美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)及優(yōu)化

徐雪姣，查向東，車媛媛，馬利娟，吳思群，楊培龍，黃火清，姚斌 安徽大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院，安徽　合肥　3060 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院　飼料研究所，北京　0008

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美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)及優(yōu)化

徐雪姣1，查向東1，車媛媛1，馬利娟1，吳思群1，楊培龍2，黃火清2，姚斌2
1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230601
2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081

徐雪姣, 查向東, 車媛媛, 等. 美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)及優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 365–374.

Xu XJ, Zha XD, Che YY, et al. Expression of Pleurocidin from winter flounder in Escherichia coli and optimization of culture conditions. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 365–374.

摘 要:為在大腸桿菌中分泌表達(dá)Pleurocidin，并提高融合蛋白的分泌效率，將Pleurocidin基因和Cherry DNA序列通過(guò)平末端連接融合，再將融合基因整合到pET22b (+) 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。成功構(gòu)建含pET22b (+)-CP重組質(zhì)粒的基因工程菌，用乳糖誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)。在誘導(dǎo)16 h時(shí)加入甘氨酸可以顯著提高融合蛋白Cherry-Pleurocidin的分泌效率。用稀鹽酸水解融合蛋白的酸敏感位點(diǎn)，再進(jìn)一步分離純化即得到r-Pleurocidin，其對(duì)大腸桿菌DH5α和枯草芽孢桿菌BS168具有明顯的抑菌活性。結(jié)果表明成功構(gòu)建了高效表達(dá)Pleurocidin的大腸桿菌基因工程菌，獲得有活性的r-Pleurocidin。

關(guān)鍵詞:Pleurocidin，分泌表達(dá)，Asp-Pro酸敏感位點(diǎn)，抑菌活性

Received: June 19, 2015; Accepted: October 16, 2015

Supported by: Anhui Provincial Natural Science Foundation (No. 1408085MC50).

安徽省自然科學(xué)基金 (No. 1408085MC50) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-12-22 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151222.1415.001.html

陽(yáng)離子抗菌肽是由植物和動(dòng)物產(chǎn)生的陽(yáng)離子型的兩親性分子，一般由12–50個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量小，水溶性好，等電點(diǎn)在8.9–10.7之間，具有兩親α-螺旋和 (或) 兩親β-折疊結(jié)構(gòu)[1]。

海洋生物抗菌肽存在獨(dú)特的翻譯后修飾，例如半胱氨酸結(jié)、鹵化作用、組氨酸和丙氨酸橋，這些修飾可以使海洋生物抵抗嚴(yán)酷的生活環(huán)境[2]。Pleurocidin是從美洲擬鰈Pseudopleuronectes americanu的皮膚粘液中分離出的含25個(gè)氨基酸殘基的線性α-螺旋多肽，具有廣譜的抗菌活性，能夠抑殺多種細(xì)菌和真菌，如肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和白色念珠菌[3-4]。Pleurocidin的等電點(diǎn)為10.05，可以形成兩親的α-螺旋，通過(guò)在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成離子通道，不可逆地破壞細(xì)胞膜，從而殺死細(xì)菌[5]。 Pleurocidin熱穩(wěn)定性好、耐鹽，對(duì)多種食品微生物有抑殺作用，可用于食品保鮮[6]。在體外毒性研究中，Pleurocidin表現(xiàn)出較低的溶血性，具有潛在的治療價(jià)值[7]。

Pleurocidin天然來(lái)源有限，化學(xué)合成價(jià)格昂貴，利用基因工程方法合成Pleurocidin是一條高效低成本的生產(chǎn)途徑。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前應(yīng)用最為廣泛。但是用大腸桿菌表達(dá)抗菌肽卻有一些困難，主要在于抗菌肽對(duì)大腸桿菌有毒性。本實(shí)驗(yàn)室曾嘗試在大腸桿菌內(nèi)非融合表達(dá)Pleurocidin未獲成功。

