修飾性肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

劉春冬，王建華，曾芳重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400044

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修飾性肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

劉春冬，王建華，曾芳
重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400044

劉春冬, 王建華, 曾芳. 修飾性肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn). 生物工程學(xué)報, 2016, 32(3): 292–305.

Liu CD, Wang JH, Zeng F. Cellular delivery of modified peptide nucleic acids: a review. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 292–305.

摘 要:肽核酸是人工合成的寡核苷酸類似物，以N-(2-氨乙基) 甘氨酸結(jié)構(gòu)單元替代DNA分子中的戊糖-磷酸結(jié)構(gòu)。與天然核酸相比，肽核酸可以更高效地與DNA或RNA特異性雜交，在分子生物學(xué)和基因藥物領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是，肽核酸骨架呈電中性，難以高效穿過細(xì)胞膜，這成為工程應(yīng)用的最大障礙。為了改善肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能，對肽核酸進(jìn)行化學(xué)修飾是近年來的研究熱點(diǎn)。結(jié)合近十年來文獻(xiàn)報道和本實(shí)驗(yàn)室的工作，對肽核酸的骨架修飾和配合物結(jié)合修飾兩類增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的修飾方法進(jìn)行綜述，并對修飾性肽核酸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究中存在的問題以及未來的研究趨勢及其應(yīng)用提出了見解。

關(guān)鍵詞:肽核酸，修飾，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

Received: June 15, 2015; Accepted: August 31, 2015

Supported by: The Natural Science Major Project of Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2013jjB0011), Chongqing Application Development Project (No. cstc2013yykfB10013), Agricultural Science and Technology Achievements Funds of Sichuan Province (No. 14NZ0027-1).

重慶市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. cstc2013jjB0011)，重慶市應(yīng)用開發(fā)計劃項(xiàng)目 (No. cstc2013yykfB10013)，四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目 (No. 14NZ0027-1) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-09-17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150917.1533.001.html

1991年，丹麥哥本哈根大學(xué)生物化學(xué)家Nielsen等[1]通過計算機(jī)設(shè)計，首次提出了肽核酸 (Peptide nucleic acid，PNA)，它是一種人工合成的DNA和RNA類似物。在肽核酸分子中，N-(2-氨乙基) 甘氨酸結(jié)構(gòu)單元通過酰胺鍵連接構(gòu)成骨架以替代核酸分子中戊糖-磷酸結(jié)構(gòu)，堿基則通過亞甲羰鍵與骨架仲氨基上的N相連(圖1)。這種與天然核酸相似的空間結(jié)構(gòu)使得PNA能以堿基互補(bǔ)配對原則與DNA或RNA雜交[2]。與天然核酸相比，PNA具有以下優(yōu)點(diǎn)：骨架的柔韌性和電中性使其與DNA或RNA雜交的親和力更高[3]；結(jié)構(gòu)中不含氨基酸殘基或磷酸戊糖單元，因此不受核酸酶或蛋白酶降解，生物穩(wěn)定性高[4]；非手性構(gòu)象便于單體合成和純化[5]；骨架含重復(fù)的酰胺鍵結(jié)構(gòu)，因此可以使用固相合成方法合成寡聚物[6]。

圖1　PNA (a) 和DNA (b) 的骨架結(jié)構(gòu)Fig. 1 Backbones of PNA (a) and DNA (b).

