陳骨和燒骨DNA提取的法醫(yī)學(xué)鑒定探討

汪鳳桐 張 卓 魏 然 薛 晶 張振輝 索利婭

1.北京匯正卓越科技有限公司司法鑒定中心，北京 102488；2.齊齊哈爾市公安局刑事技術(shù)支隊(duì)，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.北京中一諾達(dá)科技有限公司司法鑒定中心，北京 100015；4.北京華大方瑞鑒定技術(shù)有限公司司法鑒定中心，北京 101300；5.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

骨是由骨組織、骨膜和骨髓等構(gòu)成的堅(jiān)硬器官，在機(jī)體中主要起支持、運(yùn)動(dòng)和保護(hù)作用，骨中含有大量鈣、磷等礦物質(zhì)。骨組織是骨骼的主體結(jié)構(gòu)，包括骨組織細(xì)胞和骨基質(zhì)。骨基質(zhì)是指鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)，包括有機(jī)成分和無(wú)機(jī)成分。骨組織細(xì)胞包括成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)主要是由膠原和羥基磷灰石構(gòu)成。骨中30%是由骨細(xì)胞分泌的膠原，65%～75%則是骨骼的支撐結(jié)構(gòu)羥基灰石。骨組織中骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨骼DNA 的主要來(lái)源。

由于骨骼組織堅(jiān)硬，具有良好的抗腐敗、侵蝕、灼燒等功能，是生物個(gè)體組織中降解緩慢、抗污染力強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，能夠較好保護(hù)生物個(gè)體的DNA，即使其他軟組織被完全腐敗、碳化，在骨骼組織中仍可提取DNA 檢材。

提供骨骼中DNA 并進(jìn)行生物信息檢測(cè)和比對(duì)研究，在當(dāng)今考古、法庭科學(xué)領(lǐng)域中是一項(xiàng)重要的技術(shù)手段。在軟組織不具有提取DNA 價(jià)值時(shí)，可以考慮在骨中提取DNA。法庭科學(xué)鑒定工作中，除了在腐敗尸體中提取骨DNA，還包括在陳骨和燒骨中提取DNA。然而同樣由于骨骼抗腐敗、侵蝕的原因，相較于其他組織，骨骼的酶解消化、DNA 提取和純化難度也隨之增大。筆者通過(guò)在法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域的工作和學(xué)習(xí)，分享了關(guān)于陳骨和燒骨DNA 的提取、測(cè)序要點(diǎn)等檢驗(yàn)鑒定內(nèi)容，以期為廣大鑒定同仁、法律界人士提供參考。

一、陳骨與燒骨

（一）陳骨

對(duì)于陳骨的定義，目前尚無(wú)權(quán)威的解釋?zhuān)饕侵改甏眠h(yuǎn)的骨骼，包括掩埋多年的尸體、古代尸體、木乃伊，甚至骨化石等。對(duì)于古代尸體等陳骨的研究，主要是考古界等為了進(jìn)行種群溯源或族屬分類(lèi)，如萬(wàn)誠(chéng)等人［1］通過(guò)對(duì)陳骨的DNA提取和測(cè)序，獲取了大量古人的遺傳信息，這些DNA 信息為骨樣所屬時(shí)代和與之有關(guān)族屬的遷徙和發(fā)展，提供了豐富的研究資料。

法庭科學(xué)鑒定工作中，對(duì)陳骨DNA 的研究主要是為了進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。由于案發(fā)時(shí)間距離發(fā)現(xiàn)尸體的時(shí)間較遠(yuǎn)，尸體因環(huán)境因素腐敗、白骨化，甚至骨骼被侵蝕、風(fēng)化，難以辨識(shí)陳骨的個(gè)體信息，給案件偵破活動(dòng)帶來(lái)困難。通過(guò)對(duì)陳骨中DNA 的提取和檢驗(yàn)，可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。當(dāng)然，也可通過(guò)對(duì)陳骨中DNA 的提取和檢驗(yàn)，進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，李成濤等人［2］曾報(bào)道了一起陳骨且骨骼已風(fēng)化的案件，通過(guò)對(duì)陳骨與案件中可疑父母進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，雖然檢出的基因位點(diǎn)較少，但仍推斷出了骨樣本身源者的性別，并推斷不排除骨樣與疑母存在親緣關(guān)系，為偵查提供了方向。

