一氧化氮信號在脫落酸誘導丹參酚酸類成分積累中的作用

沈麗紅，任加惠，金雯芳，王瑞杰，倪春紅，童夢姣，梁宗鎖,2，楊東風,2 浙江理工大學 生命科學學院，浙江　杭州　30082 浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，浙江　杭州　3008

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一氧化氮信號在脫落酸誘導丹參酚酸類成分積累中的作用

沈麗紅1，任加惠1，金雯芳1，王瑞杰1，倪春紅1，童夢姣1，梁宗鎖1,2，楊東風1,2
1 浙江理工大學 生命科學學院，浙江杭州310018
2 浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，浙江杭州310018

沈麗紅, 任加惠, 金雯芳, 等. 一氧化氮信號在脫落酸誘導丹參酚酸類成分積累中的作用. 生物工程學報, 2016, 32(2): 222–230.

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摘 要:為探討一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 信號在脫落酸 (Abscisic acid，ABA) 誘導丹參酚酸類成分積累中的作用，采用不同濃度一氧化氮外源供體硝普鈉 (Sodium nitroprusside，SNP) 處理丹參毛狀根，6 d后采收，測定酚酸類成分含量；ABA聯(lián)合一氧化氮清除劑 (2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，c-PTIO) 或一氧化氮合酶抑制劑 (NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME) 對丹參毛狀根進行處理，測定酚酸類成分含量和關(guān)鍵基因表達量。結(jié)果表明，100 μmol/L SNP對丹參毛狀根中迷迭香酸與丹酚酸B積累的誘導效果最顯著，迷迭香酸和丹酚酸B含量分別增加了3倍和4倍。ABA處理能顯著促進PAL (Phenylalanine ammonia lyase)、TAT (Tyrosine aminotransferase) 和RAS (Rosmarinic acid synthase) 基因的表達，促進丹參毛狀根中酚酸類成分的積累，而聯(lián)合c-PTIO或L-NAME共同處理后，3種關(guān)鍵基因表達下調(diào)，并顯著抑制了酚酸類成分的積累。研究證明NO和ABA均能夠促進丹酚酸類成分的積累，NO信號可能介導了ABA對丹酚酸生物合成的誘導作用。

關(guān)鍵詞:丹參，一氧化氮，脫落酸，酚酸

Received: June 12, 2015; Accepted: September 22, 2015

Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LQ13C020003), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81373908, 81403033).

浙江省自然科學基金 (No. LQ13C020003)，國家自然科學基金 (Nos. 81373908, 81403033) 資助。

網(wǎng)絡出版時間：2015-10-21 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151021.1033.002.html

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根莖，因其色紅且形狀似參而得名“丹參”，是一種主治心血管系統(tǒng)疾病的常用中藥。丹參有效成分主要包括兩大類：水溶性化合物 (咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B 等) 和脂溶性化合物 (丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等)[1]。丹酚酸B和迷迭香酸是丹參的主要水溶性活性成分，丹酚酸B有抗肝纖維化、抑制血小板聚集、抗血栓形成等活性[2-3]，迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性[4]。