然而，未修飾PNA在應(yīng)用時仍存在以下缺點(diǎn)：親水性的結(jié)構(gòu)很難透過細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞攝入差；與靶序列結(jié)合不具備方向性；電中性引起PNA分子自聚集導(dǎo)致水溶性差[7]。其中，PNA的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)難題成為應(yīng)用的最大障礙，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)困難使PNA難以到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，影響了與胞內(nèi)靶點(diǎn)的結(jié)合，降低了生物利用度[8]。因此，增強(qiáng)PNA的細(xì)胞攝入水平是工程應(yīng)用的關(guān)鍵之一。迄今，在這方面取得一定成效的方法可分為以下3類。第一，早期研究主要集中在對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改造，如電致孔法[9]、滲透化細(xì)胞法[10]，該方法基于對靶細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的修飾，難以適用于PNA工程化應(yīng)用。第二，對PNA轉(zhuǎn)運(yùn)形式進(jìn)行改造，如與DNA協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)[11]、脂質(zhì)體包埋[12]、納米粒協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，其中，采用與納米粒共價連接取得了較好的成效。Bertucci 等[14]將PNA共價連接到L型沸石納米晶體表面，并用生物可降解的聚-L-賴氨酸進(jìn)行包衣，選用Helen Lane細(xì)胞 (HeLa) 考察轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果表明，該連接復(fù)合物的細(xì)胞攝取率明顯增加。Ma等[15]將PNA與多孔二氧化硅納米顆粒(Mesoporous silica nanoparticles，MSNP) 通過二硫鍵共價連接得到PNA-SS-MSNP連接復(fù)合物，在MSNP協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)下，復(fù)合物以內(nèi)吞方式進(jìn)入HeLa細(xì)胞，隨后胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽斷裂二硫鍵，釋放出反義PNA，并有效沉默B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma 2，Bcl-2) 蛋白表達(dá)。McNeer等[16]將聚合物納米粒作為載體加載三聚體PNA，該納米粒能順利轉(zhuǎn)運(yùn)至囊性纖維化支氣管上皮細(xì)胞 (Cystic fibrosis bronchial epithelial cells，CFBE) 內(nèi)，并校正F508del基因突變。第三，對PNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾法具有操作方便、形式多樣、適合體內(nèi)研究等優(yōu)點(diǎn)，因此備受關(guān)注。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研究成果，對近十年來合成的各種增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的化學(xué)修飾PNA進(jìn)行綜述，總結(jié)了修飾性肽核酸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究中存在的問題，并對未來的研究趨勢及其應(yīng)用提出了見解。

1　骨架修飾型PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

自PNA提出以后，對其結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行化學(xué)修飾成為研究重點(diǎn)之一。PNA結(jié)構(gòu)單元的修飾可分為堿基的替換和骨架結(jié)構(gòu)的改造。多數(shù)情況下，堿基替換會影響PNA的雜交性能，從而降低PNA的生物活性。目前堿基替換研究主要是為了在PNA中引入熒光基團(tuán)，Matarazzo等[17]用吖啶基氨基尿嘧啶替換普通堿基，該基團(tuán)既保留了一定的雜交能力，同時又具有熒光特性。迄今，有關(guān)堿基替換型PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究不多，Bischof等[18]用含釕一氧化碳釋放分子(CO-releasing molecules，CORMs) 替換普通堿基，在該基團(tuán)的協(xié)助下，PNA轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高，而且自身的CORM特性不會改變。在PNA結(jié)構(gòu)單元修飾中，骨架修飾是改善PNA細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的主要措施。骨架修飾指對PNA的N-(2-氨乙基) 甘氨酸單元結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，骨架修飾PNA在增加水溶性和增強(qiáng)雜交性能方面取得了一定的成功，而且，部分骨架修飾PNA還具備諸如光學(xué)性能、自組裝等特殊優(yōu)點(diǎn)，拓展了PNA的應(yīng)用范圍[19-20]。在骨架修飾法中，關(guān)鍵是不能影響雜交性能，PNA與DNA或RNA的特異性結(jié)合是PNA大多數(shù)應(yīng)用的前提條件。Hyrup 等[21]指出無論是改變兩個酰胺鍵之間的骨架長度，還是改變堿基與氨基之間的骨架長度都會降低PNA與DNA或RNA的特異性結(jié)合能力。因此，我們認(rèn)為PNA的骨架修飾應(yīng)遵循不改變基本空間構(gòu)型的原則，可以采取骨架取代修飾或者替換骨架原子構(gòu)成等修飾方法。

