ggpS基因過(guò)表達(dá)對(duì)集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影響

馬培珍，談曉明，呂雪峰，田繼遠(yuǎn) 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)　食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東　青島　6609 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所　中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東　青島　660

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ggpS基因過(guò)表達(dá)對(duì)集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影響

馬培珍1,2，談曉明2，呂雪峰2，田繼遠(yuǎn)1
1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109
2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266101

馬培珍, 談曉明, 呂雪峰, 等. ggpS基因過(guò)表達(dá)對(duì)集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 347–354.

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摘 要:為了研究甘油葡萄糖苷磷酸合成酶 (GgpS) 在集胞藻PCC 803甘油葡萄糖苷和甘油合成中的作用，本研究在前期獲得高產(chǎn)甘油葡萄糖苷藻株的基礎(chǔ)上分別過(guò)量表達(dá)來(lái)自于集胞藻PCC 6803自身和聚球藻PCC 7002的甘油葡萄糖苷磷酸合成酶基因ggpS，并測(cè)定了在不同濃度NaCl脅迫時(shí)突變?cè)逯甑母视推咸烟擒蘸透视头e累量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的突變株甘油葡萄糖苷合成沒(méi)有提高，但是甘油合成顯著增強(qiáng)。此外，當(dāng)培養(yǎng)基NaCl濃度從600 mmol/L提高到900 mmol/L時(shí)，集胞藻PCC 6803自身ggpS過(guò)表達(dá)藻株的甘油合成進(jìn)一步提高75%。這些結(jié)果顯示了GgpS在將碳代謝流導(dǎo)入集胞藻甘油合成途徑中的作用。研究成果也為進(jìn)一步通過(guò)基因工程改造提高集胞藻甘油葡萄糖苷和甘油合成效率奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:甘油葡萄糖苷，甘油，集胞藻PCC6803，ggpS基因，基因工程

Received: July 5, 2015; Accepted: August 31, 2015

Supported by: The Shandong Province Science and Technology Development Project (No. 2014GSF121033), the State Oceanic Administration (SOA) Global Change and Air-Sea Interaction Program (No. GASI-03-01-02-05).

山東省科技發(fā)展計(jì)劃 (No. 2014GSF121033)，國(guó)家海洋局“全球變化與海氣相互作用”專項(xiàng) (No. GASI-03-01-02-05) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-21 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151021.1034.003.html

集胞藻Synechocystis PCC 6803是一種單細(xì)胞淡水藍(lán)藻，具有與高等植物類似的光合系統(tǒng)，一直被作為光合作用研究的模式生物[1]。由于其遺傳改造方便、生長(zhǎng)速度較快，近年來(lái)集胞藻PCC 6803又被用作光合細(xì)胞工廠[2]，用于合成氫氣[3]、乙醇[4]、乙烯[5]、異戊二烯[6]、乳酸[7-8]、蔗糖[9]、脂肪酸[10]、脂肪醇[11]和脂肪烴[12]等多種生物燃料和化學(xué)品。雖然這些研究引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注，但是由于大多數(shù)產(chǎn)品價(jià)值和產(chǎn)率低，因此目前仍處于研發(fā)階段。在這種情況下，發(fā)展一種利用藍(lán)藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物的技術(shù)路線，將更具可行性和潛力，也將推動(dòng)藍(lán)藻光合生物合成技術(shù)路線的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

甘油葡萄糖苷 (Glucosylglycerol) 是一類由甘油分子與葡萄糖分子以糖苷鍵結(jié)合的物質(zhì)，由葡萄糖分子的構(gòu)型、結(jié)合甘油分子的位置分為多種；其中作為天然滲透壓抵抗分子的是2-O-(α-D-gluco-pyranosyl)-sn-glycerol (以下簡(jiǎn)稱GG)。GG是一種大分子穩(wěn)定劑，可用于蛋白質(zhì)藥物等的長(zhǎng)期保存[13]；還是一種良好的化妝品添加劑，具有保濕、抗氧化和抗衰老等功效，可以消除潔面后皮膚的緊繃感[14]。日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品 (如清酒) 中也被發(fā)現(xiàn)含有GG[15]；研究發(fā)現(xiàn)GG還可能具有治療過(guò)敏性呼吸系統(tǒng)疾病[16]、保護(hù)眼角結(jié)膜[17]和降低血糖[18]等多種人體保健功效。

