球根白絲膜菌γ-actin基因的克隆及表達(dá)分析

張虹 崢嶸

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022）

球根白絲膜菌γ-actin基因的克隆及表達(dá)分析

張虹 崢嶸

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022）

根據(jù)真菌肌動(dòng)蛋白（actin）基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，用簡(jiǎn)并PCR法和RACE技術(shù)分離得到球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）γ-肌動(dòng)蛋白基因（Lb-act）的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列全長(zhǎng)為1 357 bp，包含一個(gè)1 137 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼378個(gè)氨基酸，5'端非翻譯區(qū)（5' UTR）92 bp，3' UTR長(zhǎng)度128 bp。Port Param軟件在線分析結(jié)果表明，該cDNA所編碼的蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為5.12，相對(duì)分子質(zhì)量為95.022 kD，具有真菌γ-actin基因3個(gè)保守特征序列。Blast同源性檢索結(jié)果表明，Lb-act氨基酸序列與擔(dān)子菌肌動(dòng)蛋白序列有較高的相似性，其與雙色蠟?zāi)⒌募?dòng)蛋白氨基酸序列的親緣關(guān)系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培養(yǎng)條件下表達(dá)量基本一致，驗(yàn)證了該基因作為分子內(nèi)標(biāo)的可靠性。

球根白絲膜菌；肌動(dòng)蛋白；cDNA；克隆

肌動(dòng)蛋白（Actin）是真核生物細(xì)胞中普遍存在的重要蛋白質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞骨架中的微絲（microfilament）系統(tǒng)。作為構(gòu)成細(xì)胞骨架微絲系統(tǒng)的基本組分，肌動(dòng)蛋白起著重要作用，如參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞極性的建成、細(xì)胞壁沉積以及細(xì)胞伸長(zhǎng)等生命活動(dòng)［1，2］。該蛋白主要包括α-actin、β-actin 和γ-actin 3種類型，其中，α-actin通常存在于平滑肌細(xì)胞中，而β-actin和γ-actin則幾乎在所有細(xì)胞中存在。目前在高等真核生物中已報(bào)道了多個(gè)不同的actin基因，在真菌中報(bào)道較多的是γ-actin基因［3］。actin基因在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，是高度保守的管家基因，因此，通常在實(shí)時(shí)定量PCR中作為內(nèi)參基因。此外，actin基因現(xiàn)已在植物界、動(dòng)物界和真菌界作為分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要基因之一［4］。

球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、絲膜菌科（Cortinariaceae）、白絲膜菌屬（Leucocortinarius），分布于黑龍江、甘肅、吉林、內(nèi)蒙古等地［5］。球根白絲膜菌可以食用，具有廣闊的經(jīng)濟(jì)用途，并且球根白絲膜菌侵染油松，能與油松形成典型的外生菌根［6］，對(duì)油松生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，菌根形成后不僅可以有效提高寄主植物耐干旱性［7，8］、抗重金屬性［9］、促進(jìn)植物在鹽漬環(huán)境下的生長(zhǎng)［10］，而且能夠顯著提高油松的抗旱能力。前人研究?jī)H揭示菌根真菌影響植物抗逆性的一些現(xiàn)象，但本質(zhì)上菌根真菌對(duì)于植物抗逆性的調(diào)節(jié)是基于對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，即通過(guò)上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達(dá)以及誘導(dǎo)新的逆境基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物抗逆性［11］，菌根同時(shí)能增強(qiáng)植物的防病、抗病能力［12］。球根白絲膜菌功能基因的研究需要一個(gè)表達(dá)量相對(duì)恒定的內(nèi)參基因，actin基因被證明在逆境脅迫條件下表達(dá)量相對(duì)恒定［13］，也經(jīng)常作為內(nèi)參應(yīng)用于植物抗旱基因。