1.1取代骨架上H原子

PNA骨架上有3種類型亞甲基，通過改變亞甲基上取代基團(tuán)的種類，可以得到不同類型的PNA。早期研究以不同α氨基酸為起始原料，合成了多種骨架修飾型PNA，Nielsen等[22]研究了以賴氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸殘基為骨架的修飾型PNA的雜交特性，發(fā)現(xiàn)只有D-賴氨酸的Tm值升高，其他PNA的Tm值均下降。目前，對亞甲基上H原子的取代是PNA骨架修飾的重要方法。Maison等[23]采用烏吉反應(yīng) (Ugi reaction)，以胺、羧酸、異腈、醛 (或酮) 4種組分為原料發(fā)生縮合反應(yīng)，通過變換各組分結(jié)構(gòu)可以一步合成各種類型的骨架取代PNA (圖2)。這種取代修飾使得PNA單體成為手性分子，而且各光學(xué)異構(gòu)體的水溶性、雜交性能等往往有差異，通過適當(dāng)篩選，能找到性能更加優(yōu)異的PNA。Mitra等[24]用氨甲基(Aminomethylene，am) 取代PNA骨架中α位和γ位的H原子，得到了α-S-amPNA、α-R-amPNA 和γ-S-amPNA 3種骨架修飾型PNA（圖3A–C）。通過與特異性結(jié)合的cDNA雜交，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)修飾的PNA相比，α-S-amPNA、α-R-amPNA和γ-S-amPNA的Tm值都相應(yīng)增大，最高增加10 ℃，這表明該結(jié)構(gòu)與DNA特異性結(jié)合能力增強(qiáng)。隨后，選用HeLa細(xì)胞研究了am-PNA進(jìn)入細(xì)胞的能力。結(jié)果表明，3種修飾型am-PNA的細(xì)胞攝入水平都比未經(jīng)修飾的PNA高，而且，其細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力具體表現(xiàn)為：γ位修飾大于α位修飾，R構(gòu)型大于S構(gòu)型。Kumar等[25]用氨丙基取代PNA骨架中γ位的H原子，得到了Cγ-氨基丙烯 PNA (amp-PNA) (圖3D)。和特異性DNA的雜交實(shí)驗(yàn)表明，與未經(jīng)修飾的PNA相比，其Tm值增大，而且其雜交性能優(yōu)于碳鏈長度為4的氨丁基PNA。在人乳腺癌細(xì)胞(Michigan cancer foundation-7，MCF-7) 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)amp-PNA能高效進(jìn)入該細(xì)胞，并聚集在細(xì)胞核附近。

圖2　Ugi 4CC法合成PNA單體Fig. 2 Synthesis of PNA monomer via Ugi 4CC reaction. i: MeOH, 20 ℃, 48 h, 90%.

圖3　am-PNA和amp-PNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Chemical structures of am-PNAs and amp-PNA.

1.2骨架上引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)

將環(huán)狀結(jié)構(gòu)引入PNA是得到骨架修飾型PNA的重要方法之一，主要選擇較穩(wěn)定的五元環(huán)和六元環(huán)。其中，帶五元環(huán)的PNA因其結(jié)構(gòu)較好地模擬了DNA中戊糖環(huán)，受到人們的重視。合成時可以選擇自身含有五元環(huán)結(jié)構(gòu)的脯氨酸作為起始原料。Suparpprom等[26]合成了骨架結(jié)構(gòu)為脯氨?；?2-氨基環(huán)戊羧酸 (Prolyl-2-aminocyclopentanecarboxylic acid，ACPC) 的ACPC-PNA (圖4A)，這種帶有吡咯烷基的PNA具有很強(qiáng)的剛性結(jié)構(gòu)特性。其中構(gòu)型為 (1S，2S)-ACPC-PNA具有良好的雜交性能，Tm值大于85 ℃，高于相應(yīng)DNA-DNA的Tm值。Merino 等[27]合成了含有異惡唑烷結(jié)構(gòu)的Isoxazolidinyl PNA (Isox-PNA) (圖4B)，該骨架結(jié)構(gòu)可以質(zhì)子化，有利于PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，同時還具有良好的水溶性。目前，對環(huán)狀結(jié)構(gòu)PNA的研究主要涉及提高水溶性和雜交性能，在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面還缺乏研究數(shù)據(jù)。