除了化學(xué)[15]和酶催化[19]合成之外，GG也可以被一些異養(yǎng)微生物[20]或光合自養(yǎng)藍(lán)藻[21]合成。以集胞藻PCC 6803為例，在細(xì)胞受到鹽脅迫時(shí)，甘油-3-磷酸和ADP-葡萄糖會(huì)在甘油葡萄糖苷磷酸合成酶 (ggpS基因編碼) 作用下生成甘油葡萄糖苷磷酸，隨后甘油葡萄糖苷磷酸又被甘油葡萄糖苷磷酸磷酸酶 (ggpP基因編碼)水解獲得GG。ggtA、B、C和D基因編碼一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將胞外的GG轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)；而GgpR是一個(gè)抑制ggpS基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)室前期工作敲除了集胞藻PCC 6803的ggtC和D基因，使得部分GG產(chǎn)物分泌到胞外；在此基礎(chǔ)上敲除ggpR，又得到了GG產(chǎn)量進(jìn)一步提高的藻株ΔggtCDΔggpR[22](以下簡(jiǎn)稱ΔΔ)。雖然通過(guò)這些改造，該藻株GG產(chǎn)量提高到約為野生型的3倍，但是離產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的要求仍有不小的距離。

通過(guò)前期合作研究，我們發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC 6803在NaCl脅迫條件下，細(xì)胞除了積累GG外還會(huì)積累一定含量的甘油；而表達(dá)外源的磷酸甘油磷酸酶，可以實(shí)現(xiàn)甘油的大量合成[23]。雖然到目前為止集胞藻PCC 6803鹽脅迫條件下甘油合成的生化途徑還未被報(bào)道，不過(guò)考慮到GG是由甘油和葡萄糖分子通過(guò)糖苷鍵連接而組成的，甘油有可能就來(lái)源于GG的水解。

GgpS催化GG合成的第一步反應(yīng)，其表達(dá)量增加是否會(huì)影響集胞藻GG和甘油的合成呢？為了研究GgpS對(duì)GG和甘油合成的影響，本研究在ΔΔ藻株的基礎(chǔ)上分別過(guò)表達(dá)了來(lái)源于集胞藻PCC 6803或聚球藻PCC 7002的ggpS基因，分析了這些基因工程改造對(duì)ΔΔ藻株在不同NaCl濃度下GG和甘油合成方面的影響。

1　材料與方法

1.1試劑

集胞藻PCC 6803突變株ΔΔ由本實(shí)驗(yàn)室保存；甘油葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 (50%，W/W) 購(gòu)自德國(guó)Bitop公司；用于分子克隆的試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司 (美國(guó))；DNA 引物在Sangon公司(中國(guó)上海) 合成，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司 (美國(guó))。

1.2儀器

離子色譜ICS-3000 (DIONEX)、T 6新銳可見(jiàn)光分光光度計(jì) (北京普析通用)、DU800 NUCLEIC ACID/PROTEIN ANALYZER (BECKMAN COULTER)、GXZ-4300智能光照培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)。

1.3方法

1.3.1質(zhì)粒和集胞藻突變株的構(gòu)建

所有引物見(jiàn)表1。大腸桿菌E. coli DH5α被用作分子克隆的宿主菌。用KpnⅠ+NdeⅠ酶切pXX47[24]，回收得到約600 bp的啟動(dòng)子片段PcpcB；將pWD38用相同的內(nèi)切酶酶切，回收得到約8 kb的載體片段；將以上兩個(gè)片段連接得到用于過(guò)表達(dá)集胞藻PCC 6803來(lái)源ggpS (以下用6803ggpS表示) 的重組質(zhì)粒pPM2。

以聚球藻PCC 7002基因組為模板，以7002-ggpS-F/R (表1) 為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增得到約1.5 kb的ggpS基因片段，用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切以獲得粘性末端；將pPM2質(zhì)粒用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，以獲得7 kb的載體片段；將上述片段連接得到用于過(guò)表達(dá)聚球藻PCC 7002來(lái)源ggpS (以下用7002ggpS表示) 的重組質(zhì)粒pPM7。

將pPM2和pPM7轉(zhuǎn)化集胞藻ΔΔ，以補(bǔ)加壯觀霉素、卡那霉素和氯霉素的BG11固體平板篩選得到轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)多輪劃線分離、液體傳代和PCR鑒定，分別獲得分離完全的純合突變株ΔΔ-PM2和ΔΔ-PM7。

