編碼區(qū)（5'-UTR）187 bp，3'非編碼區(qū)（3'-UTR）429 bp，編碼區(qū)（CDS）為936 bp，共編碼311個(gè)氨基酸。將IRF2的編碼區(qū)序列連接到原核表達(dá)載體pET32a（+），成功構(gòu)建了重組體pET32a（+）-IRF2。將重組體pET32a（+）-IRF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，獲得了重組表達(dá)IRF2的基因工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，pET32a（+）-IRF2在BL21中得到了融合表達(dá)。通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示紅鰭東方鲀IRF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)效果較高，目的蛋白準(zhǔn)確。

紅鰭東方鲀；干擾素調(diào)節(jié)因子2；cDNA末端快速擴(kuò)增；原核表達(dá)

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes），是一種重要的近海經(jīng)濟(jì)魚類，由于其肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美深受人們的喜愛。然而，海水環(huán)境中存在的病菌和病毒致使魚類的皮膚和黏膜不斷受到侵襲，這些病原微生物侵入魚體后導(dǎo)致魚體發(fā)生病變甚至死亡［1］，給紅鰭東方鲀的大規(guī)模養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factor，IRF）是一類結(jié)構(gòu)上保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，可分為4個(gè)亞家族：IRF1亞家族、IRF3亞家族、IRF4亞家族和IRF5亞家族［2］。所有IRF N端均包含一個(gè)由115個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）。IRF通過DBD結(jié)合到特定的DNA基序上［3］，使其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控［4］、免疫細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞）的發(fā)育［5-7］、細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］及抗腫瘤［9］方面起到重要作用。因此對(duì)魚類IRF的研究及其在魚類疾病防治等方面的應(yīng)用意義重大。

本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得了紅鰭東方鲀IRF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過基因重組，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，得到重組IRF2蛋白，旨在進(jìn)一步研究重組紅鰭東方鲀干擾素調(diào)節(jié)因子2蛋白活性及其在紅鰭東方鲀健康養(yǎng)殖上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用健康紅鰭東方鲀采自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，日齡為266 d。采集紅鰭東方鲀腎臟組織，并迅速凍存于液氮中，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI的RefSeq 數(shù)據(jù)庫中的紅鰭東方鲀干擾素調(diào)節(jié)因子2（IRF2）的預(yù)測(cè)序列（GenBank注冊(cè)號(hào)：XM-003978691.1）（此序列的編碼區(qū)不完整，其cDNA 缺少3'末端），利用生物信息學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（表1）。3'-RACE CDS3用于cDNA第一鏈的合成，IRF2-GSP3/UPM用于3'-RACE 的PCR擴(kuò)增，IRF2-NGSP3/NUP用于巢式PCR，F(xiàn)-IRF2/R-IRF2用于編碼區(qū)（CDS）擴(kuò)增。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.2.2 總 RNA的提取 從-80℃冰箱中取出紅鰭東方鲀腎臟組織約0.1 g，按照RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa公司）說明書的方法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

變速器內(nèi)的油環(huán)、膠圈、銅套、閥芯其實(shí)是代表了油路的密封點(diǎn)和容易失效部位，依照這些關(guān)鍵點(diǎn)，我們就可以保證變速器內(nèi)油路的完整性，并以系統(tǒng)科學(xué)的流程來找到故障根源。

