界面單層膜和囊泡雙層膜中膽固醇對(duì)飽和磷脂膜的影響

王　娟， 孫潤(rùn)廣

(陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院， 陜西 西安 710119)

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界面單層膜和囊泡雙層膜中膽固醇對(duì)飽和磷脂膜的影響

王娟， 孫潤(rùn)廣*

(陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院， 陜西 西安 710119)

摘要：利用界面Langmuir單層膜和大單層囊泡的雙層膜研究了不同含量膽固醇對(duì)飽和磷脂DPPC膜的影響，以及膽固醇與DPPC的相互作用。在雙層膜模型中，使用DPH熒光探針標(biāo)記膜，通過測(cè)量熒光穩(wěn)態(tài)各向異性和熒光壽命，來(lái)探討膽固醇對(duì)飽和DPPC雙層膜流動(dòng)性及微粘度的影響。在界面單層模型中，通過壓力-面積曲線分析膽固醇對(duì)單層膜相變的影響，并計(jì)算吉布斯自由能實(shí)驗(yàn)值，與維里物態(tài)方程擬合得到理論參數(shù)相結(jié)合，討論膽固醇與DPPC在膜上的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入少量膽固醇后，兩種模型膜流動(dòng)性降低，微粘度增大；膽固醇較高時(shí)，膜流動(dòng)性轉(zhuǎn)為增大，微粘度降低。當(dāng)膽固醇摩爾比大于等于0.5時(shí)，流動(dòng)性達(dá)到穩(wěn)定。流動(dòng)性的改變與膽固醇影響膜的相變過程有關(guān)，膽固醇分子和DPPC分子相互作用力的引力在膽固醇摩爾比為0.5時(shí)達(dá)到最大。

關(guān)鍵詞:囊泡； Langmuir單層膜； 膜流動(dòng)性； 相變； 膽固醇

PACS: 87.14.Cc

膽固醇可插入到膜中，其分子長(zhǎng)軸平行于磷脂?；?故增大了酰基鏈的有序性，從而降低末端甲基原子團(tuán)的包裹能力[1-4]。另外，膽固醇對(duì)磷脂膜也有調(diào)節(jié)作用[5]。但是大量膽固醇能夠形成晶體狀微區(qū)，這可能是造成動(dòng)脈粥樣硬化的原因[6]。飽和磷脂和甾醇類分子在體外可能自發(fā)地形成納米級(jí)的晶體狀微區(qū)[7]。在脂質(zhì)體包裹藥物方面，膽固醇發(fā)揮著穩(wěn)定脂質(zhì)體、提高包封率、降低釋藥率的有利作用[8-9]。所以，膽固醇對(duì)磷脂膜的影響研究不僅具有生物學(xué)意義，對(duì)藥物脂質(zhì)體制備也具有一定指導(dǎo)意義。

文獻(xiàn)[10]報(bào)道了使用單層或者雙層模型單獨(dú)研究膽固醇對(duì)磷脂膜的動(dòng)力學(xué)和相行為的影響，本文結(jié)合這兩種模型膜，來(lái)研究不同摩爾比的膽固醇對(duì)飽和磷脂DPPC膜的影響。使用DPH熒光探針標(biāo)記大單層囊泡膜，分析穩(wěn)態(tài)熒光各向異性值和瞬態(tài)熒光壽命來(lái)研究膽固醇對(duì)雙層膜流動(dòng)性和微粘度的影響。而Langmuir單層膜作為雙層膜的一半，用來(lái)研究膽固醇對(duì)DPPC膜相變的影響以及膜上分子間的相互作用。這兩種方法的實(shí)驗(yàn)分析可為下一步研究膽固醇對(duì)蛋白質(zhì)-脂相互作用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑

高純度1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine (DPPC), Cholesterol (Chol) 和1, 4-bis(5-phenyl-2-oxazolyl)benzene (POPOP) 購(gòu)買于Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。熒光探針1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) 來(lái)自Molecular Probes (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA)。所有試劑使用時(shí)均未作進(jìn)一步提純。實(shí)驗(yàn)所用水均為由Milli-Q 水提純系統(tǒng)(18.2 MΩ/cm, Millipore, USA)獲得的高純水。