由于受全球環(huán)境變化的影響，內(nèi)蒙古大青山降水量逐年下降，干旱導(dǎo)致的大量菌根真菌喪失，在常規(guī)造林的過(guò)程中使其自然感染菌根真菌比較困難，人為菌根化苗木的培育顯得十分重要，因此，利用球根白絲膜菌侵染油松等植物提高寄主植物的抗干旱性，對(duì)于提高造林成活率、提高林地肥力利用率及促進(jìn)貧瘠林地上的林木生長(zhǎng)有著十分重要的意義，在我國(guó)廣大西部干旱區(qū)篩選不同樹(shù)種的優(yōu)良菌根真菌是實(shí)現(xiàn)菌根化苗木造林的重要技術(shù)基礎(chǔ)［14］。而有關(guān)球根白絲膜菌菌絲體方面研究報(bào)道較少，盧麗君［15］報(bào)道了其在不同培養(yǎng)基和pH值培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)特性的研究，邰圖雅［16］報(bào)道了其分離及培養(yǎng)特性的研究。迄今為止，關(guān)于球根白絲膜菌的actin基因研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究以球根白絲膜菌菌絲體培養(yǎng)物為材料，用簡(jiǎn)并PCR法和RACE技術(shù)克隆球根白絲膜菌γ-actin cDNA，分析其在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)，并驗(yàn)證其作為內(nèi)標(biāo)基因的可靠性，旨在為探究球根白絲膜菌與油松菌根共生體的抗逆性相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑 球根白絲膜菌通過(guò)子實(shí)體組織分離獲得，現(xiàn)保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；GoldScript cDNA合成試劑盒（Invitrogen）；MidiPurification Kit 離心柱型普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根公司）；5' RACE 試劑盒（Invitrogen）；SMAR TerTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒（Clontech）；Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）；克隆載體pMD19-T（TaKaRa）；感受態(tài)大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α（TaKaRa）。

1.1.2 引物 根據(jù)已知真菌的肌動(dòng)蛋白基因序列，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物L(fēng)b-actF和Lb-actR，利用簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增球根白絲膜菌γ-actin cDNA核心片段；根據(jù)分離得到的核心片段序列，設(shè)計(jì)該基因的特異性引物GSP-1、GSP-2、GSP-3和GSP-4、GSP-5，用于5'和3'-RACE-PCR，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成（表1）。

表1 球根白絲膜菌γ-actin基因cDNA克隆引物序列

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 采用RNA提取試劑盒提取球根白絲膜菌總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度和完整性檢測(cè)。利用GoldScript cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 球根白絲膜菌γ-actin cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增及產(chǎn)物克隆、測(cè)序 核心片段擴(kuò)增，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（總體積50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL，2 mmol/L dNTPs 3 μL，10 μmol/L 的上游和下游引物各2 μL，cDNA（約30 ng）5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，去離子水32.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的DNA片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。

5'-RACE擴(kuò)增基因末端，采用5'-RACE試劑盒克隆球根白絲膜菌總γ-actin基因的5'端序列。參照試劑盒說(shuō)明，對(duì)總RNA進(jìn)行目的基因第1鏈cDNA的合成，純化后，對(duì)cDNA末端加上多聚C。用引物GSP-2和試劑盒內(nèi)的橋連鉚釘引物AAP對(duì)已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第1輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：加dC尾的cDNA 5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L的引物GSP-2和橋連鉚釘引物AAP各2.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。用引物GSP-3和試劑盒內(nèi)的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行第2輪巢式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：第1輪PCR產(chǎn)物5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L的引物GSP-3和引物AUAP各1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序同上。將第2 輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。

3'-RACE 擴(kuò)增基因末端，參照RACE 試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3' CDS primer A對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，用引物GSP-4和UPM進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 2.5 μL，引物各1 μL，Maser Mix 41.5 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)至50 μL，降落PCR反應(yīng)程序：94℃30 s，72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃3 min，27個(gè)循環(huán)。將第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，用引物GSP-5和UPM進(jìn)行第2 輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)程序：94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)。將第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。將上述3個(gè)純化后的PCR產(chǎn)物分別與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌DH5α，菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆后送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將上述3個(gè)純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌DH5α，菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆后送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 球根白絲膜菌γ-actin表達(dá)分析 分別在不同碳源、磷水平條件下培養(yǎng)球根白絲膜菌菌絲體，進(jìn)行其γ-actin的表達(dá)特異性分析。PACH培養(yǎng)基中分別選用不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、D-山梨醇、可溶性淀粉）；用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mmol/L 6個(gè)水平磷（KH2PO4）濃度，28℃培養(yǎng)菌絲體20 d后提取菌絲體總RNA。以等量的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，取等量cDNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，再取等量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)，通過(guò)比較目的條帶的灰度判定基因表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.2.4 序列比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 根據(jù)獲得的mRNA拼接序列，網(wǎng)上Blast搜索同源性高的序列，進(jìn)行同源性分析。利用NCBI的OFR Finder（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf /gorf. Html）識(shí)別OFR（open reading frame）序列并推定其所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。使用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)的PortParam軟件在線（http:// www.expasy.org /tools /protparam.html）分析推定蛋白質(zhì)基本性質(zhì)。利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域搜索（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。在GenBank中，搜索不同真菌的肌動(dòng)蛋白序列，與球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白序列進(jìn)行Clustal W多重序列比較，使用MEGA5軟件鄰接法（Neighbor-Joining，NJ法）運(yùn)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用自展法（Bootstraping）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的檢測(cè)結(jié)果

