下調(diào)gankyrin通過調(diào)節(jié)β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖

潘　杰　汪偉民　蔡煒龍　許洪寶#　韓春蕃　錢福初

浙江省湖州市中心醫(yī)院普外科1(313000)　中心實(shí)驗(yàn)室2

下調(diào)gankyrin通過調(diào)節(jié)β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖

潘杰1*汪偉民1蔡煒龍1許洪寶1#韓春蕃1錢福初2

浙江省湖州市中心醫(yī)院普外科1(313000)中心實(shí)驗(yàn)室2

背景：Gankyrin是一個(gè)含錨蛋白重復(fù)序列的原癌蛋白，其高表達(dá)參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。目的：探討下調(diào)gankyrin表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能機(jī)制。方法：以攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MKN28，分別采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測下調(diào)gankyrin表達(dá)對MKN28細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布及其β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路的影響。結(jié)果：慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率在90%以上，轉(zhuǎn)染gankyrin siRNA后，MKN28細(xì)胞gankyrin蛋白表達(dá)顯著受抑(P<0.01)。與未轉(zhuǎn)染慢病毒和轉(zhuǎn)染對照病毒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染gankyrin siRNA的MKN28細(xì)胞體外生長于第3天起顯著受抑，細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比率增高，S期細(xì)胞比率降低，細(xì)胞中的β-catenin和cyclin D1表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：下調(diào)胃癌細(xì)胞中的gankyrin表達(dá)可通過抑制β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路引起細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞增殖抑制，gankyrin有望成為胃癌靶向治療的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞Gankyrin；胃腫瘤；RNA干擾；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；β連環(huán)素；細(xì)胞周期蛋白D1

beta Catenin;Cyclin D1

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤發(fā)病中居第六位[1]。盡管近年關(guān)于胃癌的診斷和治療已取得一定進(jìn)展，但患者預(yù)后仍然不佳，尋求新的胃癌診治方法一直是臨床醫(yī)師和腫瘤科學(xué)家共同努力的方向。近年來，分子靶向治療技術(shù)的開展給腫瘤患者帶來了福音，然而可能是由于胃癌異質(zhì)性較高，現(xiàn)有針對胃癌的靶向治療藥物療效有限。因此，尋求更多胃癌治療的分子靶點(diǎn)對于改善患者預(yù)后具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，gankyrin高表達(dá)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，與結(jié)腸癌[2]、肝癌[3]、膽管癌[4]、食管鱗癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等多種惡性腫瘤的組織學(xué)分化程度、臨床分期、侵襲、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征以及預(yù)后不良密切相關(guān)，而下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和成瘤能力。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)gankyrin在胃癌組織中亦呈高表達(dá)，且其陽性表達(dá)與腫瘤低分化、轉(zhuǎn)移和T分期呈顯著正相關(guān)，并提示患者預(yù)后不良。本研究擬應(yīng)用慢病毒載體攜帶的siRNA靶向抑制gankyrin在人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，以探討下調(diào)gankyrin表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能機(jī)制，為明確gankyrin是否可作為胃癌靶向治療的分子靶點(diǎn)提供依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株MKN28(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；兔gankyrin多克隆抗體、小鼠β-連環(huán)蛋白(β-catenin)單克隆抗體、小鼠細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，內(nèi)參小鼠β-actin單克隆抗體、MTT(Sigma-Aldrich Co.)，HRP標(biāo)記山羊抗兔、抗小鼠IgG、ECL發(fā)光試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，PI染液(上海江萊生物科技有限公司)；攜帶gankyrin siRNA序列(5’-CTG ACC AGG ACA GCA GAA C-3’[2])的慢病毒載體pGCSIL-GFP和對照病毒(未攜帶任何siRNA序列)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：MKN28細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)，以無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次，每孔先加入無血清培養(yǎng)基0.6 mL，再分別加入攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體pGCSIL-GFP或?qū)φ詹《? μL，輕搖混勻后于培養(yǎng)箱中靜置6 h，棄上清，加入含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察帶有熒光的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞經(jīng)接種、擴(kuò)散后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分別命名為S-MKN28細(xì)胞(轉(zhuǎn)染攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體)和C-MKN28細(xì)胞(轉(zhuǎn)染對照病毒)。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：收集培養(yǎng)至90%融合的各組細(xì)胞，冰上裂解，提取總蛋白，蛋白定量，上樣，12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上， 10%脫脂奶粉抗原封閉，剪取與目的蛋白相對分子質(zhì)量對應(yīng)的條帶，加入以2%牛奶配制的gankyrin抗體(1∶100)、β-catenin抗體(1∶500)、cyclin D1抗體(1∶100)或β-actin抗體(1∶1 000)，室溫靜置4 h，TBS清洗3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔(1∶2 000)或抗小鼠IgG(1∶3 000)孵育50 min，TBS清洗3次，ECL顯色、定影、掃描，凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以其條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。每組細(xì)胞重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取均值。