本文利用來(lái)源于大鼠肝臟細(xì)胞色素b5的親水結(jié)構(gòu)域Cherry[8]，它與信號(hào)肽pelB共同作用，一方面抑制Pleurocidin對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，另一方面促進(jìn)融合蛋白分泌至胞外；對(duì)分泌的重組融合蛋白用酸水解特異性切割A(yù)sp-Pro位點(diǎn)，獲得有活性的r-Pleurocidin。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

質(zhì)粒pET22b (+) 購(gòu)自Novagen公司(Darmstadt, Germany)；大腸桿菌DH5α，BL21 (DE3)和枯草芽孢桿菌BS168均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2工具酶和試劑

NcoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自MBI Fermentas (北京，中國(guó))；T4 PNK和T4 DNA連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司；改良型Lowry法蛋白定量試劑盒、胰蛋白胨、酵母提取物、IPTG、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶等購(gòu)自生工生物工程 (上海)股份有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3重組質(zhì)粒pET22b(+)-CP的構(gòu)建

1.3.1Pleurocidin基因的擴(kuò)增

根據(jù)Pleurocidin基因的氨基酸序列GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL，依據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)并合成Pleurocidin基因的編碼序列5′-GGTTGGGGT AGCTTTTTCAAGAAAGCAGCACATGTTGGT AAACATGTTGGTAAAGCAGCACTGACCCAT TATCTG-3′。以Pleurocidin基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)上、下游引物ple1和ple2 (表1)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃5 min ；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃30 s，循環(huán)30次；72 ℃10 min 。實(shí)驗(yàn)中PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒均經(jīng)1.4%瓊脂糖電泳檢測(cè)，試劑盒純化回收。

1.3.2Cherry DNA序列的擴(kuò)增

參考挪威大鼠細(xì)胞色素b5DNA序列(GenBank登錄號(hào)：BC086945)，設(shè)計(jì)上、下游引物C1和C2 (表1)。反應(yīng)條件同Pleurocidin基因的擴(kuò)增，但退火溫度為60 ℃。引物與基因的合成及質(zhì)粒測(cè)序均由生工生物工程 (上海)股份有限公司完成。

表1　PCR反應(yīng)引物Table 1 PCR primers

1.3.3Cherry DNA序列和Pleurocidin基因平末端連接

將Pleurocidin基因和Cherry DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，用T4多核苷酸激酶37 ℃磷酸化30 min，再加入T4 DNA連接酶37 ℃連接1 h。

1.3.4融合基因Cherry-pleurocidin (CP) 的擴(kuò)增

上述連接產(chǎn)物用無(wú)菌水稀釋20倍后作為模板，以C1和ple2為上、下游引物，PCR擴(kuò)增得到融合基因CP。PCR反應(yīng)條件同Pleurocidin基因的擴(kuò)增。

1.3.5融合基因與質(zhì)粒pET22b (+) 連接及轉(zhuǎn)化

融合基因CP和質(zhì)粒pET22b (+) 經(jīng)NcoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，膠回收后用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆。對(duì)重組質(zhì)粒pET22b(+)-CP (Cherry-Pleurocidin) 進(jìn)行測(cè)序。

1.4誘導(dǎo)表達(dá)

挑測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆接種至含有50 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，按1%量接入新鮮的LB抗性培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度4 g/L的乳糖，37 ℃、30 ℃和25 ℃分別誘導(dǎo)20 h，9 000×g離心1 min，收集上清液和菌體。誘導(dǎo)期間，每隔4 h取樣，Lowry 法[9]測(cè)定培養(yǎng)上清中的總蛋白濃度。用Bandscan軟件掃描分析SDS-PAGE圖譜，估算融合蛋白CP在總蛋白中所占的比例。