植物體內(nèi)丹酚酸的生物合成主要來源于酪氨酸途徑和苯丙氨酸途徑：苯丙氨酸途徑以苯丙氨酸為底物，在苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 作用下脫氨基生成反式肉桂酸，苯丙氨酸解氨酶是該途徑的限速酶；酪氨酸途徑以酪氨酸為起始，經(jīng)酪氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 (TAT) 的氧化脫氨和羥基苯丙酮酸還原酶 (HPPR) 的還原作用下生成4-羥基苯乳酸。4-香豆酰輔酶A與4-羥基苯乳酸在迷迭香酸合成酶 (RAS) 和細胞色素P450蛋白作用下生成迷迭香酸[5]。PAL、TAT、RAS的表達與迷迭香酸、丹酚酸B的積累呈正相關(guān)。近年來，丹參毛狀根已經(jīng)廣泛應用于丹參次生代謝的研究[6]，許多誘導子都能夠促進丹參次生代謝產(chǎn)物的積累。我們前期研究發(fā)現(xiàn)外源脫落酸 (Abscisic acid，ABA) 和一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 均能夠促進丹參毛狀根中丹參酮的積累[7]，NO信號則介導了ABA對丹參酮的誘導作用。ABA也能夠顯著促進丹參毛狀根中酚酸類成分的積累[8]，然而，NO對丹酚酸積累的調(diào)控作用及其在ABA誘導丹酚酸積累中的作用尚未有研究報道。硝普鈉 (Sodium nitroprusside，SNP) 是一種NO供體，c-PTIO (2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3 -oxide) 為NO清除劑[9]，L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester) 為NO合成抑制劑[10-11]。本研究將以丹參毛狀根為材料，首先研究SNP對丹酚酸積累的影響，進而采用c-PTIO清除內(nèi)源NO，L-NAME抑制NO積累，分析NO信號在ABA誘導丹酚酸積累中的作用。研究結(jié)果對于揭示環(huán)境促進丹參有效成分積累的形成機制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1誘導子與抑制劑的制備

脫落酸 (ABA) (Wolsen，中國)、硝普鈉(SNP)、L-NAME (Sigma，美國) 和c-PTIO (Amresco，美國) 分別溶于蒸餾水中，過0.22 μm濾膜，制成母液備用。硝普鈉需避光保存。

1.2毛狀根培養(yǎng)及處理

以本實驗室丹參毛狀根為材料 (由發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834 誘導所得)，基本培養(yǎng)基為含有30 g/L蔗糖的6,7-V培養(yǎng)基。取0.2 g新鮮的丹參毛狀根接種于含有50 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床中，110 r/min，25 ℃黑暗培養(yǎng)。

硝普鈉濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L加入培養(yǎng)18 d后的毛狀根培養(yǎng)基中，c-PTIO (100 μmol/L) 和L-NAME (200 μmol/L)分別與ABA (50 μmol/L) 同時加入培養(yǎng)18 d后的毛狀根培養(yǎng)基中，以研究它們對酚酸類有效成分積累的影響。處理后第6 天采收丹參毛狀根，濾紙吸干，50 ℃干燥至恒重。

1.3酚酸類有效成分的提取與HPLC定量分析

丹參毛狀根中酚酸類有效成分的提?。焊稍锩珷罡欣徶心ニ椋^0.45 mm篩，精密稱取0.10 g，加入2 mL甲醇提取液，超聲提取45 min，提取液10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

丹酚酸B和迷迭香酸標準品購自中國食品藥品鑒定所，精密稱取標準品適量，以甲醇溶解，備用。分別精密吸取不同體積的丹酚酸B和迷迭香酸對照品儲備液，用甲醇稀釋配成系列對照品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積積分值，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，得到丹酚酸B和迷迭香酸線性回歸方程分別為：

丹酚酸B：Y=1.3E+7X+3.0E+5，R2=0.9997；

迷迭香酸：Y=3.3E+7X–2.4E+5，R2=0.9860。

含量測定采用Waters 1525二元高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器進行檢測，色譜柱為Waters SunFire C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，數(shù)據(jù)采集軟件為Empower 2。色譜條件為：流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，上樣體積20 μL。檢測波長270 nm，流動相乙腈和水，梯度洗脫。梯度程序：t = 0 min，40%乙腈；t = 5 min，60%乙腈；t = 20 min，60%乙腈；t = 23 min，80%乙腈；t = 25 min，100%乙腈。

