藍(lán)藻橙色類胡蘿卜素蛋白的基因克隆及在大腸桿菌中的異源表達(dá)和功能分析

劉暢 羅著 張夢(mèng)如 楊玉梅 劉嫻 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應(yīng)用工程研究中心，昆明 650500）

藍(lán)藻橙色類胡蘿卜素蛋白的基因克隆及在大腸桿菌中的異源表達(dá)和功能分析

劉暢 羅著 張夢(mèng)如 楊玉梅 劉嫻 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應(yīng)用工程研究中心，昆明 650500）

旨在體內(nèi)證明藍(lán)藻橙色類胡蘿卜素蛋白（OCP）具備不依賴類胡蘿卜素的單線態(tài)氧（1O2）清除功能。通過PCR擴(kuò)增藍(lán)藻OCP基因，對(duì)其進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，并通過細(xì)菌點(diǎn)板和生長(zhǎng)曲線測(cè)定法檢驗(yàn)它在大腸桿菌中的抗1O2活性。結(jié)果表明，直接從藍(lán)藻水體提取的宏基因組中成功擴(kuò)增得到OCP基因SyOCP，其編碼區(qū)大小為954 bp。生物信息學(xué)分析表明，SyOCP來源于主要藍(lán)藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的可溶性表達(dá)。另外，異源表達(dá)SyOCP的重組大腸桿菌對(duì)常見的1O2光敏誘發(fā)劑染料——亞甲基藍(lán)的耐受性得到了顯著增強(qiáng)。藍(lán)藻OCP（不結(jié)合類胡蘿卜素）內(nèi)在的抗1O2功能在大腸桿菌中得到了體內(nèi)驗(yàn)證。

藍(lán)藻；橙色胡蘿卜素蛋白；宏基因組；單線態(tài)氧；亞甲基藍(lán)

在強(qiáng)光下，產(chǎn)氧光合生物如植物（包括藻類）以及藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）很容易遭受光氧化脅迫。單線態(tài)氧（1O2）是光氧化脅迫中主要的活性氧形式，具有很高反應(yīng)性，攻擊和氧化蛋白質(zhì)、脂類和核酸，特別是能激發(fā)光合反應(yīng)中心PSII中D1蛋白的降解，產(chǎn)生光氧化損傷及光抑制現(xiàn)象［1-6］。另外，1O2能作為信號(hào)分子在植物應(yīng)對(duì)光氧化脅迫中起著重要作用，而這個(gè)過程可能涉及到類胡蘿卜素分子的參與［7-9］。

1O2可通過多種方式產(chǎn)生，但一個(gè)共同的途徑是從光敏劑（色素或染料）分子的三線態(tài)形式通過電子能量轉(zhuǎn)移形成。在產(chǎn)氧光合作用中，葉綠素（藍(lán)藻中為膽色素）分子是很好的光敏劑，受光能激發(fā)形成三線態(tài)葉綠素（或膽色素），然后與分子氧反應(yīng)很容易形成1O2。特別是強(qiáng)光條件下，光合電子傳遞鏈大量減少以及電子傳遞速率飽和，過剩光能會(huì)激發(fā)大量的三線態(tài)葉綠素（或膽色素）和1O2產(chǎn)生，從而形成氧化脅迫［1，3，5，9］。

植物和藍(lán)藻都已形成一套光保護(hù)機(jī)制，減少?gòu)?qiáng)光下到達(dá)光合反應(yīng)中心的能量和1O2的產(chǎn)生［1，5，7-9］。在植物中，與類囊體膜上葉綠素共存的類胡蘿卜素除了能輔助捕獲光能外，還能將強(qiáng)光下的過剩光能耗散為熱，并能直接作為1O2的底物進(jìn)行非酶氧化，從而減少光合反應(yīng)中心1O2的濃度，舒緩光氧化脅迫。因此，植物中的類胡蘿卜素是能量和單線態(tài)氧的雙重淬滅劑［5，7］。另外，類胡蘿卜素由1O2非酶氧化形成的醛類或酮類、含有一個(gè)活性羰基的裂解產(chǎn)物能夠起到信號(hào)分子作用，誘導(dǎo)1O2應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)光氧化脅迫的抗性［8］。