1.5不同濃度甘氨酸對(duì)融合蛋白CP分泌效率的影響

誘導(dǎo)16 h時(shí)加入不同濃度的甘氨酸，使終濃度分別為1、2、3、4、5 g/L，誘導(dǎo)20 h時(shí)離心收集上清液。對(duì)乳糖誘導(dǎo)組和乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組培養(yǎng)上清中融合蛋白CP濃度進(jìn)行比較分析。誘導(dǎo)期間，每隔4 h取樣，Lowry法[9]測(cè)定培養(yǎng)上清中的總蛋白濃度。

1.6融合蛋白CP的酸特異性切割

向培養(yǎng)上清中滴加1 mol/L鹽酸，至終濃度為100 mmol/L，65 ℃恒溫水浴72 h；每隔24 h 取1 mL水解液，4 ℃、12 000×g離心10 min。在上清液中，加5倍體積的丙酮，–20 ℃下靜置30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄去上清丙酮，自然風(fēng)干后加100 μL還原性SDS-PAGE上樣緩沖液，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)水解效果。

1.7Pleurocidin純化及質(zhì)譜鑒定

1.7.1離子交換層析

利用Sephadex CM-FF 5 mL陽(yáng)離子交換柱在AKTA Explorer100進(jìn)行分離純化。條件為：波長(zhǎng)214 nm和280 nm，流速1 mL/min，平衡緩沖液為20 mmol/L PB (pH 7.0)，洗脫緩沖液為20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl、pH 8.0。0.2 mol/L NaCl洗脫，收集洗脫峰樣品，用Tricine-SDSPAGE電泳分析。

1.7.2電洗脫

1) 凝膠切割：將SDS-PAGE胺凝膠用蒸餾水徹底沖洗，切下目的條帶，搗碎，放入透析袋內(nèi)，注入Tris-甘氨酸緩沖液 (pH 8.3)，置4 ℃冰箱；2) 洗脫：將透析袋放入盛有預(yù)冷Tris-甘氨酸緩沖液 (pH 8.3) 的核酸電泳槽 (冰浴)中，100 V電泳1 h左右；待考馬斯亮藍(lán)完全從凝膠條帶上跑出時(shí)，將透析袋放入預(yù)冷的0.01 mol/L的PBS溶液中透析；3) 沉淀：取出透析袋內(nèi)的液體用丙酮過(guò)夜沉淀，透析液與丙酮體積比為1∶5；最后用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)電洗脫純化效果。純化后樣品經(jīng)透析脫鹽后凍干，再用二維液相色譜多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用儀(2DIC-MS) 進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.8Pleurocidin的抑菌活性檢測(cè)

利用瓊脂糖擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，取10 mg純化后的Pleurocidin溶于4 mL PB緩沖液(pH 7.0) 中，過(guò)濾滅菌，備用。將過(guò)夜活化的大腸桿菌DH5α和枯草芽胞桿菌BS168，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，取制備好的Pleurocidin進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以融合蛋白CP和無(wú)菌水作陰性對(duì)照，氨芐青霉素鈉作陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)，20 h后觀察抑菌效果，并測(cè)量抑菌圈直徑。

最小抑菌濃度的測(cè)定[10-11]：將處于對(duì)數(shù)期的大腸桿菌DH5α和枯草芽孢桿菌BS168稀釋到104–105CFU/mL，取1 mL菌液和10 μL不同濃度的r-Pleurocidin加入到EP管中，以PB緩沖液作陰性對(duì)照，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測(cè)菌液的OD600，以吸光度值無(wú)變化處所對(duì)應(yīng)的r-Pleurocidin濃度為最小抑菌濃度 (MIC)。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

CP融合基因片段的大小為413 bp，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶大小與預(yù)期一致 (圖1)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b (+)-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得了陽(yáng)性克隆，測(cè)序證明堿基序列正確，pelB編碼序列、Cherry DNA和Pleureucidin基因依次正確連接。