1.4RNA分離、cDNA合成及熒光實時定量分析

丹參毛狀根處理24 d后采收，在液氮中研磨成粉末，總RNA采用Trizol法提取。采用PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa，Tokyo，日本) 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。熒光RT-PCR分析采用Brilliant Ⅱ SYBR?Green QPCR Master Mix試劑盒 (Agilent，Santa Clara，美國)。反應體積為10 μL，包括5.2 μL Brilliant ⅡSYBR?Green QPCR Master Mix, 0.4 μL 10 μmol/L 上游引物，0.4 μL 10 μmol/L 下游引物，1.0 μL cDNA 模板和 3.0 μL無菌超純水。反應程序為：95 ℃30 s ；95 ℃15 s ，58 ℃30 min，40個循環(huán)。實驗3個重復，測定18S、PAL、TAT及RAS的基因表達量。以18S作為內(nèi)參基因，進行綜合分析，采用比較Ct法計算不同處理后的目的基因表達水平。計算公式為目的基因的量=2－DD Ct，△△Ct=(Ct，目的基因–Ct，內(nèi)參基因) 實驗組–(Ct，目的基因–Ct，內(nèi)參基因)對照組。顯著性差異分析采用DPS軟件，在5%顯著水平進行統(tǒng)計分析，不同字母 (a、b、c等) 表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

圖1　SNP、ABA、c-PTIO和L-NAME對丹參毛狀根生長狀況的影響Fig. 1 Effects of SNP and ABA, c-PTIO, L-NAME on the growth of S. miltiorrhiza hairy roots. Different letters (such as a, b, c) indicate significant difference at P ≤ 0.05 using Duncan’s multiple-range test.

2　結(jié)果與分析

2.1硝普鈉對丹參毛狀根生長的影響

首先采用不同濃度的硝普鈉處理丹參毛狀根，研究毛狀根生長的變化。結(jié)果如圖1所示，50 μmol/L和100 μmol/L的硝普鈉對丹參毛狀根的生長影響不顯著，而高濃度 (200 μmol/L) 以及低濃度 (25 μmol/L)，對丹參毛狀根生長略有抑制，干重分別降低了14%和16%，但抑制作用不顯著。ABA處理對丹參毛狀根的生長略有促進，干重達到0.333 g，較對照組增加了14%。ABA與c-PTIO或L-NAME聯(lián)合誘導，均使毛狀根的干重略有增加，分別為0.324 g和0.354 g，較對照組提高了11%和21%。c-PTIO或L-NAME單獨誘導對丹參毛狀根生長的影響不顯著。

2.2硝普鈉對丹酚酸類成分積累的影響

采用不同濃度硝普鈉處理丹參毛狀根后，其迷迭香酸與丹酚酸B的含量如圖2所示。50 μmol/L和200 μmol/L硝普鈉處理對迷迭香酸積累沒有影響。而對于丹酚酸B，4種濃度硝普鈉均能使其含量有不同程度的增加。其中以100 μmol/L硝普鈉處理對迷迭香酸與丹酚酸B積累的誘導效果最為顯著，迷迭香酸含量達到3.181 mg/g，較對照提高了3倍，丹酚酸B的含量達到11.171 mg/g，較對照提高了4倍。研究結(jié)果表明，NO供體硝普鈉能夠促進丹參酚酸類成分的積累，但具有濃度依賴性。

2.3c-PTIO和L-NAME對ABA誘導丹酚酸類成分積累的影響

如圖3所示，ABA處理能夠顯著促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B的積累，含量分別達到7.5 mg/g和20.5 mg/g，分別較對照組增加45%和40%，這與我們以前的研究結(jié)果一致。c-PTIO和L-NAME單獨誘導對酚酸類成分積累影響不大，但當與ABA聯(lián)合處理時則能夠顯著抑制ABA對丹酚酸的誘導作用。其中ABA+c-PTIO處理，迷迭香酸和丹酚酸B的含量降為5.3 mg/g和16.6 mg/g，較ABA單獨誘導分別降低了31%和27%；ABA+L-NAME處理時，兩者含量為4.6 mg/g和14.2 mg/g，較ABA單獨誘導分別降低40%和38%。結(jié)果表明c-PTIO和L-NAME處理能夠顯著抑制ABA誘導丹酚酸類成分的積累，這說明NO信號很可能參與了ABA誘導酚酸類成分的積累。

圖2　SNP對丹參毛狀根中酚酸類成分積累的影響Fig. 2 Effects of SNP on the accumulation of phenolic acids in S. miltiorrhiza hairy roots. Different letters (such as a, b, c) indicate significant difference at P ≤ 0.05 using Duncan’s multiple-range test.