1.3替換骨架上C原子

對骨架C原子替換具有不改變PNA構(gòu)型的優(yōu)點(diǎn)，通常不會降低PNA的雜交性能。Kitamatsu 等[28]合成了帶有吡咯環(huán)的含氧吡咯烷PNA(POPNA) 和含氨基吡咯烷PNA (PAPNA) (圖5)。在POPNA中，O原子替換C原子，即醚鍵代替亞甲基，醚鍵骨架柔韌性更好，與DNA或RNA結(jié)合牢固，其水溶性也相應(yīng)提高。在中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO) 中的吸收實(shí)驗(yàn)表明，與甘氨酸骨架PNA相比，其水溶性、雜交特性以及細(xì)胞攝取都得到了改善。在PAPNA中，N原子替換C原子，即叔氨基代替亞甲基，叔氨基可質(zhì)子化，其所帶的陽離子電荷有利于跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究表明，由PAPNA組成的寡聚PNA細(xì)胞攝入效率高，但與DNA和RNA的雜交特異性差，而由POPNA組成的寡聚PNA細(xì)胞攝入效率低。將2個單元PAPNA和7個單元POPNA聚合形成混合寡聚PNA，發(fā)現(xiàn)雜交特異性和細(xì)胞攝入效率均較好。

圖4　骨架中含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的PNAFig. 4 PNA with cyclic structure in backbone.

圖5　POPNA (a) 和PAPNA (b) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 5 Chemical structures of POPNA (a) and PAPNA (b).

2　PNA連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

PNA連接物 (PNA conjugates) 是指將PNA和配體直接共價結(jié)合，或者通過中介基團(tuán)將兩者共價連接，得到PNA-配體復(fù)合物。Koppelhus 等[29]認(rèn)為，PNA實(shí)現(xiàn)工程應(yīng)用的前提之一是其自身分子能高效通過細(xì)胞膜。我們認(rèn)為諸如細(xì)胞微注射法、電穿孔法和電滲透法雖然轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高，但在體內(nèi)使用受限，不適合臨床應(yīng)用。對PNA分子結(jié)構(gòu)的整體修飾，尤其是尋找合適的配體，制備跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能優(yōu)越的PNA連接物是一種有效的手段。以配體共價修飾制備連接物的方法不僅具備高效的細(xì)胞傳遞性能，而且在雜交性能、細(xì)胞毒性等方面具有一定優(yōu)勢，具有工程應(yīng)用的潛力。近年來，對PNA分子進(jìn)行整體修飾，尋找合適的配體，取得了一些成功的研究成果，這也可能是今后將PNA工程化開發(fā)研究的一個趨勢。

2.1PNA-CPP連接物

目前，在種類眾多的PNA連接物中，使用最廣泛的是PNA-CPP。細(xì)胞穿透肽 (Cell penetrating peptide，CPP) 是一類能攜帶各種類型大分子物質(zhì)穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的多肽。一般為帶正電荷的長短不一的短肽，富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，正電荷特性有助于與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)結(jié)合[30]。CPP作為引導(dǎo)物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于DNA、RNA以及藥物分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，借鑒這些經(jīng)驗(yàn)，將CPP引入PNA傳遞體系，取得了較好的成效。細(xì)胞對PNA-CPP共價連接物主要通過類似胞吞的內(nèi)化作用，使PNA成功進(jìn)入胞漿的泡囊中。表1和表2總結(jié)了近十年來在PNA轉(zhuǎn)運(yùn)體系普遍采用且有效的CPP，主要有以下6種：1) 單聚精氨酸和賴氨酸類 (Simple oligoarginines and oligolysines)；2) HIV反式激活蛋白 (HIV transactivator protein，Tat)；3) 核定位序列(Nuclear localization signal，NLS)；4) (KFF)3K；5) M918；6) 信號肽 (Signal peptide)。

表1　用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-CPP連接物Table 1 Examples for delivery of PNA-CPP conjugates