3. MTT實(shí)驗(yàn)：各組細(xì)胞以1×103/孔接種于96孔板，分別培養(yǎng)1～7 d(因7 d時(shí)MKN28、C-MKN28細(xì)胞生長至90%以上，故終止培養(yǎng))，每組每時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每天于相應(yīng)孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，室溫靜置4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，震蕩10 min后于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處讀取A值，繪制細(xì)胞生長曲線。

4. 流式細(xì)胞檢測：取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，離心、棄上清，加入70%乙醇，4 ℃冰箱過夜，棄上清，PBS清洗細(xì)胞，棄上清，加入PI染液、Triton X-100和RNA酶A，4 ℃避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。每組細(xì)胞重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、慢病毒轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體和轉(zhuǎn)染對照病毒的MKN28細(xì)胞綠色熒光細(xì)胞比率均在90%以上(圖1)，提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

二、Gankyrin siRNA抑制效率

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，gankyrin在MKN28、C-MKN28和S-MKN28細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.48±0.02、0.53±0.03和0.11±0.03，S-MKN28細(xì)胞顯著低于MKN28和C-MKN28細(xì)胞(P<0.01)(圖2)，提示慢病毒載體攜帶的gankyrin siRNA可有效抑制MKN28細(xì)胞中的gankyrin表達(dá)水平，S-MKN28細(xì)胞建模成功，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A、B：轉(zhuǎn)染攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體；C、D：轉(zhuǎn)染對照病毒；A、C：明視野下細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量；B、D：分別為A、C在熒光顯微鏡下的圖像

圖1MKN28細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率

三、下調(diào)gankyrin對MKN28細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制的MKN28、C-MKN28和S-MKN28細(xì)胞生長曲線顯示，三組細(xì)胞第1天數(shù)量基本相同，第2天雖略有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3天起MKN28和C-MKN28細(xì)胞的生長顯著強(qiáng)于S-MKN28細(xì)胞(P<0.01)(圖3)，提示下調(diào)gankyrin表達(dá)可抑制MKN28細(xì)胞的體外增殖能力。

四、下調(diào)gankyrin對MKN28細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，S-MKN28細(xì)胞G1期細(xì)胞比率顯著高于MKN28和C-MKN28細(xì)胞(P<0.01)，S期細(xì)胞比率顯著低于MKN28和C-MKN28

細(xì)胞(P<0.01)，三組間G2期細(xì)胞比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.35)(圖4)，提示下調(diào)gankyrin表達(dá)可使MKN28細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G1期阻滯。

*與同時(shí)點(diǎn)MKN28和C-MKN28細(xì)胞比較，P<0.01

*與同期MKN28和C-MKN28細(xì)胞比較，P<0.01

五、下調(diào)gankyrin對MKN28細(xì)胞β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，β-catenin在MKN28、C-MKN28和S-MKN28細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.95±0.03、 0.95±0.03和0.29±0.02，