1.2.3 紅鰭東方鲀IRF2基因的 3'RACE 按照SMARTerTMRACE-Ready cDNA Amplification Kit說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司）將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成3'-RACE-Ready cDNA。以此cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。以上述PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收及測(cè)序 PCR產(chǎn)物的回收按照Agarose gel DNA Fragment Recovery Kit ver 2.0（生工生物工程股份有限公司）說明書操作。將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體（TaKaRa公司）連接并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa公司）內(nèi)，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選后隨機(jī)挑取3個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。采用DNAstar軟件對(duì)3'端測(cè)序結(jié)果和已知序列進(jìn)行拼接，得到紅鰭東方鲀IRF2基因的全長(zhǎng)序列。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 在ExPASy網(wǎng)站（http://web. expasy.org/protparam/）在線進(jìn)行編碼蛋白的理化性質(zhì)分析；運(yùn)用Signal P分析信號(hào)肽序列；采用GOR在線工具分析紅鰭東方鲀IRF2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用clustalx軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析并采用Mega 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.6 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)IRF2基因ORF序列設(shè)計(jì)特異引物F-IRF2/ R-IRF2（表1），以3' RACE合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體16℃連接4 h，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒命名為pMD19-T-IRF2，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。以質(zhì)粒pMD19-T-IRF2為模板，用引物F-IRF2/R-IRF2進(jìn)行PCR擴(kuò)增紅鰭東方鲀IRF2編碼區(qū)序列。參照Yuan等［14］的原核表達(dá)載體構(gòu)建方法將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a（+）（本實(shí)驗(yàn)室保存）分別進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后用T4 DNA Ligase 連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定均為陽性后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a（+）-IRF2。

1.2.7 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá) 測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32a（+）-IRF2轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存），37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基（含Amp）震蕩培養(yǎng)。參考方珍珍等［15］原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)方法，當(dāng)菌液OD600為0.6左右時(shí)以1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h，取1 mL菌液離心棄上清，沉淀用100 μL PBS重懸，加入25 μL上樣緩沖液煮沸10 min，SDS-PAGE電泳；鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.8 目的融合蛋白的分離純化及Western blotting鑒定 將100 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液6 000 r/min離心10 min，棄上清，用50 mL PBS重懸菌體；然后對(duì)其超聲波破碎（750 W工作9 s，間歇9 s），12 000 r/min離心20 min，取上清；將上清過ProteinIsoTMNi-NTA Resin（全式金生物技術(shù)有限公司）純化目的融合蛋白；將收集的洗脫液轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，于PBS中4℃透析過夜；最后參照潘秋麗等［16］的方法將透析產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

參照張家林等［17］的Western blotting方法，將純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE，100 mA下2 h轉(zhuǎn)印至NC膜上。然后將NC膜置于封閉液中浸泡30 min，加入His-tag抗體（天根生化科技有限公司）孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（天根生化科技有限公司）孵育30 min。以上各步驟之間用PBS緩沖液清洗3次，每次10 min。加入顯色液顯色（約10 min），至目標(biāo)條帶出現(xiàn)后用超純水清洗終止顯色。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果

提取得到紅鰭東方鲀腎臟總RNA后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見圖1?？俁NA 28S RNA和18S RNA條帶清晰，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)，總RNA滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 紅鰭東方鲀腎臟總RNA

2.2 3'RACE擴(kuò)增結(jié)果

巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳（圖2），得到了3條清晰條帶，大小約為1 000 bp、600 bp和400 bp，其中400 bp左右的條帶與預(yù)期大小不符，將1 000 bp和600 bp左右的兩條帶分別切膠回收、克隆與測(cè)序，600 bp左右的條帶與已知序列可拼接上，長(zhǎng)度為581 bp。

2.3 紅鰭東方鲀IRF2基因的序列分析

將3' RACE擴(kuò)增序列與已知部分序列（ GenBank注冊(cè)號(hào)：XM-003978691.1）進(jìn)行拼接得到IRF2的全長(zhǎng)cDNA。該基因的cDNA為1 552 bp，其中5'非編碼區(qū)為187 bp，3'非編碼區(qū)為429 bp（包含24 bp的Poly A尾），編碼區(qū)共936 bp，編碼311個(gè)氨基酸，見圖3。已將克隆的紅鰭東方鲀IRF2的cDNA序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫，序列注冊(cè)號(hào)為：KF853391。對(duì)應(yīng)的IRF2編碼蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)為：AHI85770）的分子量為35.5 kD，等電點(diǎn)為6.56。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示無信號(hào)肽。

