聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭固定化大腸桿菌在不同水體中的毒性檢測(cè)

徐穎超， 劉　暢， 常曉杰

(錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 遼寧 錦州 121000)

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聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭固定化大腸桿菌在不同水體中的毒性檢測(cè)

徐穎超， 劉暢*， 常曉杰

(錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 遼寧 錦州 121000)

摘要：為構(gòu)建以鐵氰化鉀為探針的電化學(xué)用于化學(xué)品的毒性檢測(cè)方法,初步探討了聚乙烯醇(PVA)與添加劑海藻酸鈉(SA)、活性炭(AC)共固定包埋大腸桿菌(E.coli)的活性微生物顆粒在實(shí)驗(yàn)室廢水、毒物3,5-二氯苯酚(DCP)、殺蟲(chóng)劑乙嘧酚以及除草劑五氰磺草胺的水樣毒性分析中的應(yīng)用性能。結(jié)果表明：添加劑SA和AC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，交聯(lián)劑CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%為本研究最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，此時(shí)所測(cè)毒物對(duì)微生物固定化顆粒的呼吸抑制作用依次為DCP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水，抑制率分別是30.23%～55.35%、25.14%～46.23%、20.12%～38.33%和5.74%～27.89%，抑制率和靈敏度均明顯優(yōu)于僅由PVA-SA單獨(dú)固定包埋的大腸桿菌顆粒。

關(guān)鍵詞：添加劑； 微生物固定化； 電化學(xué)； 毒性檢測(cè)

聚乙烯醇(PVA)是一種無(wú)色無(wú)毒、生物相容性好、抗微生物降解能力強(qiáng)、化學(xué)性能穩(wěn)定且力學(xué)性能優(yōu)良的合成高分子聚合物，具有很好的成膜性，被認(rèn)為是最有效的固定化載體之一[1-5]。海藻酸鈉(SA)是一種天然多糖，具有很好的穩(wěn)定性和黏性，且價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于固定活細(xì)胞和敏感細(xì)胞[6-11]。PVA中添加SA可以避免固定化顆粒制備過(guò)程中的粘連現(xiàn)象，改善PVA的成球性[12-16]。

目前，PVA-SA固定微生物技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于廢水處理領(lǐng)域，如去除廢水中氨氮、重金屬及水體富營(yíng)養(yǎng)化等方面[13,17-22]。然而，PVA-SA固定化存在著機(jī)械強(qiáng)度較低、顆粒易破裂及微生物活性降低不利于長(zhǎng)期使用等缺點(diǎn)[23-26]。因此，為了提高微生物活性和共混顆粒的機(jī)械強(qiáng)度,本研究嘗試同時(shí)混合PVA、SA與活性炭(AC)制備PVA-SA-AC共混顆粒，以改善PVA-SA固定化載體的缺陷，制備出更加優(yōu)良的共混顆粒應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)的廢水處理。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，電化學(xué)結(jié)合鐵氰化鉀探針可有效應(yīng)用于化學(xué)品的毒性檢測(cè)[27-28]。以此為基礎(chǔ)，本文通過(guò)監(jiān)測(cè)鐵氰化鉀還原產(chǎn)物量的變化，考察共混微生物顆粒的呼吸作用強(qiáng)度，從而對(duì)共混顆粒中的添加劑含量和交聯(lián)劑CaCl2含量進(jìn)行擇優(yōu)篩選，尋找最優(yōu)包埋條件。進(jìn)而研究在最優(yōu)條件下共混顆粒的菌種活性、機(jī)械強(qiáng)度及膨脹性，最終將其用于不同毒物的毒性檢測(cè)，并監(jiān)測(cè)其保存周期內(nèi)對(duì)毒物靈敏度的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：大腸桿菌從遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院采集，純化后用體積分?jǐn)?shù)15%的甘油于-20 ℃冷凍保存。

LB培養(yǎng)基：酵母粉質(zhì)量濃度為5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，于120 ℃下滅菌20 min后備用。

磷酸緩沖溶液(PBS)：KH2PO40.08 mol/L，Na2HPO40.12 mol/L，于120 ℃下滅菌20 min后備用。

葡萄糖-谷氨酸(GGA)標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖質(zhì)量濃度為150 mg/L，谷氨酸質(zhì)量濃度為150 mg/L。