相比較，這種能量和1O2雙重淬滅的光保護(hù)作用在藍(lán)藻中則主要由橙色類胡蘿卜素蛋白（Orange Carotenoid Protein，OCP）來完成［1］。OCP是一種結(jié)合酮式類胡蘿卜素（如3'-羥基玉米黃素）的可溶性藍(lán)藻蛋白，在絕大多數(shù)含有藻膽體的藍(lán)藻中都有存在［10］。藍(lán)藻OCP在光感應(yīng)和能量猝滅方面是必需的。在強(qiáng)的藍(lán)綠光下，OCP被光激活，在藻膽體中將過剩光能耗散為熱，同時(shí)減少1O2形成［11-14］。不過，最新研究發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)的橙紅光條件下，OCP不被光激活，但仍能保護(hù)藍(lán)藻細(xì)胞，這種光保護(hù)與OCP作用減少了1O2的濃度有關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明OCP在沒有類胡蘿卜素存在情況下本身就是一個(gè)很好的1O2清除劑［15］。OCP的水溶性、結(jié)合類胡蘿卜素的特性以及本身具備的1O2淬滅功能使得它在抗氧化應(yīng)用方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。目前，已有報(bào)道在大腸桿菌中重組表達(dá)OCP和合成類胡蘿卜素，進(jìn)而生產(chǎn)結(jié)合類胡蘿卜素的OCP［16］。

但是，游離態(tài)OCP（不結(jié)合類胡蘿卜素）本身清除1O2的活性仍然缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究首先從藍(lán)藻水體提取的宏基因組中擴(kuò)增OCP基因SyOCP，然后以大腸桿菌（本身不合成類胡蘿卜素）為背景，以光敏劑染料亞甲基藍(lán)（MB：Methylene blue）產(chǎn)生光氧化脅迫［17］，通過分析SyOCP重組大腸桿菌對(duì)MB的耐受性，旨在體內(nèi)驗(yàn)證游離態(tài)藍(lán)藻OCP內(nèi)在的抗1O2功能。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）以及質(zhì)粒pET30a（+）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Phusion高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Nde I和Sac I、DNA連接酶均為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、PCR mix、DNA和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)均為北京Transgene公司產(chǎn)品。亞甲基藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品，其它生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)藻水體宏基因組DNA的提取 取一定體積的藍(lán)藻水體（取自昆明滇池），12 000 r/min離心2-5 min，離心后的沉淀相當(dāng)于1.2 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌離心后的菌體。加0.5 mL提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.5，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl），重懸徹底；加等體積的Tris飽和酚，混勻，65℃加熱5-10 min，中間短促混勻2-3次，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的氯仿，混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置30 min；12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗一次，室溫干燥5-10 min；加入50-100 mL H2O 溶解沉淀。

1.2.2 藍(lán)藻SyOCP基因的克隆 根據(jù)GenBank中藍(lán)藻Synechocystis sp. PCC 6803的OCP對(duì)應(yīng)DNA序列（Acc. CP003265.1的1765600-1766800 nt）設(shè)計(jì)PCR引物（表1）。取0.5-1 μL提取的藍(lán)藻水體宏基因組DNA為模板，利用引物SyOCP-Fw、SyOCP-Rv和Phusion 高保真DNA聚合酶進(jìn)行第一輪PCR（退火溫度為56℃）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，根據(jù)情況進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋或不稀釋，取1 μL為模板，用引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc和Phusion 高保真DNA聚合酶進(jìn)行第二輪PCR（50℃退火，1個(gè)循環(huán)；60℃退火，30個(gè)循環(huán)）。將膠回收的第二輪PCR產(chǎn)物SyOCP用Nde I、Sac I雙酶切，純化后與同樣酶切的質(zhì)粒pET30a（+）連接、轉(zhuǎn)化DH5α，然后利用引物SyOCP-5Nd和Tt7Dw-Rv、通過菌落PCR（退火溫度為53℃）鑒定陽(yáng)性重組克隆pET（SyOCP），隨后通過測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本工作中所使用的引物

1.2.3 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白電泳 將表達(dá)載體pET（SyOCP）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。挑單克隆接菌于LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），37℃培養(yǎng)過夜；按1∶100比例將菌液轉(zhuǎn)接于相同培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6；然后，加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，30℃繼續(xù)培養(yǎng)7 h。誘導(dǎo)表達(dá)菌離心后的菌體用PBS緩沖液（pH7.4）重懸，然后進(jìn)行超聲破菌。取16 μL 細(xì)菌裂解物，12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移全部上清作為樣品S，沉淀用16 μL PBS緩沖液重懸后作為樣品P，同時(shí)取16 μL細(xì)菌裂解物作為樣品T。另外，在加IPTG前取200 μL菌液，離心后菌體用16 μL PBS緩沖液重懸，作為未誘導(dǎo)樣品（UI）。所有樣品加4 μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，然后用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析［18］。通過比較誘導(dǎo)前后的蛋白電泳條帶判斷SyOCP基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況。