1.2大單層囊泡制備

大單層囊泡由超聲薄膜分散法制得[11]。簡(jiǎn)單來(lái)說，不同比例的膽固醇和DPPC分子溶解在氯仿/甲醇(體積分?jǐn)?shù)為5∶1)混合溶劑中。使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑，成膜后，放入真空干燥箱干燥。12 h后取出，用10 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)水化1 h。得到懸浮液，置于超聲細(xì)胞粉碎儀中，冰浴0 ℃探頭超聲5 min(工作1 s, 間歇2 s, 功率200 W) 以減小粒徑。超聲后，使用200 nm的聚碳酸酯孔膜過濾并擠壓大單層囊泡膜三次，得到200 nm囊泡。熒光標(biāo)記脂質(zhì)體制備方法同上，探針∶脂(摩爾比)為1∶320。制得的囊泡溶液在35 ℃溫浴1 h，待測(cè)。

1.3穩(wěn)態(tài)各向異性和瞬態(tài)熒光壽命

使用穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(PTI，USA)測(cè)量。用360 nm波長(zhǎng)激發(fā)樣品，掃描發(fā)射波長(zhǎng)460～500 nm。各向異性值由下式[12-13]給出

(1)

其中：IVV和IVH分別是激發(fā)光垂直測(cè)得的水平和垂直發(fā)射光偏振強(qiáng)度，IHV和IHH是激發(fā)光水平時(shí)測(cè)得的水平和垂直發(fā)射光偏振強(qiáng)度，G是校正因子，G=IHV/IHH。熒光壽命在375nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)量。所有測(cè)量都使用POPOP作為擬合相關(guān)壽命(1.35ns)[14]。DPH熒光延遲曲線由雙指數(shù)擬合法擬合得到熒光壽命。

1.4Langmuir單層膜技術(shù)

用Langmuir膜天平(KSV-Minitrough,Finland)研究空氣-水界面膜單層的相行為。表面壓力由濾紙(10mm×30mm×0.15mm) 制得的Wilhelmy型張力傳感器測(cè)得，精度為0.1mN/m。亞相溶液使用10mmol/LTris-HCl緩沖液，pH值為7.4。用微量進(jìn)樣器將脂類溶液均勻地滴加在亞相液面上，使其自動(dòng)迅速鋪展，靜置15min，待亞相上有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后，以15mm/min的速度壓膜。1.5維里物態(tài)方程分析

二維維里物態(tài)方程[15]如下

(2)

其中：b0、b1和b2是維里系數(shù)。b0與膜上分子聚集有關(guān)，b1與分子間相互作用相關(guān)，其他維里系數(shù)不重要。

對(duì)于混合單層膜，兩種分子間的相互作用可通過以下公式[16]分析

(3)

其中：(b1)1和(b1)2分別是組分1和2的第二維里系數(shù)，(b1)12是表征兩組分間相互作用的第二維里系數(shù)。

將(b1)12=[(b1)1+(b1)2]/2代入公式(3), 則獲得理想值為

(4)

(b1)E=(b1)m-(b1)1X1-(b1)2X2。

(5)

(b1)E也被稱為過量維里系數(shù)，為正值時(shí)，揭示混合分子間相互作用為引力。

2結(jié)果與討論

2.1不同摩爾比膽固醇對(duì)DPPC囊泡膜流動(dòng)性的影響

2.1.1穩(wěn)態(tài)熒光各向異性脂質(zhì)囊泡在35 ℃下恒溫水浴1 h, 再測(cè)其探針各向異性值。如圖1所示，加入少量Chol后，探針的熒光各向異性值明顯降低，并且在Chol摩爾比為0.2時(shí)，達(dá)到最小值。但是，當(dāng)Chol摩爾比超過0.2時(shí)，各向異性值隨著Chol摩爾比的增大而增大，并且在摩爾比達(dá)到0.5時(shí)，達(dá)到最大值。各向異性值越大，囊泡膜的有序性越高，流動(dòng)性越低。也就是說，在脂質(zhì)囊泡中加入少量的Chol(摩爾比小于0.2)時(shí)，囊泡膜上的分子排列變得更加無(wú)序，使膜流動(dòng)性增加。而加入Chol摩爾比超過0.2后，隨著Chol量的增加，膜上分子排列的有序性增加，膜流動(dòng)性降低。但是當(dāng)Chol摩爾比達(dá)到0.5時(shí)，膜的有序性達(dá)到最高。有趣的是，探針DPH在純DPPC囊泡膜上與其在含有0.3～0.4摩爾比Chol的DPPC囊泡膜上的各向異性值比較接近，而人體正常細(xì)胞膜上含有0.3摩爾比的Chol?？梢姡珻hol不僅保證了生物膜上合適的流動(dòng)性和有序性，也與其他分子相互作用參與到細(xì)胞活動(dòng)中。而Chol含量過高，則會(huì)降低膜的流動(dòng)性，可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。這是因?yàn)樵谏锬ど?，高含量的Chol可能會(huì)形成晶體狀微區(qū)，導(dǎo)致膜流動(dòng)性受到限制。