表1　本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2集胞藻藻株的常規(guī)培養(yǎng)方法

將集胞藻各突變?cè)逯暝贐G11固體平板、30 ℃、30 μEm–2·s–1光照強(qiáng)度的條件下日常傳代培養(yǎng)。在柱式反應(yīng)器培養(yǎng)前，先從平板上刮取少量藻細(xì)胞至BG11液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、30 μEm–2·s–1、140 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；然后再將這些培養(yǎng)物按1∶10 (V/V) 的比例接種到新鮮BG11液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、30?50 μEm–2·s–1、通入空氣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至OD730為1.5?2.0。當(dāng)需要時(shí)，加入壯觀霉素至20 mg/L、卡那霉素至30 mg/L，氯霉素至10 mg/L。

1.3.3集胞藻藻株的柱式反應(yīng)器培養(yǎng)方法

將常規(guī)液體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物，倒入滅菌的柱式光反應(yīng)器內(nèi)，接種體積為200 mL，在30 ℃、100 μEm–2·s–1、通入5% CO2(V/V) 的條件下培養(yǎng)；待生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期 (OD730=8–9)后，加入BG11配制的5 mol/L NaCl溶液至NaCl終濃度為600 mmol/L，然后將藻細(xì)胞繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)，每2天取樣1 mL用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng) (新銳，可見(jiàn)光分光光度計(jì)T6)。在鹽脅迫后的第6天取1 mL藻細(xì)胞樣品，經(jīng)12 000 r/min離心5 min，將得到的上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，并稀釋后用于離子色譜檢測(cè)。

1.3.4GG和甘油的測(cè)定方法

離子色譜ICS-3000 (DIONEX) 檢測(cè)樣品GG含量參考文獻(xiàn)[22]中描述進(jìn)行。檢測(cè)器為配套的電化學(xué)檢測(cè)器 (DIONEX) ，使用內(nèi)徑為4 mm × 250 mm 的carbPac?A1柱；淋洗液為800 mmol/L NaOH，流速為0.4 mL/min。

2　結(jié)果與分析

2.1過(guò)表達(dá)ggpS的重組質(zhì)粒構(gòu)建

PcpcB啟動(dòng)子是目前被鑒定在集胞藻中具有最強(qiáng)啟動(dòng)活性的啟動(dòng)子；使用該啟動(dòng)子，外源蛋白的表達(dá)量能達(dá)到集胞藻PCC 6803可溶性蛋白的15%[25]。本實(shí)驗(yàn)室使用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)乙烯合成酶在集胞藻PCC 6803表達(dá)亦獲得了優(yōu)于其他啟動(dòng)子的效果[23]。因此，我們選擇用PcpcB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ggpS基因在ΔΔ藻株過(guò)量表達(dá)。

表2　本研究中所用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

通過(guò)酶切將PcpcB啟動(dòng)子從pXX47載體[23]中切下，插入到實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的pWD38載體，即獲得了用于過(guò)表達(dá)集胞藻PCC 6803來(lái)源的ggpS基因的載體pPM2。該載體具有slr0168中性位點(diǎn)上下游片段，用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻后整合到基因組中；而slr0168同源片段中間帶有氯霉素抗性基因片段，用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻后篩選藍(lán)藻轉(zhuǎn)化子；同時(shí)同源片段之間的片段，用于在整合到藍(lán)藻基因組后驅(qū)動(dòng)6803ggpS基因過(guò)表達(dá)。另外，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了來(lái)源于聚球藻PCC 7002的7002ggpS基因，并以其替換pPM2載體上的6803ggpS基因獲得了質(zhì)粒pPM7。

