山藥Actin基因片段的克隆及表達分析

龔明霞周蕓伊王愛勤羅海玲，2何龍飛

（1. 廣西大學農(nóng)學院，南寧 530004；2. 廣西農(nóng)科院作物遺傳改良生物技術重點實驗室，南寧 530007；3. 廣西農(nóng)科院蔬菜研究所，南寧 530007 ）

山藥Actin基因片段的克隆及表達分析

龔明霞1，2，3周蕓伊1王愛勤1羅海玲1，2何龍飛1

（1. 廣西大學農(nóng)學院，南寧 530004；2. 廣西農(nóng)科院作物遺傳改良生物技術重點實驗室，南寧 530007；3. 廣西農(nóng)科院蔬菜研究所，南寧 530007 ）

通過山藥Actin基因的克隆和表達分析，為研究山藥生長發(fā)育中肌動蛋白的作用及其他基因的表達和調(diào)控奠定基礎。根據(jù)GenBank中已經(jīng)公布的其他植物肌動蛋白基因（Actin）的保守序列設計一對簡并引物，采用RT-PCR技術從山藥塊莖中分離出1個Actin基因cDNA片段，命名為DoActin。片段長度為1 091 bp，編碼357個氨基酸，并提交GenBank（登錄號：KU669295）。與NCBI核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列比對，該序列與其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上，氨基酸序列的同源性均在97%以上。進化分析結果顯示，DoActin與海棗Actin-2、木本棉Actin-7的親緣關系最近。實時定量PCR結果顯示，DoActin在山藥葉片、地上莖和地下塊莖以及不同發(fā)育期的塊莖和葉片中表達量相對穩(wěn)定，表明其適宜作為山藥的內(nèi)參基因。

山藥；Actin基因；克?。槐磉_分析；序列分析

肌動蛋白（Actin）是一種普遍存在于真核生物細胞中的結構蛋白質(zhì)，是構成細胞骨架中微絲的主要組分。它是單一多肽鏈的球狀蛋白，由375-377個氨基酸組成［1］。由于actin蛋白是組成型表達，在細胞中能穩(wěn)定表達，常作為半定量RT-PCR以及實時熒光定量PCR分析基因表達水平的經(jīng)典內(nèi)參基因［2-4］。至今，已相繼從擬南芥［5］、水稻［6］、玉米［7］、長穗偃麥草［8］、木薯［9］、百合［10］、陸地棉［11］、海州香薷［12］及香樟［13］等高等植物中克隆出Actin基因。這些基因在真核細胞進化過程中高度保守，氨基酸序列同源性高達70%-100%。

