iNOS抑制劑1400W對(duì)人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭衛(wèi)衛(wèi) 祝偉 鄧江華 李勇 黃新幫 鄧建鴻

iNOS抑制劑1400W對(duì)人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭衛(wèi)衛(wèi) 祝偉 鄧江華 李勇 黃新幫 鄧建鴻

目的 探討缺氧條件培養(yǎng)下誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑1400W對(duì)人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞株黏附能力的影響。方法 MTT法檢測(cè)1400W對(duì)人舌鱗狀癌細(xì)胞CAL-27黏附能力的影響。結(jié)果 細(xì)胞黏附率與對(duì)照組比較明顯下降(P＜0.05)。1400W作用于人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞后，可呈時(shí)間、劑量性依賴抑制人舌鱗癌黏附能力(P＜0.05)。結(jié)論 1400W可明顯抑制人舌鱗癌的黏附能力。1400W對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移具有預(yù)防和潛在的治療價(jià)值。

人舌鱗癌；1400W；黏附力

舌鱗癌為最常見的嚴(yán)重危害性口腔癌之一，多呈浸潤生長，常累及舌根、舌腹、舌根、咽側(cè)壁、口底等區(qū)域，頸部復(fù)發(fā)易累及Ⅰ、Ⅱ區(qū)，極罕見的情況可累及腮腺，甚至轉(zhuǎn)移至其他部位，其預(yù)后很差，疼痛潰爛嚴(yán)重影響患者吞咽言語，直至影響生命，患者后期非常痛苦[1]。與癌進(jìn)展關(guān)系密切的是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），因此抑制一氧化氮合酶的活性及作用是可行性方案[2]。本研究給予不同濃度的1400W作用相應(yīng)時(shí)間，觀察其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞黏附力的情況進(jìn)而研究抑制腫瘤的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 讓人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞株培養(yǎng)于正常濕度37℃、95%氮?dú)夂?%CO2缺氧條件下用含10%新生牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)成細(xì)胞懸液，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。預(yù)實(shí)驗(yàn)初步篩選出最佳濃度及時(shí)間（200μmol/L、90min）。

1.2 MTT法檢測(cè)1400W 對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27黏附能力的影響 實(shí)驗(yàn)組加相應(yīng)1400W濃度，對(duì)照組加等體積DMEM液。設(shè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。MTT法檢測(cè)1400W：對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27黏附能力的影響，將相應(yīng)1400W濃度作用于實(shí)驗(yàn)組，加等體積DMEM液于對(duì)照組。各組在37℃缺氧條件下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，用含10%新生牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，再將各組分別以0.1%胰蛋白酶消化，配成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，取200μL入96孔每孔培養(yǎng)板中，每孔8×103～10×103個(gè)細(xì)胞，再加用人工基膜Matrigel（用DMEM稀釋的）10μL于每孔常規(guī)培養(yǎng)，待成膠后先予紫外光消毒滅菌，每組設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)3次。4個(gè)平行孔于作用30、60、90、120min各時(shí)間點(diǎn)分別取出各組培養(yǎng)液及懸浮細(xì)胞，繼續(xù)加入無血清的DMEM200μL培養(yǎng)，取20μL MTT培養(yǎng)4h，加二甲亞砜(DMSO)200μL，震蕩2min取出進(jìn)行黏附能力的測(cè)定。在以空白孔調(diào)零，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長490nm下測(cè)定每個(gè)OD值。細(xì)胞黏附率=（處理組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）× 100%。黏附抑制率=[1-（處理組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）]×100%。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均抑制率。