表2　CPP的氨基酸序列Table 2 Sequences of selected CPPs

研究表明，各種富含精氨酸和賴氨酸的多肽具有細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性，雖然它們的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)各異，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理既不同于細(xì)胞膜內(nèi)吞作用，也不同于細(xì)胞表面受體結(jié)合作用[40]。一般認(rèn)為，氨基酸殘基數(shù)目對PNA轉(zhuǎn)運(yùn)活性有顯著影響，具有較好轉(zhuǎn)運(yùn)效率的殘基數(shù)為5到12個。Bendifallah等[33]考察了精氨酸殘基數(shù)的影響情況，發(fā)現(xiàn)PNA-Arg9連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率大于 Arg7和 Arg8，他們認(rèn)為適當(dāng)增加氨基酸殘基數(shù)可以提高PNA-Arg的細(xì)胞攝入。另一種常用的單聚多肽是聚賴氨酸，Albertshofer等[32]發(fā)現(xiàn)連接八聚L-賴氨酸的PNA能高效通過鼠BCL1細(xì)胞膜。1988年，人們首次發(fā)現(xiàn)了Tat反式激活蛋白穿透細(xì)胞膜的功能，之后被應(yīng)用于諸如β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶等各種大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[41]。Folini等[34]將PNA與Tat共價連接，發(fā)現(xiàn)連接物能順利進(jìn)入DU145癌細(xì)胞，并與胞內(nèi)特定mRNA特異性結(jié)合，該連接物與其他傳遞方法相比有效地提高了PNA的生物利用度。Su等[35]采用固相合成法合成了PNA-AEEA-Tat連接物，并以濃度依賴方式高效地進(jìn)入了3T3細(xì)胞。NLS能與核載體相互作用，主要應(yīng)用于將大分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。有研究發(fā)現(xiàn)NLS也能促進(jìn)PNA的細(xì)胞攝入水平，Joshi 等[36]將NLS共價連接到PNA上，并研究了它們進(jìn)入細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞的情況，發(fā)現(xiàn)連接物轉(zhuǎn)運(yùn)效率是未經(jīng)修飾PNA的2倍。但是，Bendifallah等[33]將NLS與其他引導(dǎo)化合物進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)PNA-NLS的轉(zhuǎn)運(yùn)效率不是很好。(KFF)3K也是一種常用的引導(dǎo)化合物。Ghosal 等[37]分別研究了D型和L型的(KFF)3K協(xié)助PNA進(jìn)入細(xì)胞情況，發(fā)現(xiàn)只有L型的L((KFF)3K)具有很好的效果，而同樣序列的D型多肽沒有促進(jìn)PNA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。M918是一種含有22個氨基酸殘基的多肽，富含精氨酸。Lee等[38]在HT-29-luc細(xì)胞中研究了PNA-M918連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況，發(fā)現(xiàn)該連接物能有效地進(jìn)入細(xì)胞，并特異性沉默相應(yīng)基因。而且在高達(dá)25 μmol/L濃度下，M918既不會損傷細(xì)胞膜，也不會對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，非常適合體內(nèi)應(yīng)用。信號肽可以直接引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和原核細(xì)胞的內(nèi)膜，其序列往往包含由疏水氨基酸殘基構(gòu)成的疏水核。研究表明信號肽的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)作用主要是由于其疏水區(qū)域和細(xì)胞膜上雙分子層脂質(zhì)的相互作用，Li等[39]認(rèn)為這種相互作用要求信號肽的氨基酸殘基數(shù)為5到15個。他們將一種15個氨基酸殘基的信號肽及兩種類似多肽分別連接到含10個胸腺嘧啶堿基的PNA的N末端，并研究了3種連接物進(jìn)入紅細(xì)胞的情況，結(jié)果表明3種連接物都增強(qiáng)了PNA的細(xì)胞攝入水平，而且十五肽的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)效率最好；但是十五肽連接物的水溶性差，而另外兩種六肽和十肽連接物的水溶性較好。

2.2PNA-親脂性配體連接物

PNA與疏水性化合物或類脂共價結(jié)合所形成的連接物具有某些優(yōu)異的特性。例如，在PNA 的N末端連接疏水性長碳鏈，在C末端連接氨基酸殘基，該連接物具有良好的親水親油性，與DNA雜交時表現(xiàn)出更好特異性[42]。該連接物還可自組裝成球形膠束，在生物傳感器、基因藥物等方面具有應(yīng)用潛力[43]。而且PNA-親脂性配體連接物在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面也顯示出很好的性能。表3總結(jié)了近十年來成功用于PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的親脂性配體化合物。

表3　用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-親脂性配體連接物Table 3 Examples for delivery of PNA-lipophilic ligand conjugates