鐵氰化鉀母液的量濃度為0.33 mol/L。

3,5二氯苯酚(DCP)、乙嘧酚和五氰磺草胺母液質(zhì)量濃度均為100 mg/L。

鐵氰化鉀和標(biāo)準(zhǔn)GGA溶液均為使用當(dāng)天配制。AC和SA為化學(xué)純，除蛋白胨和酵母提取物外的其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CHI832C電化學(xué)分析儀，上海辰華儀器有限公司；KYC-100B空氣恒溫?fù)u床，上海福瑪實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；721可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4，常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種處理方法 取200 μL大腸桿菌(Escherichcoli，E.coli)菌種接入330 mL的LB培養(yǎng)基中,于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14 h(37 ℃，120 r/min)，平行培養(yǎng)2份。將培養(yǎng)后的菌液在4 000 r/min下離心10 min，棄去上層培養(yǎng)基，菌體沉淀用PBS洗滌2次后，懸浮于20 mL PBS中。采用721可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)菌懸液的光密度值(OD600)，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm，并將其調(diào)節(jié)為10.0后，放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 固定化微生物顆粒制備將聚乙烯醇與一定量的SA和AC充分熱融，冷卻后與上述處理后的菌種均勻混合，保持總體積為10 mL，聚乙烯醇的終濃度為10 g/L，細(xì)菌OD600=10.0。隨后將混合液用針管注射器滴入到含一定量CaCl2的100 mL飽和H3BO3溶液(pH值為6.7)中，并不斷攪拌，形成固定化顆粒(平均直徑約1.5 mm)。于4 ℃冰箱內(nèi)，固定微生物的復(fù)合膠粒在CaCl2-H3BO3溶液中交聯(lián)24 h后，濾出凝膠顆粒，采用PBS洗滌后備用。

1.3.3 分析方法將固定化微生物顆粒放于已通入高純氮20 min的K3Fe(CN)6和GGA的混合培養(yǎng)液中，并保證混合培養(yǎng)液的總體積為10.0 mL，混合后懸液中的K3Fe(CN)6為45 mmol/L，GGA 為220 mg/L，3,5-二氯苯酚(3,5-Dichlorophenol，DCP)、乙嘧酚和五氰磺草胺的濃度范圍均為0～5 mg/L，實(shí)驗(yàn)室廢水體積為0.1～0.5 mL。37 ℃水浴通氮培養(yǎng)1 h后，取1 mL懸液(每份樣品平行取3份)于8 000 r/min離心3 min，結(jié)束反應(yīng)。其中，固定化微生物活性檢測(cè)時(shí)，混合培養(yǎng)液中毒物的質(zhì)量濃度為0 mg/L。

(1)

毒物毒性大小用毒物對(duì)微生物的抑制率表示，如式(2)所示

(2)

其中：Inor為正常微生物進(jìn)行新陳代謝的極限電流強(qiáng)度；Itox為加入毒物后微生物進(jìn)行新陳代謝的極限電流強(qiáng)度；Iinhibition為毒物對(duì)固定化微生物顆粒的抑制率。

1.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.4.1 添加劑及交聯(lián)劑用量對(duì)固定化微生物活性的影響分別選取海藻酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%)及活性炭(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%)與質(zhì)量濃度10 g/L的聚乙烯醇混合包埋的固定化顆粒各3顆，于不含毒物的鐵氰化鉀和GGA的混合培養(yǎng)液中通氮保溫培養(yǎng)1 h后，采用電化學(xué)方法檢測(cè)添加劑與交聯(lián)劑的使用量對(duì)E.coli活性影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。

實(shí)驗(yàn)條件:海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為A(%)，活性炭的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為B(%)，交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C(%)，以電流比值為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的取值范圍及其水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.4.2 添加劑對(duì)固定化微生物顆?；钚缘挠绊戨S機(jī)取固定化微生物顆粒30顆，放入培養(yǎng)皿中4 ℃真空冷藏保存，備用。每隔5天各選取固定化顆粒3顆，進(jìn)行檢測(cè)。用計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)相同時(shí)段固定化微生物顆粒的生物活性。將各極限電流代入公式(1)，并繪制出活性隨存貯周期變化曲線(xiàn)。