1.2.4 大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)的抗性分析 從大腸桿菌BL21（DE3）［含表達(dá)載體pET（SyOCP）或?qū)φ湛蛰d體pET30a（+）］的LB平板上挑單克隆接菌，37℃培養(yǎng)過夜；按1∶100比例進(jìn)行菌液轉(zhuǎn)接，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6（或調(diào)至0.6），然后進(jìn)行以下兩種實(shí)驗(yàn)：（1）菌落點(diǎn)板：將菌液進(jìn)行梯度倍數(shù)（1、2、4和8）稀釋，各取2 μL成排點(diǎn)樣在LB平板［含100 μg/mL 氨芐青霉素、0.5 mmol/L IPTG以及不同濃度（20、30和40 μmol/L）的亞甲基藍(lán)］上，平板于37℃光照下培養(yǎng)1-2 d，最后通過Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照。（2）細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定：往菌液加入終濃度0.5 mmol/L IPTG以及不同終濃度（0 μmol/L和25 μmol/L）的亞甲基藍(lán)，37℃光照下繼續(xù)培養(yǎng)9 h，每隔1 h測(cè)定OD600值；最后以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)進(jìn)行作圖。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，通過比較表達(dá)菌［含pET（SyOCP）］和對(duì)照菌［含pET30a（+）］的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)曲線，判定其對(duì)亞甲基藍(lán)的抗性。

1.2.5 生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)分析 引物設(shè)計(jì)、核酸和蛋白序列分析通過Invitrogen公司的分子生物學(xué)軟件Vector NTI Advance 11進(jìn)行。使用NCBI在線工具Blastn和Blastp分別進(jìn)行核酸和蛋白的序列多重比對(duì)，并采用鄰近法（Neighbor-joining）生成與其關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及作圖使用Microsoft Excel程序。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)藻SyOCP基因的克隆

藍(lán)藻在營(yíng)養(yǎng)豐富的淡水中能大量繁殖。本工作從取自昆明滇池的藍(lán)藻水體中提取宏基因組總DNA，取1 μL作為模板，用引物SyOCP-Fw、SyOCPRv進(jìn)行第一輪PCR，取5 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1-A）未能明顯觀察到目的擴(kuò)增條帶（預(yù)期大小為1 036 bp）。直接取第一輪PCR產(chǎn)物1 μL作為模板，用引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc進(jìn)行第二輪PCR（巢式），取5 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果獲得了非常明亮的、特異性好的擴(kuò)增條帶，但大小似乎偏?。▓D1-B）。但該條帶的膠回收產(chǎn)物1 μL經(jīng)電泳檢測(cè)后，大小與預(yù)期（972 bp）一致（圖1-C），取名為SyOCP。由于引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc的5'末端分別引入了酶切位點(diǎn)Nde I和Sac I，因此第二輪PCR產(chǎn)物SyOCP通過Nde I、Sac I雙酶切，直接克隆到了大腸桿菌表達(dá)載體pET30a（+）上，菌落PCR（使用引物SyOCP-5Nd和Tt7Dw-Rv）條帶明亮、大小正確（圖1-D），表明獲得了藍(lán)藻SyOCP基因的大腸桿菌重組表達(dá)載體pET（SyOCP）。

圖1 SyOCP基因的克隆

2.2 藍(lán)藻SyOCP基因的生物信息學(xué)分析

利用T7啟動(dòng)子和終止子引物對(duì)pET（SyOCP）質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果表明擴(kuò)增的SyOCP基因編碼區(qū)大小為954 bp，編碼一個(gè)317氨基酸的蛋白（理論分子量大小為34.7 kD）。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中藍(lán)藻Synechocystis PCC 6803的OCP相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增的SyOCP基因有4個(gè)堿基突變（T與C之間互變），但均為沉默突變，未造成蛋白的氨基酸序列改變（圖2，黑體陰影字母為突變產(chǎn)生堿基）。