（二）燒骨

在法庭科學(xué)鑒定工作中，燒骨通常是指人體中骨骼與其他組織在火災(zāi)、爆炸、焚尸等案件中，被焚燒后，殘留的燒焦尸骨或殘骨碎片。骨骼加熱到300℃以上時(shí)，開(kāi)始因?yàn)樽茻霈F(xiàn)長(zhǎng)軸方向裂隙，隨著溫度的升高，骨骼內(nèi)的有機(jī)物變性、喪失，骨骼的顏色開(kāi)始由黃色向褐色、深褐色、黑色、灰白色、白色依次逐漸變化，骨骼的脆性也隨之增加。燒骨可以導(dǎo)致有機(jī)物變性、碳化，焚燒嚴(yán)重者可使有機(jī)物丟失、灰化，骨組織的DNA 檢出率也隨骨骼的被焚燒程度變化，焚燒程度越高的，骨DNA 的檢出率也隨之降低。

二、骨中DNA 的提取

對(duì)骨DNA 的提取，無(wú)論何種方法都應(yīng)當(dāng)避免污染，實(shí)驗(yàn)室在收到骨檢材后，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室工作管理要求進(jìn)行必要的登記和妥善保存。骨DNA 提取前，首先應(yīng)將骨樣洗凈晾干，而后進(jìn)行紫外線照射，再以鋸、鉆、刮等方式取得骨屑或骨粉。與其他組織DNA 的提取一樣，骨DNA 的提取同樣遵循三個(gè)步驟，即第一，對(duì)材料進(jìn)行細(xì)胞裂解，使其釋放DNA 分子；第二，細(xì)胞裂解后，將DNA分子與其他細(xì)胞物質(zhì)分離；第三，將DNA 提純，并制備成可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR）擴(kuò)增等應(yīng)用形式的樣本。提取過(guò)程應(yīng)防止樣本之間、樣本與外源物質(zhì)之間的污染。

目前較為成熟的骨DNA 提取方法有：苯酚-氯仿法、Chelex-100 法、硅珠法、硅膠膜法等，對(duì)于燒骨更加微量DNA 的提取，國(guó)內(nèi)學(xué)者還提出了改良苯酚-氯仿法、十六烷基三甲基溴化胺法［3］等。

（一）苯酚-氯仿提取法

苯酚-氯仿法是經(jīng)典的DNA 提取方法，廣泛用于DNA 測(cè)序工作中。在骨DNA 提取時(shí)，采取碎骨、研磨方法取骨樣，通過(guò)乙二胺四乙酸鈉（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，簡(jiǎn)稱(chēng)EDTA）脫鈣、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS）去污、蛋白酶K（Proteinase K，簡(jiǎn)稱(chēng)PK）消化，再通過(guò)離心分離DNA 方式獲得樣液，而后使用苯酚（phenol）和氯仿（Trichloromethane，也稱(chēng)三氯甲烷）進(jìn)行萃取，最后獲得DNA。在此過(guò)程中，使用EDTA 可以螯合鈣、鎂等金屬離子，極大減少組織被破壞，不影響DNA 分子結(jié)構(gòu)。

（二）Chelex-100 提取法

Chelex-100 是一種由苯乙烯和二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹(shù)脂，內(nèi)部含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，具有非常明顯的螯合多價(jià)金屬離子作用。通過(guò)螯合鎂離子等，使核酸酶失去活性，保護(hù)DNA 分子不被降解。在骨DNA 提取時(shí)，與苯酚-氯仿提取法取得樣液過(guò)程相同，再通過(guò)Chelex-100提取DNA。提取過(guò)程中應(yīng)始終在一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行，可有效避免污染。但由于本法提取的DNA純度不高，所以筆者不建議運(yùn)用Chelex-100 法提取骨DNA。

（三）硅珠提取法

異硫氰酸胍（Guanidinium thiocyanate，簡(jiǎn)稱(chēng)GuSCN）具有裂解消化細(xì)胞且抑制核酸酶活性的作用，硅珠法是通過(guò)碎骨、研磨、EDTA 脫鈣、PK+GuSCN 裂解消化骨中DNA，并利用硅珠在裂解介質(zhì)中對(duì)DNA 的特異性吸附作用，將骨DNA進(jìn)行提取。劉雅誠(chéng)［4］等人研究認(rèn)為，硅珠法相較于Chelex-100 或苯酚-氯仿法，可以明顯提高骨DNA的檢出率。GuSCN 屬于有毒物質(zhì)，特別是其在遇酸后可產(chǎn)生有毒氣體氰化氫（HCN），提取時(shí)應(yīng)注意人員和環(huán)境的保護(hù)。

（四）硅膠膜提取法

硅膠膜法是通過(guò)挫骨、EDTA 脫鈣、消解獲取含有骨DNA 的樣液，再通過(guò)快速離心柱，將DNA結(jié)合到QIAamp 硅膠膜上，并過(guò)濾掉其他污染物，再通過(guò)兩次洗滌，將二價(jià)陽(yáng)離子和蛋白質(zhì)等去除，最高得到高純度的DNA。在取骨樣時(shí)，可以挫取骨粉的方法獲取，無(wú)需對(duì)骨樣進(jìn)行研磨，減少提取流程，是筆者比較推薦使用的方法。［5］