2.2過(guò)表達(dá)6803ggpS或7002ggpS的藻株基因型鑒定

由于藍(lán)藻基因組具有多倍性[27]，通過(guò)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子需要在抗生素選擇壓力下多輪傳代分離才可獲得純合的突變體。在本研究中，我們選擇同源整合位點(diǎn)兩側(cè)序列匹配的引物0168-1/2通過(guò)PCR確定轉(zhuǎn)化子基因組slr0168位點(diǎn)是否有外源片段整合；同時(shí)選擇ggpS基因特異引物 (6803-ggpS-F或7002-ggpS-F) PCR以確認(rèn)外源ggpS基因?qū)氩⒄显趕lr0168位點(diǎn)。從圖1的PCR結(jié)果 (泳道1?4) 可見(jiàn)，對(duì)照野生型藻株slr0168位點(diǎn)沒(méi)有外源基因?qū)?，其PCR條帶長(zhǎng)度為0.5 kb (泳道1)；而ΔΔ-PM2藻株P(guān)CR條帶約為3.8 kb，卻沒(méi)有對(duì)照ΔΔ藻株的0.5 kb條帶 (泳道2)。這證明ΔΔ-PM2藻株slr0168位點(diǎn)有約3.3 kb外源片段的插入且基因組分離完全；以6803-ggpS-F/0168-2引物對(duì)PCR擴(kuò)增得到約為1.5 kb條帶，證明6803ggpS基因整合到了ΔΔ-PM2藻株的slr0168位點(diǎn)。圖1 (泳道5–8) 的PCR結(jié)果也證明ΔΔ-PM7藻株slr0168位點(diǎn)已被成功導(dǎo)入來(lái)源于聚球藻PCC 7002的7002ggpS基因，而且藻株基因組分離完全，是純合的突變株。

2.3ggpS基因過(guò)量表達(dá)對(duì)鹽脅迫下集胞藻細(xì)胞GG合成的影響

ΔΔ在600 mmol/L NaCl脅迫第6天后GG分泌量約為110 mg/L，這與本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[22]基本吻合；而在900 mmol/L NaCl脅迫下，ΔΔ藻株GG分泌量略有提高。但是與ΔΔ藻株相比，在600 mmol/L NaCl脅迫條件下ΔΔ-PM2和ΔΔ-PM7藻株GG合成甚至還略有降低 (分別減少8%和7%)；在900 mmol/L NaCl脅迫條件下ΔΔ-PM2藻株GG合成量略有提高(10%)，但是并不顯著 (P>0.05)，而ΔΔ-PM7藻株GG合成量約減少4% (圖2A)。因此，在ΔΔ藻株中分別過(guò)表達(dá)來(lái)自于集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7002的ggpS基因，并未進(jìn)一步提高藻株的GG合成。

圖1　PCR檢測(cè)集胞藻突變?cè)逯昊蛐虵ig. 1 Genotype determination of Synechocystis mutants by PCR. 1, 3, 5 and 7: wild type genome DNA was used as template. 2 and 4: ΔΔ-PM2 genome DNA was used as template. 6 and 8: ΔΔ-PM7 genome DNA was used as template. Primers 0168-1 and 0168-2 were used in lane 1, 2, 5 and 6. Primers 0168-2 and 6803-ggpS-F were used in lane 3 and 4. Primers 0168-2 and 7002-ggpS-F were used in lane 7 and 8.

圖2　鹽脅迫第6天各突變株在不同鹽濃度下GG (A) 和甘油合成量 (B)Fig. 2 GG (A) and glycerol (B) production in different mutant strains cultured under salt-stressed conditions for 6 days. The glycerol production that was significantly improved compared with the ΔΔ mutant was indicated as star.

如前所述，GG是集胞藻PCC 6803響應(yīng)外界鹽脅迫刺激而合成的一種滲透保護(hù)物質(zhì)，其合成途徑關(guān)鍵基因ggpS的轉(zhuǎn)錄受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GgpR[27]、Slr1588[28]以及染色體DNA超螺旋程度[28]等的多重調(diào)控。另外，Stirnberg等發(fā)現(xiàn)在集胞藻PCC 6803中過(guò)表達(dá)ggpS，雖然GgpS蛋白含量明顯提高，但是在沒(méi)有NaCl脅迫刺激的條件下細(xì)胞仍然不能大量合成GG；而如果敲除ftsH2基因，在鹽脅迫條件下即使ggpS正常受誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、GgpS蛋白含量甚至還高于野生型藻株，但是其GgpS酶活性和GG合成卻顯著低于野生型[30]。所以，集胞藻PCC 6803 GgpS蛋白還受到DNA-蛋白相互作用[29]、FtsH蛋白酶修飾[30]等翻譯后修飾調(diào)控。集胞藻PCC 6803正是通過(guò)這些不同層次的調(diào)控手段保證了細(xì)胞只在需要的時(shí)候合成GG，并將GG含量保持在所需要的水平。因此，本研究利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了ggpS表達(dá)，但是這并不能解除宿主細(xì)胞對(duì)GgpS蛋白在翻譯后水平的調(diào)控；過(guò)量表達(dá)的蛋白并未被激活，可能是GG合成沒(méi)有明顯提高的主要原因。