分別以SyOCP基因編碼區(qū)及其推導(dǎo)的蛋白序列作為檢索對(duì)象，利用NCBI 在線Blastn、Blastp工具進(jìn)行核酸和蛋白的序列多重比對(duì)，隨后分別生成基于鄰近法的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，本研究從藍(lán)藻水體中克隆的SyOCP與其直系同源物（Ortholog）在基因和蛋白進(jìn)化上似乎僅局限于藍(lán)細(xì)菌內(nèi)，它們的最遠(yuǎn)親緣體為擬甲色球藻（Chroococcidiopsis，一種耐極端環(huán)境的最原始藍(lán)藻），植物中沒有其同源物。而且，SyOCP幾乎可以認(rèn)為就源自于自然界中的主要集胞藻菌（Synechocystis sp. PCC 6803）。另外還發(fā)現(xiàn)，就SyOCP同源比較而言，在基因水平上集胞藻與聚球藻（Synechococcus）、無類囊體藍(lán)藻（Gloeobacter violaceus）等最同源（圖3-A），而在蛋白水平上集胞藻則與螺旋藻（Spirulina）和節(jié)旋藻（Arthrospira）的親緣關(guān)系最近（圖3-B）。有趣的是，在基因系統(tǒng)進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)了SyOCP的高度同源基因存在于枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中（圖3-A），其中原因還不得而知。

2.3 藍(lán)藻SyOCP基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

含表達(dá)載體pET（SyOCP）的大腸桿菌BL21（DE3）用0.5 mmol/L IPTG于30℃誘導(dǎo)表達(dá)7 h，超聲裂解后經(jīng)12% SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖4）表明SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的表達(dá)，而且重組表達(dá)蛋白大部分可溶，位于上清組分（S）中，大小接近于其理論分子量（34.6 kD）。

2.4 異源表達(dá)SyOCP顯著增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)的抗性

本研究進(jìn)一步分析了SyOCP在大腸桿菌中的功能，即檢測(cè)異源表達(dá)SyOCP的大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)（MB）的抗性。菌落點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，含表達(dá)載體pET（SyOCP）的大腸桿菌BL21（DE3）菌株相比含對(duì)照空載體pET30a（+）的菌株，在無MB平板上的菌落生長(zhǎng)沒有明顯差異；而在所有含不同濃度（20、30 和40 μmol/L）MB平板上的菌落生長(zhǎng)都受抑制，但前者狀況更好，而且這種差異整體上隨點(diǎn)菌稀釋倍數(shù)的增加和MB濃度的增加而愈加顯著。同時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果（圖6）也表明，大腸桿菌生長(zhǎng)確實(shí)受MB（25 μmol/L）抑制，但含pET（SyOCP）的菌株相比對(duì)照菌株［含pET30a（+）］生長(zhǎng)得更快，受抑制程度更低。這些結(jié)果歸納起來說明，在大腸桿菌中異源表達(dá)SyOCP顯著提高了宿主菌對(duì)MB的抗性。

圖2 SyOCP基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的蛋白序列

3 討論

藍(lán)藻水溶性橙色胡蘿卜素蛋白（OCP）在強(qiáng)光下被激活發(fā)揮雙重光保護(hù)作用——淬滅過剩能量和1O2，幫助藍(lán)藻細(xì)胞抵御光氧化脅迫［1，11-14］；同時(shí)，OCP蛋白本身還可以直接作為1O2的清除劑［15］，但游離態(tài)OCP的體內(nèi)生物學(xué)活性仍沒有得到驗(yàn)證。

本研究成功從滇池藍(lán)藻水體提取的宏基因組中擴(kuò)增得到OCP基因SyOCP。生物信息學(xué)分析表明SyOCP就是來源于主要藍(lán)藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。這種不需要預(yù)先分離藍(lán)藻特定菌株、直接從藍(lán)藻水體宏基因組中擴(kuò)增OCP基因的簡(jiǎn)捷方法可用于克隆其它藍(lán)藻基因，甚至可用作借鑒從其它環(huán)境宏基因組中分離目標(biāo)基因。不過，特別要提及的是，最好采用兩輪PCR擴(kuò)增，因?yàn)槭纵哖CR的目標(biāo)產(chǎn)物量經(jīng)常較低，而第二輪嵌套式PCR則很容易擴(kuò)增出足量的目標(biāo)基因。

通過IPTG誘導(dǎo)，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的蛋白表達(dá)，并且大部分可溶。該結(jié)果印證了OCP的水溶特性。另外，我們通過菌落點(diǎn)板法和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定法分析，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)SyOCP顯著增強(qiáng)了重組大腸桿菌對(duì)常見1O2光敏誘發(fā)劑——亞甲基藍(lán)的耐受性（圖5，圖6）。大腸桿菌本身不合成類胡蘿卜素，所用培養(yǎng)基中也沒有添加類胡蘿卜素，因此這種耐受性應(yīng)該歸因于大腸桿菌重組表達(dá)的SyOCP蛋白對(duì)1O2（亞甲基藍(lán)受光激發(fā)產(chǎn)生）的直接清除。該結(jié)果是通過細(xì)胞體內(nèi)分析驗(yàn)證了游離態(tài)OCP直接淬滅1O2的生物學(xué)活性。