取10 μL RNA樣液，稀釋100倍，在核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendrof BioPhotometer）中進(jìn)行檢測(cè)，OD260/OD280為 1.94-1.96，OD260/OD230為 2.45-2.60，說(shuō)明RNA純度高，無(wú)蛋白質(zhì)、酚污染，均一性很好。電泳結(jié)果（圖1）表明，28S rRNA、18S rRNA與5S rRNA帶形整齊，無(wú)拖尾，說(shuō)明RNA完整性很好，點(diǎn)樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染，證明提取的RNA質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的RT-PCR。

圖1 球根白絲膜菌RNA電泳結(jié)果

2.2 cDNA全長(zhǎng)的分析

用簡(jiǎn)并PCR法擴(kuò)增出球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白基因核心片段，結(jié)果（圖2-A）顯示，在標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量1 kb處出現(xiàn)較亮的DNA條帶，大小基本接近目的條帶。圖2-B和2-C顯示，分別在250 bp處出現(xiàn)了較亮的條帶，表明5'和3'末端片段大小分別為200-250 bp和250-500 bp。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)全長(zhǎng)拼接，球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)序列除1 137 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。還包含5'端92 bp的非編碼片段和3'端128 bp的非編碼片段，同時(shí)3'端有一個(gè)27個(gè)核苷酸的polyA尾，將其命名為L(zhǎng)b-act，cDNA全長(zhǎng)序列提交GenBank，登錄號(hào)為KC995173。

圖2 簡(jiǎn)并PCR及RACE-PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3 氨基酸序列分析

Lb-act編碼378個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量大小為95.022 kD，理論等電點(diǎn)是5.12；根據(jù)Lb-act氨基酸序列，Blast搜索出12 種同源性高的序列，其中，Lb-act氨基酸序列與擔(dān)子菌肌動(dòng)蛋白序列有較高的相似性。該序列與Punctularia strigosozonata、裂褶菌（Schizophyllum commune）、粗毛硬革菌（Stereum hirsutum）、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）4 種真菌的肌動(dòng)蛋白氨基酸序列（EIN04355、XP003026150、EIM-85406和XP001884444）相似性最高，達(dá)99%，其次與嗜藍(lán)孢孔菌屬的Fomitiporia mediterranea、雙孢蘑菇（Agaricus bisporusva）、干朽菌（Serpula lacrymans）、毒蠅傘（Amanita muscaria）4 種真菌的肌動(dòng)蛋白氨基酸序列（EKM82128、EJD00785、ABQ17974和EGO04181）相似性達(dá)98%，與原毛平革菌屬（Phanerochaete）的Phanerochaete carnosa、皺木耳（Auricularia delicate）、乳牛肝菌等真菌的肌動(dòng)蛋白氨基酸序列（EKM59011、EJD35981和AF156258）相似性達(dá)97%。

圖3 不同碳源培養(yǎng)條件下Lb-act的表達(dá)

圖4 不同磷水平下Lb-act的表達(dá)

2.4 不同碳源和磷水平培養(yǎng)條件下表達(dá)特性及穩(wěn)定性分析

半定量PCR 分析結(jié)果（圖3，圖4）顯示，不論是單糖葡萄糖，還是雙糖麥芽糖和蔗糖，多糖可溶性淀粉以及醇類物質(zhì)D-山梨醇，還是在不同磷水平條件下Lb-act基因均表達(dá)，且表達(dá)量基本一致，表明該基因的表達(dá)不受外界碳源和磷水平變化的影響。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