圖3　ABA及c-PTIO、L-NAME對丹參毛狀根中酚酸積累的影響Fig. 3 Effects of ABA, c-PTIO and L-NAME on the accumulation of phenolic acids in S. miltiorrhiza hairy roots. Different letters (such as a, b, c) indicate significant difference at P ≤ 0.05 using Duncan’s multiple-range test.

2.4c-PTIO和L-NAME對丹酚酸合成關(guān)鍵基因表達的影響

苯丙氨酸氨裂解酶 (PAL)、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (TAT) 和迷迭香酸合酶 (RAS) 是丹參中酚酸類成分生物合成的3種關(guān)鍵酶。為揭示ABA對丹酚酸類成分生物合成的誘導機制，我們研究了ABA對丹參毛狀根中PAL、TAT和RAS基因表達的影響。如圖4所示，ABA處理后，PAL、TAT和RAS 3種基因表達顯著提高，分別較對照組提升了6倍、4倍和4倍。單獨使用c-PTIO或L-NAME處理后的丹參毛狀根中3種關(guān)鍵基因表達與對照組相差不大。但當ABA與c-PTIO聯(lián)合誘導時，較單獨使用ABA誘導，PAL、TAT和RAS基因表達分別降低了97%、48% 和79%；ABA與L-NAME聯(lián)合誘導時，分別降低了72%、78%和63%。這說明，NO清除劑c-PTIO和NO合成抑制劑L-NAME均能夠顯著抑制ABA對丹酚酸類成分合成關(guān)鍵基因表達的上調(diào)作用，這進一步證明，NO信號很可能介導了ABA誘導的丹參酮的積累。

圖4　c-PTIO和L-NAME對丹參毛狀根中丹酚酸合成關(guān)鍵基因表達量的影響Fig. 4 Effects of c-PTIO and L-NAME on the key gene expressions in S. miltiorrhiza hairy roots. Different letters (such as a, b, c) indicate significant difference at P ≤ 0.05 using Duncan’s multiple-range test.

3　討論

植物次生代謝產(chǎn)物是植物與環(huán)境相互作用的產(chǎn)物[12]，在植物與環(huán)境的相互作用中起著非常重要的作用[13]。很多環(huán)境脅迫都能誘導次生代謝產(chǎn)物的積累[14]，揭示環(huán)境誘導次生代謝產(chǎn)物積累的作用機制，有利于提高次生代謝產(chǎn)物含量。一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 和脫落酸(Abscisic acid，ABA) 是重要的逆境響應信號分子，NO在各種生物脅迫和非生物脅迫中的信號轉(zhuǎn)導作用已被廣泛證實，如干旱和熱脅迫等[15]，外源 NO 能明顯緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗生長及光合作用的抑制[16]。已有研究表明，NO能夠誘導植物次生代謝產(chǎn)物的積累，NO供體硝普鈉能夠顯著誘導銀杏愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的積累[17]，促進長春花和金絲桃等植物的懸浮培養(yǎng)細胞中次生代謝產(chǎn)物的積累，調(diào)節(jié)姜黃生長，并促進其次生代謝產(chǎn)物的積累[18]。在紅豆杉細胞培養(yǎng)物中，NO信號也介導了超聲和腦苷脂類所誘導的紫杉醇的積累[19]。ABA由于在水分脅迫下能夠快速積累而被認為是脅迫性植物激素，它在調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和耐受性中起著重要作用[20]。已有研究表明ABA能夠誘導植物萜類和花青素等次生代謝產(chǎn)物的積累[21-23]。我們前期研究表明ABA能夠促進丹參毛狀根中丹酚酸和丹參酮的積累[24]，NO供體硝普鈉也能促進丹參酮的積累[7]。本研究采用ABA和外源NO供體硝普鈉處理丹參毛狀根，進一步證實ABA能夠顯著促進丹酚酸的積累，同時發(fā)現(xiàn)SNP也能夠促進丹酚酸的合成，其中以100 μmol/L SNP處理效果最為顯著。