（五）改良苯酚-氯仿提取法

徐國(guó)昌等人［6］通過(guò)對(duì)苯酚-氯仿法進(jìn)行改良，并運(yùn)用改良后方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究后認(rèn)為，改良方法雖然比常規(guī)方法多了3 個(gè)步驟，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間也較常規(guī)方法耗時(shí)長(zhǎng)，但DNA 的產(chǎn)率明顯提高，是燒骨DNA 提取工作中值得推廣的方法，可以有效維護(hù)DNA 分子結(jié)構(gòu)。在DNA 提取時(shí)，使用EDTA 可以極大減少組織破壞，不影響DNA 分子結(jié)構(gòu)；在氯仿、異戊醇的作用下，減少酚對(duì)DNA分子結(jié)構(gòu)的破壞。對(duì)于DNA 樣品純度不好的，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行純化處理，PCR 反應(yīng)物應(yīng)當(dāng)盡快進(jìn)行電泳且體積在10ul 為宜。當(dāng)出現(xiàn)“影子帶”（Stutter Band，又稱(chēng)鬼影帶），讀取時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行嚴(yán)格鑒別。

（六）十六烷基三甲基溴化銨提取法

十六烷基三甲基溴化銨（Sixteen Alkyl Three Methyl Bromide，CTAB）是一種陽(yáng)離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，CTAB 與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，可以用于從大量產(chǎn)生黏多糖的有機(jī)體中制備純化DNA。

葉健等人［3］通過(guò)實(shí)驗(yàn)，將燒骨研磨后加入CTAB緩沖液中，室溫下放置12 ～24h，而后加入PK，經(jīng)過(guò)水浴震蕩等流程使骨組織細(xì)胞釋放DNA，再通過(guò)離心獲取含有DNA 的液體。通過(guò)磁珠純化DNA、PCR 擴(kuò)增后，焚燒度較輕燒骨可以檢驗(yàn)完整清晰的DNA 圖譜，焚燒度越重DNA 的缺失位點(diǎn)越多。相較于傳統(tǒng)苯酚—氯仿提取法，CTAB 法提取陳舊骨和燒骨的DNA 更加穩(wěn)定、簡(jiǎn)便。

（七）其他

其他還有一些新型的骨DNA 提取方法，如美國(guó)的Steadman 等人［7］研究的，利用熱離析作用協(xié)同PCR 技術(shù)對(duì)燒骨DNA 的提取，其實(shí)驗(yàn)中使用了十種化學(xué)藥品，結(jié)果表明每一種處理方法都可以順利獲取DNA。

三、結(jié)語(yǔ)

法庭科學(xué)從業(yè)人員或司法鑒定人，在受理此類(lèi)案件時(shí)，應(yīng)對(duì)送檢骨樣進(jìn)行初步審查，對(duì)陳骨的腐敗、降解程度和燒骨的燒灼程度進(jìn)行肉眼綜合判斷，經(jīng)初步審查認(rèn)為難以檢出或僅可部分檢出DNA 序列的檢材，受理審查人員應(yīng)在檢驗(yàn)前向委托方進(jìn)行告知。

陳骨和燒骨的檢出率主要依靠取材和骨DNA提取過(guò)程，除了上述注意要點(diǎn)外，實(shí)驗(yàn)時(shí)還應(yīng)注意防止樣品污染。如，在吸加PCR 試劑和模板時(shí)，吸樣要慢且盡量一次性完成，避免因多次抽吸導(dǎo)致的交叉污染或氣溶膠污染。取材料、碎骨、研磨、DNA 提取等每一次操作過(guò)程要勤換手套，特別是進(jìn)入不同區(qū)域、接觸不同物體都要更換手套。每一項(xiàng)操作都要?jiǎng)幼鬏p柔，避免誤傷和飛濺。

綜上所述，在進(jìn)行陳骨和燒骨DNA 檢驗(yàn)時(shí)，骨DNA 的提取相對(duì)復(fù)雜，除了因?yàn)楣菢悠纷陨砀瘮?、降解、燒灼碳化等原因外，骨樣取材位置、DNA 提取方法、實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)等也會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按DNA 檢測(cè)的質(zhì)量控制程序進(jìn)行結(jié)果控制。對(duì)于骨DNA 的提取方法，目前仍有待專(zhuān)家學(xué)者們進(jìn)一步研究，研制出更加方便、快捷、高效的提取方法，在法庭技術(shù)DNA 檢驗(yàn)鑒定中推廣。