膜的流動(dòng)性也可用微粘度評(píng)價(jià)。微粘度越大，表明膜的流動(dòng)性越小。微粘度由下式計(jì)算得到

η=6r/(0.92-2.54r)。

(6)

其中，r是實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的各向異性值。

圖2顯示膜流動(dòng)性隨Chol摩爾比的增大先增大后減小，且Chol摩爾比為0.2時(shí)，流動(dòng)性最大，0.5時(shí)流動(dòng)性最小。結(jié)果與各向異性值分析一致。

2.1.2DPH的熒光壽命與旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間DPH探針分布在雙層膜疏水內(nèi)部具有長(zhǎng)壽命，在膜親水表面具有短壽命。用雙指數(shù)擬合方程擬合DPH的熒光延遲曲線，得到探針的熒光壽命(圖3)。雙指數(shù)擬合方程為

y=A+Be(-t/τ1)+Ce(-t/τ2)。

(7)

其中：t是時(shí)間變量，A、B和C是擬合參數(shù)，τ1和τ2是探針的熒光壽命，擬合卡方值為0.8～1.2。

與純DPPC囊泡相比，加入Chol的摩爾比為0.1～0.2后，DPH的長(zhǎng)壽命變化不大，短壽命先增大后減小。Chol摩爾比≥0.3時(shí)，長(zhǎng)壽命逐漸增大，而短壽命幾乎不變。

水分子對(duì)DPH熒光有猝滅作用。DPH熒光壽命的變化與水分子穿膜有關(guān)。加入Chol的摩爾比為0.1后，磷脂頭部基團(tuán)與Chol分子剛性環(huán)上的羥基形成氫鍵，Chol的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和酰基鏈與磷脂?；溒叫校瑒傂原h(huán)狀結(jié)構(gòu)阻礙了DPPC分子的運(yùn)動(dòng),使流動(dòng)性降低。大單層囊泡膜雙層變得緊密，使水穿透能力減弱。當(dāng)Chol摩爾比大于0.3，長(zhǎng)壽命逐漸增大，膜流動(dòng)性降低，而短壽命幾乎不變，說明DPH壽命與膜環(huán)境有關(guān)。

DPH的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間可由熒光壽命通過下式計(jì)算

(8)

其中：r是熒光探針的各向異性值，τ是熒光壽命, r0是固有各向異性(r0(DPH)=0.4)，φ是旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間(φ1、φ2分別由τ1、τ2計(jì)算得到)。當(dāng)Chol摩爾比超過0.3時(shí)，DPH在雙層疏水區(qū)的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間逐漸增大，但在膜界面變化不大(圖4)。

熒光壽命和旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間的分析一致，間接提供了雙層膜流動(dòng)性的相關(guān)信息。

2.2不同膽固醇含量對(duì)DPPC單層膜的影響

2.2.1相轉(zhuǎn)移圖5顯示相變壓力與彈性模量的關(guān)系。加入Chol的摩爾比為0.1～0.2時(shí)，相變壓力降低，而當(dāng)摩爾比為0.3和0.4時(shí)，相變壓力增大，與純DPPC單層的相變壓力接近。當(dāng)Chol摩爾比超過0.4時(shí)，相變壓力逐漸下降。相變壓力變化范圍為2.85～3.21 mN/m。

相變壓力處的彈性模量可由公式[17-23]得出

(9)