山藥為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）草本植物，是一種藥食兼用的重要塊莖類經(jīng)濟作物［14］。薯蕷全球共有600多個種，其中山藥品種（D. opposita）為全球最重要的6大可食用的薯蕷品種之一［15］，在亞洲國家被廣泛種植［16］，也已成為我國山藥的主栽品種之一。我國山藥種植面積已由2008年的20萬hm2左右發(fā)展到2013年的近47萬hm2［17］。因此，山藥的產(chǎn)量和品質(zhì)不僅關系到山藥產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效益問題，而且關系到國家的糧食安全問題。為促進山藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，近10年來，科技工作者加強了山藥栽培技術［18-20］、新品種選育［21-23］、深加工［24］等方面的研究，而在山藥塊莖生長發(fā)育、產(chǎn)量形成調(diào)控機理等方面的基礎研究很薄弱?；虮磉_量差異的研究，需要一個恒定表達的內(nèi)參基因作為標準來衡量。目前，已有報道借用其他物種的Actin作為內(nèi)參基因［25-27］，在GenBank中僅有盾葉薯蕷（俗稱黃姜，D. zingiberensis）的1個Actin蛋白質(zhì)和mRNA片段的記錄，并被作為內(nèi)參基因在紫山藥上進行應用［28］，而尚未見有關山藥（D. opposita）的Actin基因克隆和應用研究的報道。因此，獲取山藥中Actin基因，分析測定其表達穩(wěn)定性，以確定其是否能夠作為山藥植物內(nèi)參基因使用，對今后山藥重要調(diào)控和功能基因表達的研究具有重要意義。本研究采用RT-PCR法進行山藥actin基因克隆，并進行序列比對分析，同時結合實時熒光定 量PCR（RT-qPCR）技術研究其在山藥葉片、地上莖、地下塊莖以及不同發(fā)育時期的塊莖和葉片中的穩(wěn)定性，旨在為山藥優(yōu)良內(nèi)參基因的確定、山藥生長發(fā)育中肌動蛋白的作用等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 以廣西農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所選育的山藥品種“桂淮5號”為供試材料，分別取塊莖膨大期的葉片、地上莖、地下塊莖以及不同發(fā)育時期的塊莖，經(jīng)液N2速凍后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 DL2000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、大腸桿菌JM109菌株、克隆載體pMDTM19-T、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司，氨芐青霉素（Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-Gal）購自上海生工。RT-qPCR反應試劑為iTaq Universal SYBR Green Supermix、0.2 mL低位白色8聯(lián)管以及光學級8聯(lián)管平頂蓋等購自美國伯樂（Bio-Rad）公司。熒光定量PCR儀為美國伯樂公司生產(chǎn)的CFX-96實時熒光定量系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計及合成 通過比對GenBank中已公布的其他植物Actin基因cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)域利用Primer5.0軟件設計一對簡并引物，上游引物DoAct-R：5'-TGAYAATGGDACWGGNATGG-3'，下游引物DoAct-F：5'-CACTTCCKGTGVACAATGG-3'（其中：Y=C/T，D=A/T/G，W=A/T，N=A/C/G/T，K=G/ T，V=G/C/A），預測所得片段長度約為1 100 bp；根據(jù)DoActin基因核苷酸序列的特異區(qū)域設計一對實時熒光定量PCR引物DoAct-RTR：5'-GAGCAAGGAAATCACAGCAC-3'和 DoAct-RTF：5'-TCAGGGAAGCCAAGATAGAG-3'，擴增片段138 bp。引物合成和基因測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2.2 山藥總RNA的提取 根據(jù)TaKaRa的MiniBEST多糖多酚植物組織總RNA抽提試劑盒說明書，分別提取山藥葉片、地上莖、地下塊莖中的總RNA。用IMPLEN超微量紫外分光光度計測定OD260和OD280值及RNA濃度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.3 RT-PCR擴增 根據(jù)PrimeScriptTMⅡ第一鏈cDNA合成試劑盒操作說明書，取1 μg RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增山藥Actin基因片段的模板。PCR擴增反應體系為25 μL，具體如下：cDNA 2.0 μL，10× PCR Buffer（含20 mmol/L Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L Primer-R 1 μL，10 μmol/L Primer-F 1 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。反應條件為：94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，45-48℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃下低溫放置。2%瓊脂糖凝膠檢測 PCR 擴增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物回收檢測 擴增產(chǎn)物與預期大小相符后，另做8管20 μL體系，合并，在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用TaKaRa的MiniBESTVer.4.0瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，回收目的條帶。用IMPLEN超微量紫外分光光度計測定OD260和OD280值及回收產(chǎn)物的濃度。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的連接及轉化 參照克隆載體pMDTM19-T克隆試劑盒說明書，根據(jù)測得的回收產(chǎn)物的濃度確定產(chǎn)物DNA加入的量，將回收目的條帶連接于克隆載體pMDTM19-T上，并轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，在含Amp、X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，挑選白色菌落擴大培養(yǎng)，采用目的條帶引物檢測菌液PCR，送陽性克隆測序。

1.2.6 Actin基因的序列分析 應用NCBI的ORF程序對所得的序列查找開放閱讀框，并推導出其氨基酸序列。使用NCBI中的Blast對所得基因的核苷酸序列與氨基酸序列進行比對，根據(jù)結果選取各種植物的Actin氨基酸序列，采用DNAMAN軟件比對多序列，采用MEGA5.1軟件構建多序列進化樹。