為進(jìn)一步探討球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白與其他擔(dān)子菌（包括腐生型和外生菌根真菌）、叢枝菌根真菌（AMF）和子囊菌肌動(dòng)蛋白在分子系統(tǒng)學(xué)上親緣關(guān)系，根據(jù)Lb-act蛋白序列，在 GenBank中搜索并參考卓侃等［3］報(bào)道，獲得16種真菌的肌動(dòng)蛋白序列。利用MEGA5.0軟件，通過(guò)N-J法運(yùn)算1 000次，獲得了球根白絲膜菌與上述15種真菌的肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。

圖5 16種真菌的肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，上述16種肌動(dòng)蛋白序列聚類為擔(dān)子菌、AM真菌和子囊菌3個(gè)分化群。本研究的球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白聚在擔(dān)子菌分化群，與雙色蠟?zāi)⒕蹫橐恢?，其親緣關(guān)系最近，接著與毒蠅傘、粘蓋牛肝菌的肌動(dòng)蛋白親緣關(guān)系近，與灰擬鬼傘和黃孢原毛平革菌的肌動(dòng)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這在一定程度上可以說(shuō)明能夠形成外生菌根的真菌肌動(dòng)蛋白相似性較高。本系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中的AM真菌肌動(dòng)蛋白由2個(gè)次級(jí)分化群組成，光壁無(wú)梗囊霉與Funneliformis caledonium聚為一支，珍珠巨孢囊霉與雙紫盾巨孢囊霉聚為其姊妹支。子囊菌肌動(dòng)蛋白由2個(gè)次級(jí)分化群組成。

3 討論

肌動(dòng)蛋白是真核生物細(xì)胞中普遍存在的最保守的古老蛋白之一，在進(jìn)化上具有高度的保守性［17］。本研究通過(guò)簡(jiǎn)并PCR法和RACE技術(shù)首次克隆了球根白絲膜菌γ-肌動(dòng)蛋白的cDNA 全長(zhǎng)序列，其具有actin基因的保守特征序列，與前人報(bào)道的真菌γ-actin基因特征一致［18］。 許多研究結(jié)果表明不同的生物中肌動(dòng)蛋白的數(shù)目變化很大［19］，除了大多數(shù)酵母菌和絲狀子囊菌只有1個(gè)單一的肌動(dòng)蛋白基因外，其他真菌有少數(shù)肌動(dòng)蛋白基因［20］。從外生菌根真菌乳牛肝菌克隆得到2個(gè)肌動(dòng)蛋白基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其肌動(dòng)蛋白基因在營(yíng)養(yǎng)菌絲及與宿主植物形成的菌根共生體中表達(dá)恒定［21］，一個(gè)理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是穩(wěn)定的表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，且表達(dá)量是無(wú)顯著差別的［22］，本實(shí)驗(yàn)也得到相同結(jié)果，在不同碳源和磷水平培養(yǎng)條件下，Lb-act表達(dá)恒定。16種真菌actin基因氨基酸序列同源性比對(duì)分析表明，球根白絲膜菌與其它15種真菌的Actin的氨基酸序列僅在少數(shù)位點(diǎn)上有差異，由此說(shuō)明Actin在氨基酸序列水平上具有高度的同源性［23］，進(jìn)一步證明actin基因是高度保守的看家基因。因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的Lb-act可為將來(lái)球根白絲膜菌-油松菌根共生體功能基因的研究奠定基礎(chǔ)。

