雞大腸桿菌寬譜噬菌體的分離及裂解性研究

張曉冬，李　冰，汲　晨，盧　赫，馮方周（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

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雞大腸桿菌寬譜噬菌體的分離及裂解性研究

張曉冬，李冰，汲晨，盧赫，馮方周
（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

摘要：為了解雞寬譜大腸桿菌噬菌體的裂解特性，本試驗(yàn)以30株大腸桿菌為宿主菌，從8份糞便中成功分離出5個(gè)噬菌體，并從中篩選出1個(gè)強(qiáng)裂解性寬譜大腸桿菌噬菌體，命名為Z-SN5，寬噬率為70%，熱穩(wěn)定性相對(duì)良好，60℃作用1 h，尚有活性；耐堿性強(qiáng)于耐酸性，在pH值=7時(shí)活性最高，經(jīng)PCR鑒定后，成功擴(kuò)增出目的基因片段。本試驗(yàn)為今后研究噬菌體治療雞大腸桿菌病奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞；大腸桿菌；寬譜噬菌體；裂解性

雞大腸桿菌病是由埃希大腸桿菌引起的一種常見性疾病，不同年齡的雞均可感染，嚴(yán)重危害畜禽及人類健康，每年由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計(jì)。長(zhǎng)期以來(lái)，此病的常規(guī)治療方法是使用各種抗生素，由于長(zhǎng)期大劑量的盲目用藥，使其產(chǎn)生了一定的耐藥性，導(dǎo)致抗生素對(duì)此病的治療效果減弱，因此尋找一種新型的治療方式勢(shì)在必行。噬菌體是一種細(xì)菌病毒，分為溶原性和強(qiáng)裂解型，溶原性噬菌體又被稱為溫和型噬菌體，其基因組能與宿主菌基因組相整合，隨細(xì)菌分裂傳至子代細(xì)菌的基因組中，不引起細(xì)菌裂解［1］。相反，強(qiáng)裂解型噬菌體可以裂解細(xì)菌，且具有高度的特異性，可以殺滅特定的菌型，在整個(gè)細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮作用。噬菌體制劑作為一種新興的治療用品，以其能減輕由于用藥所導(dǎo)致的菌群失調(diào)、減少耐藥性問題等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注［2］。本試驗(yàn)從雞糞中分離純化出強(qiáng)裂解性寬噬菌譜的噬菌體，初步了解了其理化特性，為今后研究噬菌體治療雞大腸桿菌病奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株30種血清型已鑒定的大腸桿菌：O2：SK1、SK10、P2、SN2、SN4；O8:SK1、SK7、P1、P5、SN1；O15：SK2、SK3、P8、P12、P13、SN5；O35：P3、P4、P10；O78：SK5、SK6、P6、P7、P15、SN3；O113：SK9、P9、P11；O157：SK8、P14。均由遼寧省畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。

1.2樣品采自遼寧省內(nèi)遼中、葫蘆島、鐵嶺、營(yíng)口、錦州等不同雞場(chǎng)的8份糞便樣品，其中遼中蛋雞糞便1份，鐵嶺肉雞糞便1份，營(yíng)口肉雞糞便1份，葫蘆島肉雞蛋雞糞便各1份，錦州肉雞糞便1份，蛋雞糞便兩份。

1.3試劑液體LB培養(yǎng)基、2×LB培養(yǎng)液、固體LB培養(yǎng)基、半固體LB培養(yǎng)基、SM液［6］（NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，1MTris·Cl（pH值=7.5）50 mL，2%明膠溶液（m/V）5 mL，加水至1 000 mL，121℃20 min）按常規(guī)方法配制、0.22 μm微孔濾膜、病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；Taq 2xMix購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4方法

1.4.1菌懸液制備將30株大腸桿菌復(fù)蘇后，液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h后接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，用少量無(wú)菌生理鹽水沖洗菌苔，制成菌懸液備用。

1.4.2裂解液的制備取糞便樣品30 g，加入適量的生理鹽水與氯仿，充分?jǐn)噭?，粗濾至離心管，5 000 r/min離心30 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到初濾液，取適量初濾液等體積加入2倍LB培養(yǎng)液及少量宿主菌，37℃，60 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到原液，做無(wú)菌檢測(cè)。