親脂性配體中適合于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的一類物質(zhì)是具有一定親水親油平衡值的類脂，在跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)時，親水一端朝向胞外水溶性環(huán)境，而疏水一端則朝向細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜作用。這種修飾典型代表是膽酸和膽固醇共價連接PNA，該連接物在體內(nèi)還具有一定的肝臟靶向作用，具有開發(fā)成肝臟靶向制劑的潛力[44]。Shiraishi 等[44]將PNA通過半琥珀酸酯鍵與膽固醇或膽酸結(jié)合，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中對復(fù)合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能進(jìn)行測試，結(jié)果表明所得到的復(fù)合物高效地通過細(xì)胞膜，而且PNA-膽酸復(fù)合物的水溶性更好。Joshi等[45]將PNA與膽固醇通過賴氨酸連接，制備了一種高效的磁共振造影劑，其轉(zhuǎn)運(yùn)性能和DNA特異性結(jié)合性能都很好。此外，疏水性較強(qiáng)的芳雜環(huán)化合物與PNA結(jié)合也顯示出較好的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Shiraishi等[46]研究了多種芳雜環(huán)化合物修飾PNA及其細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況，這些芳雜環(huán)化合物包括吖啶、苯并咪唑、咔唑、蒽醌、芘、卟啉、萘嵌間二氮雜苯、煙酸己可堿、紫菜堿、補(bǔ)骨脂等，并采用HeLa pLuc705和p53R細(xì)胞考察這些PNA連接物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果表明，芳雜環(huán)化合物具有普遍增強(qiáng)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，其中吖啶和煙酸已可堿與PNA形成的連接物活性最高。但是，目前還不清楚芳雜環(huán)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)活性之間的關(guān)系。另一類適用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)的親脂性配體是聚合物，在PNA中成功應(yīng)用的有聚磷酸酯、聚乙烯胺 (PEI)、聚乙二醇 (PEG) 等。Shiraishi等[47]合成了聚合度分別為3、7、10的PNA-聚谷氨酰胺磷酸酯和聚合度分別為4、5、6的PNA-聚賴氨酸二磷酸酯PNA連接物，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，將聚磷酸酯共價連接在PNA上顯著地增強(qiáng)了PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，而且不影響其雜交特異性和親和性。此外，磷酸酯的數(shù)目對PNA的轉(zhuǎn)運(yùn)有影響，六聚賴氨酸二磷酸酯連接物的活性最強(qiáng)，與未修飾PNA相比，其細(xì)胞攝取率可增加20倍。Berthold等[48]將PNA通過二硫鍵與聚乙烯胺連接得到PNA-PEI復(fù)合物，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞傳遞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，PEI可以作為PNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的高效引導(dǎo)物，而且不受胞內(nèi)溶酶體的影響。

上述親脂性配體中，諸如膽固醇、聚磷酸酯、PEI、PEG等都屬于陽離子型轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)。Llovera等[49]指出陽離子型連接物與細(xì)胞膜表面親和力強(qiáng)，而PNA細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率與細(xì)胞表面PNA濃度密切相關(guān)，這是上述配體具有高效轉(zhuǎn)運(yùn)性能的重要原因之一。同時我們發(fā)現(xiàn)，前文所述的PAPNA、Isox-PNA、am-PNA、amp-PNA以及CPP都具有帶正電荷性質(zhì)，其轉(zhuǎn)運(yùn)性能也與自身所帶正電荷相關(guān)。因此我們認(rèn)為，在今后合成PNA新單體和尋找新配合物中，為了提高PNA轉(zhuǎn)運(yùn)性能，可以考慮將引入帶正電荷基團(tuán)作為一種有效的措施。

表4　用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-功能性配體連接物Table 4 Examples for delivery of PNA- functional ligand conjugates

2.3PNA-功能性配體連接物

近年來，將PNA開發(fā)成基因藥物是研究熱點(diǎn)之一，然而導(dǎo)致PNA成藥性差的最大障礙依然是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)難題。將PNA與合適的具有藥理活性的功能性配體共價連接是PNA藥物開發(fā)中的一種成功嘗試。PNA-功能性配體連接物的成功設(shè)計不僅改善了PNA的細(xì)胞攝入水平，同時也將功能性配體化合物導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)PNA和功能性配體雙重治療作用。該連接物中，配體不僅僅具有協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，還能發(fā)揮自身藥理活性。表4總結(jié)了近年來研究的具有增強(qiáng)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的功能性配體化合物。