2.2融合蛋白CP的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS-PAGE分析表明，30 ℃恒溫誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)組培養(yǎng)上清和菌體中均出現(xiàn)融合蛋白CP，信號(hào)肽完全切割，而未誘導(dǎo)組在相同位置未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶 (圖2)。誘導(dǎo)組誘導(dǎo)20 h時(shí)上清中總蛋白濃度達(dá)到520 μg/mL；融合蛋白CP占總蛋白67.2%，融合蛋白CP濃度為349 μg/mL；菌體內(nèi)也存在融合蛋白CP，根據(jù)Bandscan中的灰度值乘以總體積，估算出胞外融合蛋白CP占總?cè)诤系鞍證P的73.2%。誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)沒(méi)有表達(dá)條帶，30 ℃表達(dá)效果優(yōu)于25 ℃。

圖1　融合基因Cherry-Pleurocidin的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR product of Cherry-Pleurocidin fusion gene. M: DNA marker; 1: PCR products of fusion gene.

圖2　pET22b (+)-CP工程菌誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the induced expression in the engineering bacteria harboring pET22b (+)-CP. 1: cell pellet of the control group; 2: cell pellet of the lactose induction group; 3: culture supernatant of lactose induction group; 4: culture supernatant of the control group; M: protein marker (from bottom to top: 14.4, 20, 31, 45, 66.2 and 98 kDa).

圖3　乳糖誘導(dǎo)組和乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組SDS-PAGE比較圖Fig. 3 Comparison between the lactose induction group and the lactose+glycine group by SDS-PAGE. 1: cell pellet of the lactose induction group; 2: culture supernatant of the lactose induction group; 3: cell pellet of the lactose + glycine group; 4: culture supernatant of the lactose + glycine group; M: protein marker (from bottom to top: 12, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 and 120 kDa).

2.3不同濃度甘氨酸對(duì)融合蛋白CP分泌效率的影響

在誘導(dǎo)16 h時(shí)加入甘氨酸，當(dāng)甘氨酸終濃度增加為4 g/L，融合蛋白CP接近完全分泌 (圖3)；終濃度為5 g/L時(shí)，分泌效果與4 g/L無(wú)明顯差異。誘導(dǎo)20 h后上清中總蛋白濃度達(dá)到608 μg/mL；融合蛋白CP占總蛋白濃度的84.5%，融合蛋白CP濃度為513 μg/mL。配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析表明：乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組 (甘氨酸終濃度4 g/L) 胞外融合蛋白CP產(chǎn)量極顯著高于乳糖誘導(dǎo)組。

不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)培養(yǎng)上清中的總蛋白濃度變化曲線如圖4所示。乳糖+甘氨酸誘導(dǎo)組加入甘氨酸后，培養(yǎng)上清中總蛋白濃度顯著增加，隨后也一直高于乳糖誘導(dǎo)組。

2.4融合蛋白CP的酸特異性切割

鹽酸濃度為100 mmol/L，水解溫度65 ℃，水解時(shí)間24 h、48 h、72 h，均有目的條帶出現(xiàn)；48 h和72 h目的條帶含量沒(méi)有明顯差異 (圖5)。

2.5Pleurocidin純化、SDS-PAGE電泳檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)

鹽酸水解后的培養(yǎng)上清用Sephadex CM-FF層析柱吸附，用0.2 mol/L NaCl洗脫，洗脫液經(jīng)電泳檢測(cè)出現(xiàn)多個(gè)條帶，對(duì)r-Pleurocidin條帶利用電洗脫進(jìn)一步純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可以達(dá)到電泳純 (圖6)。樣品進(jìn)行2DIC-MS質(zhì)譜分析，樣品的離子模式為[M+H]2+，對(duì)應(yīng)的分子量為2 809.26 Da；與理論分子量2 808.2 Da相符，誤差在儀器測(cè)量允許范圍內(nèi) (圖7)。樣品的實(shí)際二級(jí)碎片離子與MS2理論碎片離子一致，證實(shí)樣品為r-Pleurocidin (圖8、9)。

圖4　培養(yǎng)基中總蛋白濃度隨誘導(dǎo)時(shí)間變化曲線圖Fig. 4 Time course of the total protein concentration in culture supernatant.