1.4.3確證試驗(yàn)取裂解液采用斑點(diǎn)法［3］進(jìn)行確證試驗(yàn)。若在滴加濾液處形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明噬菌斑，便可證明濾液中含有大腸桿菌噬菌體。

1.4.4噬菌體的純化、增值取單個(gè)噬菌斑，碾碎，置于盛有1 mL SM液的無(wú)菌EP管中，37℃水浴10 min，離心過(guò)濾，采用雙層平板法純化噬菌體，反復(fù)多次，得到形狀和大小一致的噬菌斑即為純化的噬菌體。

1.4.5寬譜噬菌體的篩選及其裂解譜的確定采用單斑法測(cè)定噬菌體，即取30種菌懸液分別各自均勻涂布于普通瓊脂平板上，室溫放置2 min，取5 μL噬菌體懸液滴于平板上，每個(gè)平板上各滴加4點(diǎn)，37℃培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

1.4.6寬譜噬菌體的熱穩(wěn)定性的測(cè)定各取200 μL噬菌體純培養(yǎng)液分裝于無(wú)菌EP管中，分別于30℃、40℃、50℃、60℃水浴中作用30 min和60 min，待作用結(jié)束后取出EP管，立即置于冰水中冷卻，經(jīng)稀釋后采用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。重復(fù)3次。

1.4.7寬譜噬菌體對(duì)pH值敏感性的測(cè)定取8個(gè)無(wú)菌EP管分別加入不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、 10）的LB培養(yǎng)基500 μL，然后加入80 μL噬菌體純培養(yǎng)液（4.3×109PFU/mL），恒溫作用12 h。待作用時(shí)間結(jié)束，將樣品做適當(dāng)稀釋后采用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。重復(fù)3次。

1.5寬譜噬菌體的PCR鑒定

1.5.1引物設(shè)計(jì)與合成參照代保英［4］。

gene 23上游引物：5′-TGTTATIGGTATGGTICGICGTGCTAT-3′；下游引物：5′-TGA AGTTACCTTCACCACGACCGG-3′，其擴(kuò)增產(chǎn)物為850 bp。

gene 18上游引物：5′- GGTAAATTCCAATGGGGTCCAGCTT-3′；下游引物：5′-TATCAGCAGCCAACGGAACCCAA-3′，其擴(kuò)增產(chǎn)物為1 330 bp。

1.5.2噬菌體基因組的提取按照病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書提取噬菌體基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 PCR擴(kuò)增PCR總反應(yīng)體系為30 μL，其中包括2×Taq Master Mix15 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板3 μL，RNase-Free Water 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min，隨后，94℃變性30 s，57.5℃退火30 s，最后72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

圖1　噬菌體Z- SN5

2　結(jié)果

2.1噬菌體的分離從8個(gè)糞樣中分離出噬菌體5個(gè)，命名編號(hào)為Z-SN1，Z-SN2，Z-SN3，Z-SN4以及Z-SN5，均可使30株大腸桿菌產(chǎn)生大小不同的噬菌斑，其他3個(gè)糞樣未分離出噬菌體。

2.2噬菌斑的形態(tài)糞便中分離得到的5個(gè)噬菌體，采用雙層法進(jìn)行裂解試驗(yàn)均能得到大小基本一致、形狀均勻的單個(gè)噬菌斑，直徑范圍為0.80～2.52 mm。Z-SN2的最小，Z-SN5的最大（圖1）。

2.3噬菌體Z-SN5裂解譜的測(cè)定利用分離得到的Z-SN5對(duì)30株大腸桿菌進(jìn)行裂解試驗(yàn)，寬噬率為70%，完全裂解率為27%（見表1）。

表1　噬菌體Z- SN5裂解譜的測(cè)定

2.4噬菌體Z-SN5對(duì)熱穩(wěn)定性的測(cè)定隨著溫度的升高，噬菌體Z-SN5的活性下降（見表2）。

表2　噬菌體對(duì)熱穩(wěn)定性的測(cè)定

2.5噬菌體Z-SN5對(duì)pH值敏感性的測(cè)定噬菌體Z-SN5對(duì)堿性環(huán)境的耐受性高于酸性環(huán)境，初始噬菌體個(gè)數(shù)為4.3×109，作用2 h后效價(jià)如下，在pH值=7時(shí)活性最強(qiáng)（表3）。