本實(shí)驗(yàn)室在PNA-功能性配體連接物方面做了一些研究工作，王建華[50-51]研究了PNA與氟尼辛和阿司匹林的共價連接物的合成方法，所得到的兩種連接物具有良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能。氟尼辛是一種非甾體抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥，主要治療病毒性感染引起的豬無名高熱綜合征和急性高熱炎癥。本實(shí)驗(yàn)室制備的PNA-弗尼辛連接物在用量為2 mg/kg時，仔豬的體溫降低值為0.56 ℃；而單獨(dú)使用弗尼辛用量為4 mg/kg時，仔豬的體溫降低值為0.57 ℃；單獨(dú)使用PNA用量為10 mg/kg時，仔豬的體溫降低值為0.74 ℃。PNA與氟尼辛共價連接所合成的連接物對豬高熱病混合感染引起的疾病具有顯著治療效果，而且效果比單獨(dú)使用PNA或者氟尼辛好。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕、抗血小板凝集以及提高免疫力等藥理作用。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，分別將阿司匹林、PNA和PNA-阿司匹林連接物給藥4周后，體內(nèi)白細(xì)胞水平分別為 (22.9±3.7)×109/L、(23.1±4.6)×109/L和(26.2±2.9)×109/L；免疫球蛋白G濃度分別為 (53.69±8.97) mg/mL、(47.12±4.53) mg/mL、(62.36±9.58) mg/mL；超氧化物歧化酶濃度分別為(23.99±1.26) μg/mL、(18.02±2.45) μg/mL、(29.60±1.78) μg/mL。PNA-阿司匹林連接物能明顯提高生物體內(nèi)白細(xì)胞、免疫球蛋白G和超氧化物歧化酶水平，可用于制備免疫增強(qiáng)劑，應(yīng)用前景較好。

具有較好細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的PNA-功能性配體連接物還有以下幾種。Bendifallah等[52]提出了一種連接PNA與功能性配體的2-([N-Boc-氨基乙酸]甲氧基) 苯甲酸酯鍵結(jié)構(gòu)，通過該酯鍵結(jié)構(gòu)將PNA與金剛烷共價連接得到PNA-酯鍵-金剛烷連接物。通過IMR-90細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)和HeLa pLuc705細(xì)胞的反義活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該連接物能順利進(jìn)入IMR-90細(xì)胞并在細(xì)胞核附近聚集，其反義活性有一定的提高，但不太顯著。該連接物另一特性是結(jié)構(gòu)中的酯鍵在體外穩(wěn)定；而在體內(nèi)，由于酶的作用，穩(wěn)定性下降2 000–3 000倍。因此，PNA-酯鍵-金剛烷連接物在體內(nèi)能分解為PNA和金剛烷，這種酯鍵結(jié)構(gòu)具有開發(fā)成“前藥”的潛力。Das等[53]發(fā)現(xiàn)PNA與新霉素的連接物具有良好的細(xì)胞攝入水平，而且，減少氨基基團(tuán)數(shù)目，得到的PNA-氨基葡萄糖胺連接物的轉(zhuǎn)運(yùn)效果更好。新霉素是一種氨基糖苷類抗生素，通過與16S rRNA結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA編碼錯誤，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。將6-氨基葡萄糖胺環(huán)與HIV-1 TAR RNA互補(bǔ)的十六聚PNA連接，所得到的連接物與靶序列結(jié)合牢固，而且在被HIV-1感染的細(xì)胞中，有效地抑制了病毒復(fù)制，而在同樣條件下，未修飾PNA很難進(jìn)入細(xì)胞。Browne等[54]將PNA以不同的方式與兩種維生素E連接，其中一種帶有長碳鏈，得到的連接復(fù)合物中部分具有較好的雜交特性，并且提高了PNA的細(xì)胞攝入水平和生物利用度。而且維生素E自身是一種特高免疫力的藥物，具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老的功能。因此，這種連接物不但不會有細(xì)胞毒性，而且還具有PNA與維生素E的協(xié)同治療的潛在應(yīng)用。

3　結(jié)語與展望

PNA自1991年提出以來，由于具有優(yōu)異的雜交性能、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特性及方便有效的合成方法受到重視，隨著各種新單體的成功合成和寡聚體修飾的研究，PNA的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展。早期作為分子生物學(xué)工具，在基因檢測、醫(yī)療診斷和生物傳感器等方面取得了較好的應(yīng)用。近年來，對PNA的研究的熱點(diǎn)之一轉(zhuǎn)向基因治療，通過對PNA的修飾與改造，開發(fā)PNA反義藥物的潛力。目前，PNA在反義藥物方面應(yīng)用的最大障礙是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)差，并導(dǎo)致生物利用度低，成藥性差。