1.2.7 DoActin基因的定量表達分析 （1）反應體系的優(yōu)化：采用SYBR Green染料法，在Bio-Rad CFX-96熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析。分別對熒光定量引物的退火溫度、引物濃度、循環(huán)條件（2步法和3步法）進行優(yōu)化，確定最佳擴增體系和條件。優(yōu)化后的RT-qPCR反應體系為：Mix 10 μL，DoAct-RTR 1 μL，DoAct-RTF 1 μL，cDNA（稀釋 3倍）2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件為：95℃ 3 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)數(shù)39個。（2）熔解曲線分析和標準曲線的建立：首先采用普通PCR，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再對RT-qPCR產(chǎn)物熔解峰進行分析，以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。以其中一份陽性樣品cDNA進行5倍梯度稀釋作為模板，采用優(yōu)化好的條件進行RT-qPCR，建立標準曲線。（3）提取山藥膨大期的葉片、地上莖、地下塊莖以及不同發(fā)育時期塊莖和葉片中的總RNA，用吸光值法測定不同組織的RNA量。不同組織取1 μg RNA進行逆轉錄，然后進行RT-qPCR分析。根據(jù)各個樣品的平均CT值，利用Excel 2010作圖。

2 結果

2.1 總RNA的提取及檢測

以山藥塊莖為材料提取總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S rRNA、18S rRNA條帶整齊清晰，且28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍（圖1），表明獲得的總RNA較完整。

圖1 山藥塊莖總RNA電泳圖

經(jīng)紫外分光光度計測定和分析，RNA樣品OD260/OD280的平均值為1.95，OD260/OD230的平均值為2.06，濃度為580-810 ng/μL，表明所提取的總RNA樣品基本沒有酚類、蛋白質(zhì)及其他小分子物質(zhì)的污染，純度較高，可用于反轉錄反應。

2.2 RT-PCR擴增

以第一鏈cDNA為模板，用引物Primer-F和Primer-R在不同退火溫度下進行PCR擴增，獲得一條約為1 100 bp的條帶，與預期的目的片段大小相似（圖2）。根據(jù)相同量的PCR產(chǎn)物的亮度可知，在47℃下產(chǎn)物條帶最亮，說明引物對Primer-F和Primer-R適宜的退火溫度為47℃。

2.3 PCR產(chǎn)物回收

將目的條帶進行凝膠回收，紫外分光光度計測得的回收產(chǎn)物OD260/OD280為1.8，OD260/OD230為2.0，濃度為177 ng/μL，說明回收的DNA產(chǎn)物純度高，無蛋白質(zhì)和鹽分的污 染。

2.4 回收產(chǎn)物的克隆

以pMDTM19-T Vector為載體，吸取適量的回收產(chǎn)物DNA進行TA連接，轉化大腸桿菌JM109。在選擇培養(yǎng)基（含Amp、X-Gal、IPTG）上挑取10個白色菌落，菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒，結果（圖3）表明，10個克隆中有7個為陽性克隆。

圖2 不同退火溫度下的PCR產(chǎn)物

圖3 菌落PCR陽性克隆檢測

2.5 測序結果與序列分析

送其中5個陽性克隆進行測序，其測序結果完全一致，得到1 091 bp片段，編碼358個氨基酸。將核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blastn比對分析。結果表明，山藥和油棕等其他100多種植物Actin核苷酸序列的相似性均在83%以上，其中與海棗（Phoenix dactylifera，LOC103720863）Actin-2的同源性達86%。由此推斷，本研究所獲得的基因片段應該為山藥肌動蛋白Actin基因片段，將其命名為DoActin，提交GenBank，登錄號為KU669295。

將山藥DoActin推導的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blastp比對分析，結果表明，山藥與其他植物的Actin蛋白相似性都較高，為97%-99%，其中與番荔枝（Annonacherimola，AFD62269.1）及木本棉（Gossypiumarboreum，KHG20985.1）的相似性達99%。將山藥Actin蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選出的22種植物的Actin蛋白，采用DNAMAN進行了多序列比較分析，結果發(fā)現(xiàn)有339個氨基酸處于保守區(qū)域，而僅有38個氨基酸不保守（圖4），即不同植物的Actin蛋白氨基酸序列只有在少數(shù)位置有突變發(fā)生，說明了植物肌動蛋白基因高度保守。