表3　噬菌體對(duì)pH值敏感性的測(cè)定

2.6噬菌體基因擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約900 bp，1 300 bp與預(yù)期片段大小相符（見圖2）。

3　討論

噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，不同于抗生素，可以直接作用于細(xì)菌內(nèi)部［5-6］，進(jìn)而對(duì)治療耐藥性大腸桿菌病的效果遠(yuǎn)高于抗生素，根據(jù)其對(duì)宿主菌裂解性的不同分為溫和型噬菌體和烈性噬菌體，烈性噬菌體感染細(xì)胞后可立即在宿主細(xì)胞內(nèi)開始自身的生命循環(huán)，引起細(xì)菌細(xì)胞的裂解，可以在固體培養(yǎng)基上形成肉眼可見的空斑［7］本試驗(yàn)應(yīng)用30株不同的大腸桿菌作為宿主菌，從8份糞便中共提取出5個(gè)噬菌體，提取率為62.5%，提示本試驗(yàn)中涉及的雞場(chǎng)中普遍有噬菌體的存在，也提示出噬菌體廣泛存在于自然界中，相對(duì)于抗生素有著易于獲取等優(yōu)勢(shì)。試驗(yàn)中Z-SN5可以裂解大多數(shù)菌株，由此可見該噬菌體為寬譜性，強(qiáng)裂解性噬菌體，具有用于臨床治療雞大腸桿菌病的潛力。

吸附是噬菌體侵染的第一步，吸附率的高低會(huì)直接影響噬菌體侵染宿主菌的多少，溫度和pH值是影響噬菌體吸附率的主要因素，溫度高于或低于最適生長(zhǎng)溫度都會(huì)使吸附率降低，pH值的改變會(huì)影響噬菌體及其宿主菌表面的電荷及空間構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響噬菌體的吸附［8］。由于噬菌體本身的特性，不同的噬菌體的熱穩(wěn)定性是不同的，本試驗(yàn)應(yīng)用的噬菌體Z-SN5在30℃和40℃活性相對(duì)較高，在60℃作用1 h后活性明顯下降，伴隨著pH值逐漸升高噬菌體Z-SN5的活性增強(qiáng)，在pH值=7時(shí)活性最高，隨即活性下降。其活性適應(yīng)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境，這也為其應(yīng)用于噬菌體治療提供了一些前提條件。

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圖2　噬菌體PCR擴(kuò)增結(jié)果M：Marker；1：引物gene23；2：引物gene18；3：陰性對(duì)照；4：陰性對(duì)照

The Study on Isolation and Lysis of Wide Spectum Phageof Chicken Escherichiacoli

ZHANG Xiao-dong，LI Bing，JI Chen，LU He，F(xiàn)ENG Fang-zhou
（Liaoning Madical University College of Animal Husbandry and Veterinary，Jinzhou 121001，China）

Abstract：In order to learn about the cleavage characters of the broad spectrum colibacteriophage of chickens，we chose 30 strains of E.coli as the host bacteria and successfully extract five strains of bacteriophages from the 8 groups of faeces in this experiment.Then，a strong broad spectrum colibacteriophage was selected from bacteriophages and named Z-SN5.Its broad phagocytic rate was 70%，and the thermostability was quite well.It was still active after reaction at 60℃for 1 h.Its alkali resistance was better than its acid resistance，and the activity was highest when the PH was 7.After Identification with PCR many target gene segmentscould be amplified.This study lays a foundation for studying how to cure colon bacillus diseases by bacteriophage in future.

Key words：Chicken；Escherichia coli；Phage Corresponding author：FENG Fang-zhou

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0038- 03

收稿日期：2015-11-12

基金項(xiàng)目：2014年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201401-160024）；遼寧省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2013301003）

作者簡(jiǎn)介：張曉冬（1994-），男，本科生，就讀于動(dòng)植物檢疫專業(yè)，E-mail：18341653421@163.com

通訊作者：馮方周，E-mail：fengfangzhou@126.com