1.3 觀察指標(biāo) 研究相同濃度的1400W對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞作用不同時(shí)間黏附抑制率，證明其呈作用時(shí)間依賴性能抑制腫瘤異質(zhì)性黏附能力及研究不同濃度1400W對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞作用相同時(shí)間黏附抑制率的抑制，證明其呈劑量依賴性能抑制腫瘤異質(zhì)性黏附能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 200μmol/L的1400W作用不同時(shí)間對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞抑制率的影響 200μmol/L1400W作用30、60、90、120min，各時(shí)間組人舌鱗癌CAL-27黏附抑制率與相應(yīng)對(duì)照組比較有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黏附抑制率分別為14%、19%、24%、31%，1400W可呈時(shí)間依賴性抑制人舌鱗癌黏附能力。

表1 用200μmol/L的1400W作用不同時(shí)間對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞抑制率的影響（x±s，%）

2.2 不同濃度1400W作用90min對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞胞抑制率的影響 用50、100、200、400μmol/L濃度1400W處理90min后，各濃度組舌鱗癌CAL-27黏附率與相應(yīng)對(duì)照組比較有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黏附抑制率分別為16%、20%、24%、30%，1400W可呈劑量依賴性抑制人舌鱗癌黏附能力。

表2 不同濃度1400W作用90min對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞胞抑制率的影響（x±s，%）

3 討論

細(xì)胞的黏附能力在維持細(xì)胞外形、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、運(yùn)動(dòng)等功能中起重要作用。異質(zhì)性黏附能力是腫瘤發(fā)生浸潤的始動(dòng)步驟，其黏附力的提高導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞突破基底膜這一機(jī)械屏障脫離原發(fā)灶并黏附至鄰近組織。舌癌的浸潤轉(zhuǎn)移即是一個(gè)由黏附起始的復(fù)雜的病理過程[3]：其中異質(zhì)黏附力是惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。故用MMT法檢測(cè)其黏附能力是有效的方法。研究已證明，MMP-9能加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞粘黏附力構(gòu)成瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。而iNOS與MMP-9具有高度協(xié)同作用[4-5]，其產(chǎn)生的NO可通過作用于MMP-9調(diào)節(jié)血管生成，從而影響腫瘤浸襲和轉(zhuǎn)移[6]。本研究前期研究已證實(shí)1400W對(duì)iNOS與MMP-9在舌鱗癌的表達(dá)有明顯抑制作用，可呈時(shí)間、劑量性依賴。

本研究在缺氧條件培養(yǎng)下培養(yǎng)模擬腫瘤生長的缺氧環(huán)境，對(duì)不同濃度1400W作用不同時(shí)間干預(yù)后檢測(cè)不同濃度1400w作用不同時(shí)間后黏附能力的影響，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)隨著濃度的增加和時(shí)間的延長，腫瘤黏附能力逐漸降低，即1400W對(duì)其的黏附抑制率越高，以200μmol/L抑制最為明顯。由實(shí)驗(yàn)可知1400W對(duì)舌鱗癌黏附能力，具有抑制作用。

1400W是目前為止最有效的iNOS抑制劑[7]。目前已有1400W抑制其他腫瘤組織的研究[8-11]，但1400W對(duì)舌鱗癌細(xì)胞作用及影響少見報(bào)道。本研究用不同濃度1400W作用不同時(shí)間干預(yù)舌癌細(xì)胞后用MTT法檢測(cè)代表腫瘤的黏附能力的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加和時(shí)間的延長舌鱗癌CAL-27細(xì)胞黏附力逐漸降低。提示1400W作用于人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞后，發(fā)揮抑瘤作用并且可呈時(shí)間、劑量性依賴抑制人舌鱗癌黏附能力，對(duì)舌鱗癌的黏附浸潤具有明顯阻止的影響，為1400W應(yīng)用于臨床控制舌癌的進(jìn)展提供了新的思路。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.28.013

市科技局立項(xiàng)編號(hào)（GZ2014ZSF229）

江西 341000 贛州市人民醫(yī)院口腔頜面外科 （何海蕾 王羽李勇 黃新幫 鄧建鴻） 贛州市人民醫(yī)院腫瘤科 （郭小青 彭衛(wèi)衛(wèi) 鄧江華）贛州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室（祝偉）