圖3 鄰近法構(gòu)建SyOCP基因（A）及蛋白（B）的系統(tǒng)進(jìn)化樹

水溶性抗1O2的OCP能結(jié)合脂溶性的類胡蘿卜素，可被認(rèn)為是一類“載脂蛋白”。 類胡蘿卜素又是重要的抗氧化劑（包括抗1O2），因此推測(cè)結(jié)合類胡蘿卜素的OCP應(yīng)該起著獨(dú)特的抗氧化作用（面大、部位廣、效果佳），它在抗氧化方面的應(yīng)用前景十分廣闊。目前已有報(bào)道在大腸桿菌中重組生產(chǎn)結(jié)合類胡蘿卜素的OCP［16］，可以作為抗氧化添加組分用于食品、化妝品等行業(yè)。另外，我們注意到，植物中的強(qiáng)光保護(hù)機(jī)制主要是通過類囊體膜上與葉綠素共存的類胡蘿卜素直接起作用，將過剩光能耗散為熱，減少三線態(tài)葉綠素和1O2產(chǎn)生，并作為底物以非酶氧化方式清除1O2，從而最終減少光反應(yīng)活性中心PSII中的1O2濃度，緩解光氧化脅迫和光抑制［5，7］。生物信息學(xué)分析表明植物中沒有OCP的直系同源物，那么藍(lán)藻中獨(dú)有的、由OCP介導(dǎo)的光保護(hù)機(jī)制是否可以通過轉(zhuǎn)基因引入以提高植物對(duì)強(qiáng)光的耐受性，是我們下一步要探討的問題，而本研究已為此奠定了較好的前期研究基礎(chǔ)。

圖4 SyOCP基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的重組表達(dá)

圖5 菌落點(diǎn)板分析SyOCP表達(dá)大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)（MB）的抗性

4 結(jié)論

本研究直接從藍(lán)藻水體提取的宏基因組中擴(kuò)增得到OCP基因SyOCP，該基因來源于主要藍(lán)藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。通過IPTG誘導(dǎo)，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的可溶性表達(dá)。而且，異源表達(dá)SyOCP的重組大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)的耐受性得到了顯著提高，從而在體內(nèi)驗(yàn)證了藍(lán)藻OCP（不結(jié)合類胡蘿卜素）內(nèi)在的抗1O2功能。

圖6 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線分析SyOCP表達(dá)大腸桿菌對(duì)亞甲基藍(lán)（MB）的抗性

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Gene Cloning of the Orange Carotenoid Protein from Cyanobacteria，and Its Ectopic Expression and Functional Evaluation in Escherichia coli

LIU Chang LUO Zhu ZHANG Meng-ru YANG Yu-mei LIU Xian GONG Ming ZOU Zhu-rong
（Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy（Ministry of Education），Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

The aim is to verify the orange carotenoid protein（OCP）in cyanobacteria can scavenge singlet oxygen（1O2）independent of carotenoids in vivo. The cyanobacterial OCP gene was amplified by PCR，and then subjected to prokaryotic inducible expression and further evaluation of anti-1O2activity in Escherichia coli by bacterial dot-plating test and growth curve assay. Results showed that the gene（SyOCP）of OCP was successfully amplified from the metagenome of the cyanobacteria water，with a coding region of 954 bp. Bioinformatics analysis indicated that SyOCP was from the major cyanobacteria species—Synechocystis sp. PCC 6803. By IPTG induction，the SyOCP gene was highly expressed in E. coli with soluble protein. In addition，the ectopic expression of SyOCP in recombinant E. coli resulted in the notable enhancement of it on the tolerance to the common1O2-induced photosensitizer dye，methylene blue. The intrinsic anti-1O2role of cyanobacterial OCP（without binding carotenoids）was in vivo verified in E. coli.

cyanobacteria；orange carotenoid protein；metagenome；singlet oxygen；methyl blue

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.021

2015-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160169，31460067）

劉暢，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生理和分子生物學(xué)；E-mail：501705740@qq.com

鄒竹榮，男，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物學(xué)；E-mail：zouzr09@sina.com