2.4ggpS基因過(guò)量表達(dá)對(duì)鹽脅迫下集胞藻細(xì)胞甘油合成的影響

與之前報(bào)道[23]采用200 mmol/L NaCl脅迫條件不同，本研究中采用600和900 mmol/L NaCl脅迫條件；而在這兩種條件下，集胞藻ΔΔ藻株甘油合成量均高于文獻(xiàn)報(bào)道，達(dá)到133和199 mg/L (圖2B)，這說(shuō)明甘油的合成在一定范圍內(nèi)隨著NaCl濃度增加而提高。過(guò)表達(dá)6803ggpS之后，甘油合成相對(duì)于ΔΔ藻株顯著增加：在600 mmol/L NaCl脅迫條件下提高了79% (*P<0.05)，而在900 mmol/L NaCl脅迫條件下提高了105% (*P<0.05)。而過(guò)表達(dá)7002ggpS之后，甘油合成相對(duì)于ΔΔ藻株沒(méi)有顯著提高。

當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度從600提高到900 mmol/L后，6803ggpS過(guò)表達(dá)菌株ΔΔ-PM7的甘油積累量又進(jìn)一步提高約75% (圖2B)。甘油含量隨NaCl濃度提高而增加的現(xiàn)象，提示我們甘油可能也在集胞藻PCC 6803鹽脅迫適應(yīng)中發(fā)揮著某種作用。如前所述，我們推測(cè)甘油合成來(lái)自于GG的水解。因此，過(guò)表達(dá)6803ggpS很可能已短暫提高了細(xì)胞內(nèi)的GG含量，但是宿主細(xì)胞感應(yīng)到GG水平的變化，于是啟動(dòng)GG水解酶表達(dá)以將細(xì)胞內(nèi)GG含量維持在所需要的水平。這提示我們要想在ΔΔ藻株基礎(chǔ)上通過(guò)過(guò)表達(dá)ggpS提高GG產(chǎn)量還需要先鑒定和敲除負(fù)責(zé)GG分解的關(guān)鍵酶；而如果希望得到的目標(biāo)產(chǎn)物是甘油，那么過(guò)表達(dá)ggpS和GG分解酶也將是有效的手段。

3　結(jié)論

ggpS基因編碼甘油葡萄糖苷磷酸合成酶，該酶催化集胞藻PCC6803 GG合成途徑的關(guān)鍵步驟；敲除該基因，細(xì)胞不能合成GG，并對(duì)鹽脅迫敏感。在本研究中，來(lái)源于集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7002的ggpS基因分別在高產(chǎn)GG 的ΔΔ藻株中得到過(guò)表達(dá)，但是這一改造未能進(jìn)一步提高GG的合成，但是顯著提高了甘油的合成。另外，提高培養(yǎng)基鹽濃度也被證實(shí)可以進(jìn)一步促進(jìn)甘油的積累。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為將來(lái)進(jìn)一步基因工程改造集胞藻以提高GG和甘油合成指明了方向。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Effects of ggpS over-expression on glycosylglycerol and glycerol biosynthesis of Synechocystis sp. PCC 6803

Peizhen Ma1,2, Xiaoming Tan2, Xuefeng Lü2, and Jiyuan Tian1
1 College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China
2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Abstract:To study the roles of glucosylglycerol phosphate synthase (Ggps) in glucosylglycerol (GG) and glycerol biosynthesis, we over-expressed Ggps from either Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus sp. PCC 7002 in a Synechocystis strain with a high GG titer, and determined the GG and glycerol accumulation in the resultant mutants grown under different NaCl-stress conditions. Ion chromatography results revealed that GG yield was not improved, but glycerol production was significantly enhanced by over-expression of Ggps from Synechocystis sp. PCC 6803 (6803ggpS). In addition, increasing the NaCl concentration of medium from 600 to 900 mmol/L led to a further 75% increase of glycerol accumulation in the mutant strain with 6803ggpS over-expression. These findings show the role of ggpS in driving the carbon flux to the glycerol biosynthesis pathway, and will be helpful for further improvement of GG and glycerol production in Synechocystis.

Keywords:glucosylglycerol, glycerol, Synechocystis sp. PCC 6803, ggpS, genetic engineering

Corresponding author:Jiyuan Tian. Tel: +86-532-80662715; E-mail: jytian_75@qau.edu.cn