采用GOR在線工具分析TrIRF2氨基酸序列的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β折疊3種二級(jí)結(jié)構(gòu)原件組成，其中無規(guī)則卷曲所占的比例最高，為56.91%（177個(gè)氨基酸），延伸鏈（反平行的折疊形態(tài)）占30.87%（96個(gè)氨基酸），α-螺旋最少，僅占12.22%（38個(gè)氨基酸）。

通過Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)所獲得的紅鰭東方鲀IRF2氨基酸序列與其他物種IRF2氨基酸序列有較高相似性（表2），其中與鱖魚的相似度最高，達(dá)到79%，與烏鱧、斜帶石斑魚等的相似性也均在60%以上。采用Neighborhood-Joining 法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）顯示紅鰭東方鲀IRF2與鮸魚IRF2聚為一支，說明二者親緣關(guān)系最近。

2.4 紅鰭東方鲀IRF2基因原核表達(dá)載體pET32a（+）-IRF2的鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒pET32a（+）-IRF2進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果（圖6）顯示，酶切片段長(zhǎng)度為957 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建了pET32a（+）-IRF2原核表達(dá)載體。將含有目的基因的ORF序列片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序分析表明，IRF2基因已正確連接到pET32a（+）。

2.5 紅鰭東方鲀IRF2基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)

與pET32a（+）空載相比，重組質(zhì)粒pET32a（+）-IRF2在BL21（DE3）中表達(dá)的蛋白圖譜明顯多出一條特異的誘導(dǎo)表達(dá)條帶（圖7），大小在53.8 kD左右，說明在BL21（DE3）中表達(dá)出IRF2融合蛋白。另外，在未誘導(dǎo)的BL21（DE3）菌株里也有少量目的蛋白的表達(dá)，這可能是由于pET表達(dá)系統(tǒng)中存在目的蛋白的本底表達(dá)造成的。除去融合標(biāo)簽蛋白，可推算出實(shí)際誘導(dǎo)表達(dá)的紅鰭東方鲀IRF2蛋白的分子量為35.5 kD，與理論值一致。

2.6 融合蛋白的純化和Western blot分析結(jié)果

利用重組蛋白內(nèi)含有的His標(biāo)簽，對(duì)目的融合蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白經(jīng)透析過夜后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，所得條帶比預(yù)期目的條帶（53.8 kD）稍微偏高（圖8），這可能是由于His標(biāo)簽中的堿性氨基酸導(dǎo)致蛋白在電泳過程中移動(dòng)較慢產(chǎn)生的誤差。

圖4 紅鰭東方鲀IRF2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表2 部分物種與紅鰭東方鲀IRF2氨基酸序列的相似性

圖 5 紅鰭東方鲀IRF2系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 重組質(zhì)粒pET32a（+）-IRF2的雙酶切鑒定

將純化得到的的IRF2融合蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上經(jīng)過與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，得到一條與預(yù)期的融合蛋白大小相符的特異條帶（圖9），由此可推斷已成功表達(dá)出紅鰭東方鲀IRF2蛋白。

圖7 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

圖8 純化的IRF2融合蛋白的SDS-PAGE分析

圖9 Western blot 分析結(jié)果

3 討論

本研究克隆得到的紅鰭東方鲀IRF2全長(zhǎng)cDNA為1 552 bp，其編碼區(qū)共936 bp，編碼311個(gè)氨基酸，與鱖魚［10］IRF2（編碼299個(gè)氨基酸）的相似度最高，達(dá)79%。而虹鱒魚［11］IRF2的ORF長(zhǎng)1 035 bp，編碼344個(gè)氨基酸。大西洋鮭［12］IRF2氨基酸長(zhǎng)度為343個(gè)氨基酸，含有DBD和IAD2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀IRF2與其他物種一樣，在其N末端具有一個(gè)DNA結(jié)合域（DBD）和一個(gè)IRF結(jié)合域2（IAD2）；在其C末端具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制域（TRD），這3個(gè)區(qū)域非常保守，這與陳曉玲等［18］克隆的褐牙鲆IRF2的序列特征一致。