為提高PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，包括細(xì)胞膜改造、骨架修飾、配體修飾等方法的成功應(yīng)用，在改善PNA細(xì)胞攝入水平差的難題上已取得了一定進(jìn)展，部分地解決了這些問題。但是，目前的研究主要處于體外細(xì)胞水平，PNA在生物體內(nèi)的吸收、代謝及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面還有待于進(jìn)一步探討。迄今還沒有PNA藥物進(jìn)入臨床研究階段，這與PNA的生物利用度和細(xì)胞毒性等方面的缺陷，以及缺乏體內(nèi)研究數(shù)據(jù)有關(guān)。

今后，改善PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能是研究的重點(diǎn)之一。我們認(rèn)為對PNA自身結(jié)構(gòu)的修飾在成藥性方面比細(xì)胞膜滲透法和電致孔法更為有效，開發(fā)適合的骨架結(jié)構(gòu)和尋找有效的配體引導(dǎo)化合物可能是促進(jìn)PNA在反義藥物方面取得突破的一項(xiàng)重要工作。目前，已報道的骨架修飾型PNA大約有幾十種，從水溶性、雜交性能、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能等篩選指標(biāo)出發(fā)，部分骨架修飾PNA具有較好的應(yīng)用前景。同時，PNA的雜交性能與骨架空間構(gòu)型密切相關(guān)，對PNA骨架進(jìn)行修飾應(yīng)在保持其骨架基本構(gòu)型不變的基礎(chǔ)上進(jìn)行。這給PNA的骨架修飾提出了較為苛刻的要求，并在一定程度上限制了骨架修飾型PNA的結(jié)構(gòu)變化。而通過選擇合適的配體，與PNA共價連接形成PNA-配體連接物不改變PNA自身特性，但賦予PNA在諸如細(xì)胞毒性、藥理活性以及細(xì)胞攝取率等方面更優(yōu)異的性能，具有更好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室將抗病毒藥物和增強(qiáng)免疫力藥物與PNA寡聚體N末端共價連接，動物臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PNA-藥物連接物治療效果更好。同時，我們認(rèn)為可以在以下幾方面作嘗試：第一，將PNA骨架修飾與配體連接物修飾結(jié)合，首先合成具有良好轉(zhuǎn)運(yùn)潛力的骨架修飾單體PNA，在聚合時，在寡聚體末端或中間引入引導(dǎo)配體，綜合利用兩種修飾的優(yōu)點(diǎn)；第二，將PNA修飾物與制劑開發(fā)手段結(jié)合，如采用脂質(zhì)體、納米粒等制劑新技術(shù)協(xié)助修飾型PNA轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)PNA的臨床應(yīng)用；第三，開發(fā)具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能性化合物，如前所述，維生素E、阿司匹林、氟尼辛等藥物既可作為PNA轉(zhuǎn)運(yùn)引導(dǎo)化合物，同時自身又具有特定的藥理活性，這種PNA連接物具有雙重治療的優(yōu)異性能。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Cellular delivery of modified peptide nucleic acids: a review

Chundong Liu, Jianhua Wang, and Fang Zeng
Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044, China

Abstract:Peptide nucleic acid (PNA) is a DNA surrogate in which the phosphate deoxyribose backbone of DNA is replaced by repeating N-(2-aminoethyl)glycine units. PNA can hybridize to the complementary DNA and RNA with higher affinity than their oligonucleotide counterparts. This character of PNA not only makes it a new tool for the studies of molecular biology but also the potential candidate for gene-targeting drugs. The non-ionic backbone of PNA leads to stablehybrids with the nucleic acids, but at the same time, the neutral backbone results in poor cellular uptake. To address this problem, studies on modified PNA progress rapidly in recent years. We reviewed literature reports combined with our study about the delivery methods, including backbone modified PNA and PNA-ligand conjugates, and the cellular uptake of modified PNA. In addition, we summarized the problems and future prospect of the cellular delivery of modified PNA.

Keywords:peptide nucleic acids, modified, cellular delivery

Corresponding author:Jianhua Wang. Tel: +86-23-65102507; E-mail: wjh@cqu.edu.cn