*與MKN28和C-MKN28細(xì)胞比較，P<0.01

cyclin D1相對表達(dá)量分別為0.68±0.04、0.73±0.05和0.23±0.04，與MKN28和C-MKN28細(xì)胞相比，S-MKN28細(xì)胞β-catenin、cyclin D1表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖 5)。綜合上述結(jié)果，提示下調(diào)gankyrin表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路影響MKN28細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。

討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多信號(hào)通路參與的復(fù)雜過程，β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路是影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明確其上游調(diào)控基因?qū)τ谀[瘤惡性增殖機(jī)制的研究具有重要意義。 Gankyrin又名PSMD10，系由日本學(xué)者通過cDNA文庫消減雜交技術(shù)克隆得到的在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的基因，是一個(gè)重要的原癌基因，其編碼蛋白含有7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(ankyrin repeats)，可誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞株的非錨定依賴性生長和致瘤性[7]。既往研究顯示gankyrin高表達(dá)參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。本課題組前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)gankyrin在胃癌組織中的表達(dá)陽性率顯著高于相應(yīng)癌旁非癌組織，且其陽性表達(dá)與胃癌低分化、轉(zhuǎn)移、T分期較晚以及患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，與既往研究發(fā)現(xiàn)的gankyrin在其他惡性腫瘤中的表達(dá)趨勢相一致，表明gankyrin在胃癌惡性進(jìn)展中起重要作用。腫瘤細(xì)胞的無限增殖能力是阻礙其治療的關(guān)鍵問題，深入研究其中涉及的蛋白分子對于認(rèn)識(shí)胃癌發(fā)病機(jī)制以及抗癌藥物的研發(fā)具有重要意義。因此，本研究對下調(diào)gankyrin表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

本研究應(yīng)用攜帶gankyrin siRNA的慢病毒載體下調(diào)其在人胃癌細(xì)胞株MKN28中的表達(dá)，轉(zhuǎn)染慢病毒后24 h熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染效率在90%以上，表明慢病毒作為轉(zhuǎn)染載體具有高效性。轉(zhuǎn)染慢病毒后，MKN28細(xì)胞中的gankyrin表達(dá)水平顯著降低，提示細(xì)胞建模成功。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)gankyrin表達(dá)后，MKN28細(xì)胞的體外增殖能力顯著受抑，提示gankyrin高表達(dá)是促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的重要因素，可能成為胃癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。進(jìn)一步的流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)gankyrin表達(dá)可使MKN28細(xì)胞周期阻滯于G1期，增殖能力最強(qiáng)的S期細(xì)胞比率顯著下降，證實(shí)下調(diào)gankyrin表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，與國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620中的gankyrin表達(dá)可抑制其增殖和成瘤能力相一致[2]。鑒于下調(diào)gankyrin表達(dá)可引起細(xì)胞周期G1期阻滯，本研究檢測了MKN28細(xì)胞中的細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路，結(jié)果顯示下調(diào)gankyrin表達(dá)可使β-catenin和cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，與既往研究發(fā)現(xiàn)的gankyrin在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)變化與β-catenin和cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)相符[2]，提示gankyrin可能通過β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路影響MKN28細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑，通過特異性降解目的蛋白，26S蛋白酶體幾乎參與了生物體內(nèi)絕大多數(shù)的生命活動(dòng)。gankyrin是26S蛋白酶體的調(diào)節(jié)性亞單位之一[8-9]，因此其可能通過調(diào)控多種蛋白活性，在多種生物信號(hào)通路，如細(xì)胞生長、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[10]。研究顯示蛋白酶體參與了DNA雙鏈斷裂的修復(fù)[11]，gankyrin可增強(qiáng)暴露于DNA損