2.6 山藥Actin蛋白系統(tǒng)進化樹的構建

從NCBI下載與山藥肌動蛋白同源性較高的不同類型的22個Actin蛋白氨基酸序列，采用MEGA5.1軟件，以鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構建進化樹，各參數(shù)的設置采用默認值。結果（圖5）顯示，22個植物Actin蛋白被分進了兩個亞群即ClassⅠ、Class Ⅱ中。山藥肌動蛋白分布在ClassⅠ中，與海棗（Phoenix dactylifera，XP_008809027.1）Actin-2、木本棉（Gossypiumarboreum，KHG20985.1）Actin-7的親緣關系最近，說明這3種植物Actin基因之間的進化可能只是在少數(shù)核苷酸位點上產(chǎn)生突變。

2.7 DoActin基因定量分析

2.7.1 定量引物的分析 利用DoAct-RTR和DoAct-RTF引物進行普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增產(chǎn)物長度與預期長度一致，無引物二聚體和非特異條帶。對熒光定量RT-PCR產(chǎn)物進行熔解峰分析（圖6），DoActin片段在Tm=80-80.5℃處顯示特異性單峰，進一步說明擴增產(chǎn)物無引物二聚體及非特異性擴增，證實引物設計的合理性和特異性。

2.7.2 標準曲線的建立 以其中一份陽性cDNA樣品進行5倍梯度稀釋，以優(yōu)化好的條件進行熒光定量RT-PCR擴增。得到的擴增曲線（圖7）和標準曲線（圖8），結果顯示，以Cq值為縱坐標（Y），以稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標（X）建立的相對定量標準曲線，在所使用的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系（R2=0.996），擴增效率為99.3%。

2.7.3 DoActin基因在山藥不同器官及不同發(fā)育時期塊莖和葉片中的表達分析 RT-qPCR分析結果顯示，DoActin基因在山藥塊莖膨大中期的地下塊莖、地上嫩莖、葉片中的平均CT值無顯著差異（圖9-A），不具有組織表達特異性；DoActin基因在山藥地下塊莖形成期、膨大前期、膨大中期、膨大后期，以及成熟期的各個塊莖樣品中的平均CT值間也無顯著差異，且在這些時期的各個葉片樣品中的平均CT值之間也無顯著差異（圖9-B），說明DoActin基因在不同的發(fā)育時期的塊莖和葉片中表達量基本一致。因此，DoActin應該為組成型表達的肌動蛋白基因。

圖5 山藥Actin與其他植物Actin的系統(tǒng)進化樹

圖6 Doactin基因的溶解峰

圖7 DoActin基因的擴增曲線

圖8 DoActin基因的標準曲線

圖9 山藥DoActin基因在植物不同器官（A）及不同發(fā)育時期的塊莖和葉片（B）中的平均CT值

3 討論

目前，在半定量PCR或實時熒光定量PCR分析中，有多種類似的看家基因被選作內(nèi)參基因，如肌動蛋白基因（ACT）、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、18S和 28S核糖體RNA基因（18S rRNA、28S rRNA）及肽鏈延伸因子（ef1-α）基因等［29-31］。但在大多植物的表達研究中，Actin基因家族是使用最頻繁的管家基因。肌動蛋白參與真核生物細胞的許多重要的生命活動，如：細胞分裂、細胞伸長、胞吞、細胞信號轉導、重力傳感、頂端生長、細胞器運動及細胞程序性死亡等［32-34］。Actin基因不論在核苷酸還是氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性，在各種組織中恒定表達，因而常被作為研究其他基因的表達模式及調(diào)控機制的分子內(nèi)標，以比較不同來源的基因表達量的差異［35］，主要包括ACT2/7、ACT8和ACT11等［4］。因此，本研究也是最先考慮Actin作為研究山藥生長發(fā)育調(diào)控基因表達的內(nèi)參基因。對克隆到的1個山藥肌動蛋白基因（DoActin）比對分析發(fā)現(xiàn)，cDNA的同源性小于氨基酸，表明在不同植物中，Actin基因的核苷酸序列雖然有一定的變異，但氨基酸序列卻具有較高的穩(wěn)定性和一致性，這保證了Actin基因功能的穩(wěn)定性，這與前人［9，10］的研究結果一致。