圖5　融合蛋白Cheery-Pleurocidin酸切割的Tricine-SDS-PAGE分析Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE analysis of Cheery-Pleurocidin Asp-Pro cleavage. 1: control sample incubated at the same condition without any acid added for 72 hours; 2–4: the supernatant of the hydrolysis solution at the time point of 24 h, 48 h and 72 h; M: low range protein marker (from bottom to top: 4.1, 6.5, 9.5, 14.4, 20, 27, 35, 45, and 66 kDa).

圖6　r-Pleurocidin的純化圖Fig. 6 Tricine-SDS-PAGE analysis of purified r-Pleurocidin. (A) Purification of r-Pleurocidin by cation exchange chromatography. (B) Purification of r-Pleurocidin by electroelution. 1: fractions from the Sephadex CM-FF 5 mL column; 2: purified r-Pleurocidin; M: low range protein marker (from bottom to top: 4.1, 6.5, 9.5, 14.4, 20, 27, 35, 45, and 66 kDa).

圖7　r-Pleurocidin的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 7 Primary mass spectrometry (DIC-MS) of r-Pleurocidin.

圖8　r-Pleurocidin的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 8 The second grade mass spectrometry(DIC-MS) of r-Pleurocidin.

圖9　r-Pleurocidin的MS2理論碎片離子Fig. 9 MS2 theoretical fragment ions of r-Pleurocidin.

2.6r-Pleurocidin的抑菌活性檢測(cè)

瓊脂糖擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn)表明，r-Pleurocidin對(duì)大腸桿菌DH5α (500 μg r-Pleurocidin) 和枯草芽胞桿菌BS168 (250 μg r-Pleurocidin) 均有明顯的抑菌活性 (圖10)。通過(guò)液體抑制測(cè)定法確定了r-Pleurocidin對(duì)大腸桿菌DH5α和枯草芽孢桿菌BS168的最小抑菌濃度分別為300、150 μg/mL。

圖10　r-Pleurocidin的抑菌活性檢測(cè)Fig. 10 Antibacterial activity assay of r-Pleurocidin. (A) Bacillus subtilis BS168. (B) E. coli DH5α. 1: ampicillin sodium salt; 2: r-Pleurocidin; 3: the fusion protein CP; 4: sterile ddH2O.

3　討論

目前關(guān)于Pleurocidin的重組表達(dá)研究涉及原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。Bryksa等用pET21a質(zhì)粒為載體在大腸桿菌中融合表達(dá)Pleurocidin基因，融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，溶解后用羥胺切除融合頭而獲得完整的重組Pleurocidin[12]；該方法的純化過(guò)程較為復(fù)雜，而且所用羥胺是致癌劑。Burrowes等將Pleurocidin cDNA基因片段插入到pPICZα質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平正常，但并未獲得翻譯產(chǎn)物，可能是Pleurocidin被蛋白水解酶降解或表達(dá)產(chǎn)量過(guò)低[13]。Brocal等用魚(yú)類細(xì)胞系表達(dá)Pleurocidin，Western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞系的培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)均有Pleurocidin，但表達(dá)產(chǎn)量低，表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，成本較高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)[14]。

大腸桿菌異源表達(dá)是生產(chǎn)重組蛋白的有力工具，而分泌表達(dá)更具有避免胞內(nèi)降解、可連續(xù)生產(chǎn)、便于分離純化等優(yōu)勢(shì)。但大腸桿菌中外源蛋白的分泌表達(dá)面臨一些困難，例如1) 大腸桿菌雙層細(xì)胞膜不利于分泌，蛋白質(zhì)有分泌到胞外和周質(zhì)兩種可能性；2) 與胞內(nèi)表達(dá)比較，胞外分泌所對(duì)應(yīng)的高密度發(fā)酵技術(shù)尚不夠成熟[15]。隨著對(duì)大腸桿菌蛋白分泌系統(tǒng)了解的深入，分泌表達(dá)技術(shù)也更為有效[16]，主要從以下幾個(gè)方面提高分泌效率：1) 宿主菌本身的遺傳改造；例如Wacker Biotech公司開(kāi)發(fā)ESETEC?系統(tǒng)，其宿主菌若干外膜蛋白被突變[17]；2) 選擇或改造信號(hào)肽序列[18]；3) 目的蛋白的修飾或結(jié)構(gòu)改變[19]；4) 優(yōu)化培養(yǎng)條件，如添加甘氨酸、Triton X-100，改變培養(yǎng)溫度等[20-21]。