由于肌動(dòng)蛋白基因在進(jìn)化上的保守性，常被用于構(gòu)建物種和基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以衡量不同物種之間的親緣關(guān)系和分化時(shí)間［24］。本研究構(gòu)建的肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中16種不同真菌肌動(dòng)蛋白聚為擔(dān)子菌、AM真菌和子囊菌3個(gè)分化群，這一聚類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)果一致。另外，有學(xué)者認(rèn)為擔(dān)子菌是由子囊菌進(jìn)化而來(lái)［25］，但在該進(jìn)化樹(shù)中，擔(dān)子菌與子囊菌親緣關(guān)系并不是最近，盡管不斷發(fā)現(xiàn)的分子特征給真菌系統(tǒng)學(xué)的研究提供了新的信息，但分子系統(tǒng)學(xué)并不能解決所有與生物系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的問(wèn)題，因?yàn)榉肿颖旧硪泊嬖谝欢ǖ木窒扌?，某一特定的分子信息可能缺乏解決真菌某一類群系統(tǒng)發(fā)育歷史所必需的一些性狀［26］，因此γ-actin基因能否反映較低分類階元，如屬級(jí)階元物種的分類進(jìn)化關(guān)系及子囊菌與擔(dān)子菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系有待更多物種γ-actin基因的獲得來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)肌動(dòng)蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)還只是基因的分子進(jìn)化樹(shù)，雖然在區(qū)分親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種時(shí)具有一定的參考價(jià)值，但對(duì)具較近親緣關(guān)系的物種則無(wú)法做出精確衡量。完善的物種進(jìn)化樹(shù)有待于今后更多肌動(dòng)蛋白基因的發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)進(jìn)化分析方法的改進(jìn)。將球根白絲膜菌Lb-act蛋白序列與Blast搜索出的高同源性序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該序列與多種擔(dān)子菌肌動(dòng)蛋白氨基酸序列高度相似，由聚類圖可知，球根白絲膜菌與雙色蠟?zāi)⒂H緣關(guān)系最近，但這兩種菌形態(tài)及分類地位差異較大。在肌動(dòng)蛋白序列分析中不同目真菌聚為一類，一方面可能表明其肌動(dòng)蛋白在進(jìn)化上具有高度保守性，另一方面可能與外生菌根真菌本身的進(jìn)化有關(guān)，這些疑問(wèn)是今后關(guān)注的熱點(diǎn)。本聚類結(jié)果在肌動(dòng)蛋白序列上初步分析了球根白絲膜菌與其他15種真菌間的相互關(guān)系，但由于未搜索到更多真菌肌動(dòng)蛋白基因方面的信息，不能在較低的分類階元更好地反映球根白絲膜菌的分類進(jìn)化地位，因此球根白絲膜菌與其他真菌間的親緣關(guān)系有待于更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

球根白絲膜菌肌動(dòng)蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)序列除1 137 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）外，還包含5'端 92 bp的非編碼片段和3'端128 bp的非編碼片段，同時(shí)3'端有一個(gè)27個(gè)核苷酸的polyA尾，將其命名為L(zhǎng)b-act，Lb-act氨基酸序列與擔(dān)子菌肌動(dòng)蛋白序列有較高的相似性，該基因在不同碳源和磷水平條件下表達(dá)恒定，可作為內(nèi)參基因，cDNA全長(zhǎng)序列提交GenBank，登錄號(hào)為KC995173。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of γ-actin Gene from Leucocortinarius bulbiger

ZHANG Hong ZHENG Rong
（College of Life Sciences and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot 010022）

Designing the primers based on the conserved sequences of several fungal actin genes，the full-length cDNA sequence of γ-actin gene from Leucocortinarius bulbiger（Lb-act）was cloned using RT-PCR and RACE. The full-length of Lb-act cDNA sequence was 1 357 bp，consisting of a 1 137 bp open reading frame（ORF），encoding a protein of 378 amino acids，a 5'-UTR with 92 bp and a 3'-UTR with 128 bp. The online analysis by Port Param software revealed that the putative amino acids had an isoelectric point of 5.12，a molecular weight of 95.022 kD，and 3 highly conserved regions of fungal γ-actin gene. Blast homology search indicated that the sequences of Lb-act amino acid had a high similarity with the sequences of Basidiomycetes actin，and it had the closest relationship with the amino acid sequence of Laccaria bicolor actin. In culture conditions of different carbon and phosphorus levels，the expression levels of Lb-act were almost the same，thus this research confirmed the reliability that actin gene could be used as intermolecular standard.

Leucocortinarius bulbiger；actin gene；cDNA；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.020

2015-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060110，31360125），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012MS0526）

張虹，女，碩士研究生，研究方向：菌根生物技術(shù)；E-mail：944434952@qq.com

崢嶸，女，博士，研究方向：菌根生物技術(shù)；E-mail：zhengrong09@163.com