*與MKN28和C-MKN28細(xì)胞比較，P<0.01

傷物質(zhì)的細(xì)胞的抗凋亡活性，而在抑癌基因p53為野生型的細(xì)胞中，下調(diào)gankyrin表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；相關(guān)機(jī)制研究表明，gankyrin能與E3泛素連接酶Mdm2結(jié)合并使之激活，從而促進(jìn)Mdm2與p53結(jié)合，增加p53的泛素化和降解，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[12]。Gankyrin尚可通過其C端LxCxE結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞周期相關(guān)抑癌蛋白R(shí)B1結(jié)合并促進(jìn)其降解，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F-1活性，激活DNA合成基因轉(zhuǎn)錄，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[7]。此外，gankyrin還可通過與26S蛋白酶體中的S6 ATP酶相互作用而與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)形成復(fù)合物，通過影響CDK4功能而調(diào)控細(xì)胞周期，參與腫瘤發(fā)生[9]。對gankyrin三維晶體結(jié)構(gòu)的研究[13]發(fā)現(xiàn)，其錨蛋白重復(fù)序列通過形成一個(gè)帶有凹槽的內(nèi)弧面結(jié)構(gòu)而與Mdm2、RB、CDK4等其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，發(fā)揮蛋白降解和細(xì)胞周期調(diào)控作用。卵巢癌相關(guān)研究[14]顯示，gankyrin可通過PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路調(diào)節(jié)cyclin D1表達(dá)，參與促進(jìn)促卵泡激素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖。而本研究發(fā)現(xiàn)gankyrin可通過β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路影響MKN28細(xì)胞周期，PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路是否亦參與了cyclin D1的調(diào)節(jié)，有待進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，將慢病毒載體攜帶的gankyrin siRNA轉(zhuǎn)染入人胃癌細(xì)胞株MKN28可下調(diào)其gankyrin表達(dá)，抑制β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路，引起細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞增殖抑制，上述發(fā)現(xiàn)為gankyrin作為胃癌靶向治療的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。Gankyrin在胃癌發(fā)生、發(fā)展中作用的復(fù)雜分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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(2015-11-23收稿；2016-04-22修回)

Down-regulation of Gankyrin Inhibits Gastric Cancer Cell Proliferation via Regulating β-Catenin/Cyclin D1 Signaling PathwayPANJie1,WANGWeimin1,CAIWeilong1,XUHongbao1,HANChunfan1,QIANFuchu2.1DepartmentofGeneralSurgery,2DepartmentofCentralLaboratory,HuzhouCentralHospital,Huzhou,ZhejiangProvince(313000)

Correspondence to: XU Hongbao, Email: 913131791@qq.com

Background: Gankyrin is an ankyrin repeat oncoprotein overexpressed and involved in the tumorigenesis and progression of various cancers. Aims: To investigate the effect and underlying mechanism of down-regulation of gankyrin expression on proliferation of gastric cancer cells. Methods: Lentivirus vector carrying gankyrin-targeted siRNA was transfected into human gastric cancer cell line MKN28. Cell proliferation, cell cycle distribution and β-catenin/cyclin D1 signaling pathway was analyzed by MTT assay, flow cytometry and Western blotting, respectively, in gankyrin-silenced MKN28 cells and control cells. Results: The transfection efficiency of lentivirus vector was more than 90%, and the protein expression of gankyrin in gankyrin siRNA transfected MKN28 cells was significantly repressed (P<0.01). Compared with cells transfected with control lentivirus and cells without transfection, MKN28 cells transfected with gankyrin siRNA showed markedly repressed cell growth after 3-day-culture; the proportion of cells in cell cycle G1 phase was significantly increased, and that in S phase was significantly decreased; down-regulated expression of β-catenin and cyclin D1 was observed (Pall <0.01). Conclusions: Down-regulation of gankyrin expression in gastric cancer cells may induce cell cycle G1 phase arrest and inhibit cell proliferation by suppressing β-catenin/cyclin D1 signaling pathway. Gankyrin might be a promising novel target for targeted therapy of gastric cancer.

Key wordsGankyrin;Stomach Neoplasms;RNA Interference;Cell Proliferation;Cell Cycle;

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.05.006

*Email: 905153254@qq.com

#本文通信作者，Email: 913131791@qq.com