大腸桿菌因其遺傳背景清楚、表達(dá)量高和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已有多種以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白應(yīng)用于生產(chǎn)。有關(guān)IRFs的體外重組表達(dá)，崔鵬飛等［19］將雞IRF7基因與pET30a連接，在BL21（DE3）中融合表達(dá)該蛋白，并將純化的重組蛋白chIRF7免疫小鼠，制備出鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗體。尹經(jīng)逵等［20］克隆了斜帶石斑魚Epinephelus coioides的IRF1基因，并通過原核表達(dá)的方法得到了以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在的重組蛋白。張躍等［21］構(gòu)建了牙鲆Paralichthys olivaceus IRF的表達(dá)載體pBVfIRF22，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后得到一條分子量約12 kD的特異蛋白。本研究在克隆到紅鰭東方鲀IRF2基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了紅鰭東方鲀IRF2基因的重組表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以可溶性形式存在，避免了對(duì)蛋白的變性、復(fù)性，便于今后對(duì)蛋白活性的研究。在進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)目的條帶條帶比預(yù)期大小稍微偏高，這可能是由于His標(biāo)簽中的堿性氨基酸導(dǎo)致蛋白在電泳過程中移動(dòng)較慢產(chǎn)生的誤差［22］。采用His標(biāo)簽抗體對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行的Western blotting檢測(cè)表明重組載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達(dá)出His標(biāo)簽和目的蛋白，進(jìn)一步證明了目的蛋白的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究克隆了紅鰭東方鲀干擾素調(diào)節(jié)因子2（IRF2）基因，編碼區(qū)全長(zhǎng)為936 bp，共編碼311個(gè)氨基酸。構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET32a（+）-IRF2經(jīng)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)后在大腸桿菌BL21中得以表達(dá)。Western blotting分析證明，利用Ni柱分離和純化得到的融合蛋白即為重組的紅鰭東方鲀IRF2。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Interferon Regulatory Factor 2 from Takifugu rubripes

Interferon Regulatory Factor（IRF）is a transcription factor with multifunctions. The full length cDNA of Takifugu rubripes interferon regulatory factor 2（IRF2）was cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The full-length cDNA of the gene was 1 552 bp，including a 187 bp 5' non-coding region，a 429 bp 3' non-coding region，and 936 bp coding region，and it encoded 311 amino acids. The recombinant pET32a（+）-IRF2 was constructed by ligating code sequence of IRF2 with prokaryotic expression vector pET32a（+）. Then，the recombinant genetic engineering bacteria with expressed IRF2 were obtained by transforming pET32a（+）-IRF2 into competent cell Escherichia coli BL21（DE3）. pET32a（+）-IRF2 was expressed in BL21 under the induction of IPTG. The results from the detection of the purified products by Western blotting showed that the expression of the IRF2 gene in E. coli was high，and the target protein was accurate.

Takifugu rubripes；interferon regulatory factor 2；rapid amplification of cDNA end；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.014

2015-05-25

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201405003-2），大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B11NC091）

孫賽紅，女，碩士，E-mail：sun.saihong@163.com

王秀利，男，博士，教授，研究方向：海洋動(dòng)物功能基因；E-mail：xiuliwang417@sina.com

SUN Sai-hong1，2MA Pu2SUN He2KONG De-rong2Li Hui2QIU Xue-mei2JIANG Zhi-qiang1LIU Hai-ying3LIU Yang2LIU Sheng-cong4MENG Xue-song4WANG Xiu-li1，2

（1. Key Laboratory of Mariculture ＆Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023；2. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023；3.College of Marine Science and Environment，Dalian Ocean University，Dalian 116023；4. Dalian Tianzheng Industrial Co. Ltd.，Dalian 116011）