Ⅱ型分泌系統(tǒng)是最常用的分泌系統(tǒng)，它先通過(guò)SecB、SRP或TAT通路，將含信號(hào)肽的蛋白質(zhì)前體轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)，再通過(guò)MTB機(jī)制由12–16個(gè)蛋白質(zhì)組成的secreton分泌到胞外[15]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PelB-Cherry-Pleurocidin融合基因，表達(dá)過(guò)程中信號(hào)肽PelB切割完全，融合蛋白CP分泌到培養(yǎng)上清中。PelB信號(hào)肽屬于Ⅱ型分泌系統(tǒng)的SecB途徑，配合使用Cherry作為前導(dǎo)序列[21]，一方面抑制抗菌肽pleurocidin對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，另一方面促進(jìn)融合蛋白CP直接分泌到胞外。另外，甘氨酸干擾大腸桿菌細(xì)胞壁肽聚糖層的合成，破壞細(xì)胞外膜的完整性[22]，添加適量的甘氨酸促進(jìn)了胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，有效提高了產(chǎn)量和分泌效率。本實(shí)驗(yàn)中融合蛋白CP幾乎全部分泌到胞外，在培養(yǎng)上清中的產(chǎn)量達(dá) 516 mg/L，在同類研究中 (20–500 mg/L) 處于較高水平[23-26]。酸水解切割融合蛋白，成本低，安全性好，操作方便。本實(shí)驗(yàn)中融合蛋白鹽酸水解效果優(yōu)于甲酸和乙酸，但水解過(guò)程中出現(xiàn)了部分蛋白質(zhì)沉淀的問(wèn)題，需要進(jìn)一步摸索條件加以改進(jìn)。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含重組質(zhì)粒pET22b (+)-CP的大腸桿菌工程菌，首次實(shí)現(xiàn)了Pleurocidin在大腸桿菌中高效分泌表達(dá)，結(jié)合下游高密度發(fā)酵，可以獲得更高的產(chǎn)量，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

Expression of Pleurocidin from winter flounder in Escherichia coli and optimization of culture conditions

Xuejiao Xu1, Xiangdong Zha1, Yuanyuan Che1, Lijuan Ma1, Siqun Wu1, Peilong Yang2, Huoqing Huang2, and Bin Yao2
1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China
2 Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:To express Pleurocidin in Escherichia coli and to enhance the secretory efficiency of the fusion protein, the gene encoding Pleurocidin was ligated with Cherry DNA sequence via blunt-end ligation. Then this fusion gene was cloned into pET22b (+) vector and the recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3). Lactose was used to induce expression of fusion protein. The recombinant plasmid pET22b (+) -CP was successfully constructed and high-level expression of fusion protein was induced with lactose. Statistics showed that addition of glycine after 16 h of induction significantly enhanced the secretory efficiency of the fusion protein. After hydrolysis of the fusion protein by diluted hydrochloric acid and some further purification steps, r-Pleurocidin was obtained with antibacterial activity against E. coli DH5α and Bacillus subtilis BS168. In conclusion, the fusion protein was expressed in E. coli and biologically active r-Pleurocidin was obtained after hydrochloric acid cleavage and purification.

Keywords:Pleurocidin, secretory expression, Asp-Pro acid-sensitive sites, antibacterial activity

Corresponding authors: Xiangdong Zha. Tel: +86-551-63861281; E-mail: xdcha@163.com Peilong Yang. E-mail: yangpeilong@caas.cn