其中，A是表面壓力π對(duì)應(yīng)的平均分子面積。從圖5可以看出，當(dāng)Chol摩爾比為0.1～0.2時(shí)，與純DPPC單分子層相比，相變處彈性模量略微降低，說明單層膜有序性稍微降低。當(dāng)Chol摩爾比大于0.2時(shí)，相變處彈性模量隨著Chol增加而逐漸增大，表明單層膜的有序性增加，流動(dòng)性減弱。

2.2.2膽固醇與DPPC在空氣-水界面上的相互作用在一定壓力下，二元系統(tǒng)單層膜的過量吉布斯自由能可由下式[24-27]計(jì)算

(10)

ΔAexc=A12-Aid,

(11)

Aid=A1X1+A2X2。

(12)

其中:A12是一定壓力下二元系統(tǒng)的平均分子面積，A1、A2是單一組分1和2在同樣壓力下的平均分子面積，X1、X2是混合系統(tǒng)中不同組分的摩爾比例，N是阿佛加德羅常數(shù)。

過量吉布斯自由能可以揭示膜上分子間的相互作用以及膜的穩(wěn)定性。如圖6所示，混合膜過量吉布斯自由能為負(fù)值，說明DPPC和Chol分子間相互作用表現(xiàn)為引力。并且，當(dāng)Chol摩爾比為0.5時(shí)，過量吉布斯自由能的絕對(duì)值達(dá)到最大，表明分子間相互作用力最強(qiáng)。這與文獻(xiàn)[28]報(bào)道相一致。

二維維里物態(tài)方程的第二維里系數(shù)也可以說明分子間的相互作用。用維里物態(tài)方程對(duì)表面壓力-平均分子面積曲線擬合，得到參數(shù)見表1。(b1)m為負(fù)值，(b1)E為正值，均說明DPPC和Chol在空氣水界面上的相互作用力為引力。這點(diǎn)與過量吉布斯自由能分析一致。

3結(jié)論

Chol對(duì)DPPC飽和脂膜的影響與Chol在膜成分中所占的摩爾比有關(guān)。隨著Chol含量的增加，脂膜的流動(dòng)性先輕微增大，后顯著降低。低含量的Chol與DPPC分子相互作用，降低膜的有序性，使膜的流動(dòng)性輕微增大。而高含量的Chol在DPPC脂膜上可能形成晶體微結(jié)構(gòu)，使得Chol區(qū)域和DPPC區(qū)域變得更有序，使得膜的流動(dòng)性減弱。Chol和飽和脂分子間的相互作用力為引力，并在Chol摩爾比為0.5時(shí)達(dá)到最大值。

Chol在人體正常細(xì)胞膜上摩爾比為0.3左右，Chol含量的過高或過低影響細(xì)胞膜的物理性質(zhì)，使細(xì)胞不能維持正常的生命活動(dòng)。動(dòng)脈粥樣硬化與高含量Chol在膜上形成晶體微區(qū)以及Chol與膜脂分子的相互作用有著很大的關(guān)系。界面單層膜和囊泡膜兩種模型中得出的結(jié)論可以相互驗(yàn)證。

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〔責(zé)任編輯 李博〕

Effect of cholesterol on saturated phospholipid membrane in bilayer or monolayer model

WANG Juan, SUN Runguang*

(School of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University,>Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:The bilayer membranes of liposome and Langmuir monolayer were employed to study the interaction of cholesterol and DPPC.The effect of cholesterol on the membrane fluidity of saturated DPPC liposome has been studied by measuring the fluorescence anisotropy and lifetime of the DPH probe labelled in the liposomes. Phase transition and the intermolecular interaction have been investigated by the Langmuir technique and theoretical analysis.The results show that the fluidity of the membrane decreased first and then increased as the increase of cholesterol. WhilexChol≥0.5, the fluidity reached stable.The cholesterol has an influence on the phase transition of DPPC monolayer. The interaction between cholesterol and DPPC shows an attraction and reaches a maximum whenxChol=0.5.Keywords: liposomes; Langmuir monolayer; membrane fluidity; phase transition; cholesterol

文章編號(hào)：1672-4291(2016)03-0032-06

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.03.231

收稿日期：2015-12-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21402114); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(GK201504004)

*通信作者:孫潤(rùn)廣,男,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:sunrunguang@snnu.edu.cn

中圖分類號(hào):Q63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A