有關(guān)NO與ABA相互作用的研究也越來越多作為兩種重要的信號分子，ABA和NO相互作用的研究已經(jīng)成為當前研究熱點之一。越來越多的證據(jù)表明，NO和ABA信號有關(guān)。在保衛(wèi)細胞中，NO信號也與ABA誘導的氣孔關(guān)閉有關(guān)[25]。也有證據(jù)表明，ABA能夠增強保衛(wèi)細胞中NO的合成，相反NO也能夠促進ABA的積累[26-27]。在長春花細胞中，ABA和NO均參與長春堿的合成[28]。我們前期研究表明ABA能夠誘導丹參毛狀根中丹參酮類成分和內(nèi)源NO的積累，NO清除劑 (c-PTIO) 和NO合酶抑制劑 (L-NAME) 顯著抑制了ABA的誘導作用，證明NO信號在ABA誘導丹參酮的積累中起著重要作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)ABA能夠顯著促進丹參毛狀根中迷迭香酸和丹酚酸B的積累，同時對丹酚酸合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 (TAT) 和迷迭香酸合成酶(RAS) 的基因表達具有顯著上調(diào)作用。為了進一步揭示NO在ABA誘導丹酚酸積累中的作用，我們分別采用c-PTIO和L-NAME與ABA聯(lián)合處理丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)c-PTIO和L-NAME均能夠顯著抑制ABA對丹酚酸以及PAL、TAT 和RAS基因表達的誘導作用。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)ABA能夠促進內(nèi)源NO的積累，c-PTIO和L-NAME也能夠抑制ABA對內(nèi)源NO積累的誘導作用[29]。這進一步表明，NO信號在ABA誘導丹酚酸積累中起著重要作用，ABA很可能通過NO信號通路誘導了丹酚酸類成分的生物合成。本研究結(jié)果對于揭示環(huán)境促進丹參有效成分積累的形成機制具有重要意義。

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(本文責編陳宏宇)

生物技術(shù)與方法

Role of NO signal in ABA-induced phenolic acids accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy roots

Lihong Shen1, Jiahui Ren1, Wenfang Jin1, Ruijie Wang1, Chunhong Ni1, Mengjiao Tong1, Zongsuo Liang1,2, and Dongfeng Yang1,2
1 School of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China
2 Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation of Zhejiang Province, Hangzhou 310018, Zhejiang, China

Abstract:To investigate roles of nitric oxide (NO) signal in accumulations of phenolic acids in abscisic acid (ABA)-induced Salvia miltiorrhiza hairy roots, S. miltiorrhiza hairy roots were treated with different concentrations of sodium nitroprusside (SNP)-an exogenous NO donor, for 6 days, and contents of phenolic acids in the hairy roots are determined. Then with treatment of ABA and NO scavenger (2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide, c-PTIO) or NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME), contents of phenolic acids and expression levels of three key genes involved in phenolic acids biosynthesis were detected. Phenolic acids production in S. miltiorrhiza hairy roots was most significantly improved by 100 μmoL/L SNP. Contents of RA and salvianolic acid B increased by 3 and 4 folds. ABA significantly improved transcript levels of PAL (phenylalanine ammonia lyase), TAT (tyrosine aminotransferase) and RAS (rosmarinic acid synthase), and increased phenolic acids accumulations. However, with treatments of ABA+c-PTIO or ABA+L-NAME, accumulations of phenolic acids and expression levels of the three key genes were significantly inhibited. Both NO and ABA can increase accumulations of phenolic acids in S. miltiorrhiza hairy roots. NO signal probably mediates the ABA-induced phenolic acids production.

Keywords:Salvia miltiorrhiza, nitric oxide, abscisic acid, phenolic acids

Corresponding authors: Zongsuo Liang. Tel/ Fax: +86-571-86843301; E-mail: liangzs@ms.iswc.ac.cn Dongfeng Yang. Tel/Fax: +86-571-86843301; E-mail: ydf807@sina.com