本研究中Actin進化樹表明，山藥Actin與海棗Actin-2、木本棉Actin-7的親緣關系最近，推測它們之間的功能最相似，即推測所克隆到的DoActin能在山藥細胞中穩(wěn)定表達。本實驗中RT-qPCR結果顯示，DoActin在山藥的各個組織、塊莖發(fā)育的各個時期都有穩(wěn)定的表達，且表達水平基本一致，因此推斷DoActin為組成型表達的肌動蛋白基因，適宜將其作為研究山藥其他調(diào)控基因表達的內(nèi)參基因。至于山藥中是否存在Actin基因家族，要在后續(xù)研究中加以證實。另外，同一物種如海棗、山蒼子中不同類型的Actin蛋白卻分布在不同的亞群中，說明肌動蛋白基因的分化可能發(fā)生在物種分化之前，這與Zhang等［36］、孔衛(wèi)青和楊金宏［37］的研究結果相似。

本研究對DoActin的克隆填補了山藥Actin研究領域的空白，豐富了高等植物Actin的核酸數(shù)據(jù)庫，為進一步深入研究Actin的功能、保守性、變異性及其與生命起源與進化的關系提供了新的數(shù)據(jù)，同時也為下一步研究山藥中重要調(diào)控基因的表達模式奠定了前期工作基礎。

4 結論

本研究所獲得的1個山藥DoActin，其與GenBank收錄的前100種其他植物肌動蛋白基因在核苷酸、氨基酸水平的同源性分別在83%和97%以上，說明高等植物的Actin基因是一種高度保守的看家基因。DoActin基因在山藥的各個器官以及不同發(fā)育期的塊莖和葉片中表達量穩(wěn)定，適宜將其作為研究山藥其他調(diào)控基因表達的內(nèi)參基因。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of Actin Gene Fragment from Dioscorea opposite

GONG Ming-xia1，2，3ZHOU Yun-yi1WANG Ai-qin1LUO Hai-ling1，2，3HE Long-fei1
（1. College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530004；2. Guangxi Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and biotechnology，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007；3. Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007）

The cloning and expression analysis of Actin gene fragment from Dioscorea opposite was studied in order to provide the foundation for studying its function and other genes expression and regulation in yam growth and development. A pair of degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the published Actin genes of other plants in GenBank. The cDNA fragment of 1 Actin gene was isolated from yam tuber by RT-PCR and designated as DoActin. It’s length was 1 091 bp encoding a protein with 357 amino acids residues，and was deposited in GenBank（Accession number：KU669295）. Homologous alignment according to the nucleotide and protein databases showed that it shared over 83% nucleotide sequence similarity and over 97% amino acid sequence similarity with Actins in other plants. The phylogenetic tree reconstructed on the base of amino acid sequences suggested that the DoActin had the nearest relationship with Phoenix dactylifera Actin-2 and Gossypium arboreum Actin-7. RT-PCR results revealed that the expression levels of DoActin in different organs such as leaf，aboveground stem and underground tuber，as well as tubers and leaves in different developmental periods were relatively stable，indicating that DoActin can be used as an appropriate reference gene for D. opposite.

Dioscorea opposite；Actin gene；cloning；expression analysis；sequence analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.011

2016-02-19

國家自然科學基金項目（30760126），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903022）

龔明霞，女，博士研究生，研究方向：植物生理與分子生物學；E-mail：ff9903@126.com

何龍飛，男，博士，研究方向：植物生長發(fā)育與逆境；E-mail：lfhe@gxu.edu.cn