1.4.3 固定化微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度將所得的最優(yōu)條件下的30顆PVA-SA-AC包埋的微生物顆粒放入含100 mL PBS的反應(yīng)器內(nèi)，在25 ℃，120 r/min磁力攪拌器下均勻攪拌，記錄1～12 h內(nèi)固定化顆粒完好的個(gè)數(shù)占顆?？倲?shù)的比率以表示其機(jī)械穩(wěn)定性。

1.4.4 固定化微生物顆粒的膨脹性隨機(jī)取30顆固定化微生物顆粒，分別用游標(biāo)卡尺測(cè)定每顆顆粒的直徑；隨后將其放入250 mL含100 mL PBS的錐形瓶中4 ℃冷藏，用游標(biāo)卡尺記錄1～5 h存儲(chǔ)時(shí)間內(nèi)顆粒直徑的變化；根據(jù)顆粒在不同時(shí)間的平均溶脹直徑與初始顆粒的平均直徑之比來(lái)表示顆粒的膨脹性能。

1.4.5 固定化微生物顆粒在不同水體中的毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)選取了毒物DCP、殺蟲(chóng)劑乙嘧酚、除草劑五氰磺草胺和實(shí)驗(yàn)室廢水作為研究對(duì)象，用計(jì)時(shí)電流法考察優(yōu)化后的固定化微生物顆粒對(duì)上述毒物的響應(yīng)，并與只含有10 mg/LPVA-1% SA固定化E.coli的顆粒作對(duì)比。分別選取PVA-SA-AC或PVA-SA固定E.coli顆粒投入已通氮20 min的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液成分包括：45 mmol/L鐵氰化鉀，220 mg/L GGA及不同濃度的有機(jī)毒物或?qū)嶒?yàn)室廢水，其中DCP、乙嘧酚和五氰磺草胺的濃度范圍均為1～5 mg/L，實(shí)驗(yàn)室廢水的體積添加量為0.1～0.5 mL。繼續(xù)通氮恒溫(37 ℃)培養(yǎng)1 h后，離心結(jié)束反應(yīng)并檢測(cè)各樣品的極限電流，記為Itox。在相同培養(yǎng)條件下，固定化微生物顆粒在不含毒物的培養(yǎng)液中反應(yīng)1 h后，檢測(cè)得電流記為Inor。將所得電流值帶入公式(2)，以抑制率為縱坐標(biāo)，毒物濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加劑及交聯(lián)劑用量對(duì)固定化微生物

活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。交聯(lián)劑濃度過(guò)小時(shí)，交聯(lián)不完全，顆粒強(qiáng)度彈性差；交聯(lián)劑濃度過(guò)大，會(huì)降低小球的傳質(zhì)性能，因此選擇2%的CaCl2最為合適。而海藻酸鈉和活性炭濃度均為1%時(shí)達(dá)到最好的固定條件，低于或高于此濃度水平，都會(huì)影響微生物的活性。

分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)兩種固定方法的影響順序均依次為：A—B—C，即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)>活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)>CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)。得到的實(shí)驗(yàn)理論最優(yōu)組合為A2B2C2，即海藻酸鈉和活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，得其活性比為7.47，效果較其他實(shí)驗(yàn)組合都好，故此配比將繼續(xù)應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備固定化微生物顆粒。

2.2 固定化微生物顆粒的活性

添加劑和交聯(lián)劑含量影響微生物活性，進(jìn)而影響其存儲(chǔ)周期。圖1中曲線(xiàn)a和b分別表示由10 mg/LPVA -1%SA-1%AC及10 mg/LPVA-1% SA包埋的固定化微生物顆粒的活性隨時(shí)間變化趨勢(shì)。由圖可知，PVA-SA-AC包埋微生物顆粒的初始活性比為7.47，經(jīng)50 d后菌活性仍達(dá)55.29%，80 d后活性下降為19.54%；PVA-SA包埋微生物顆粒的初始活性比為6.95，50 d后菌活性為52.23%， 80 d后活性?xún)H為0.14%?？梢?jiàn)，添加了AC后固定化顆粒的傳質(zhì)能力增強(qiáng)，微生物與外界有機(jī)物和PBS等有利生長(zhǎng)因素接觸更加充分，因此可有效地延長(zhǎng)菌體活性，增加顆粒儲(chǔ)藏時(shí)間。此外，AC表面有大量含氧官能團(tuán)，例如羧基、內(nèi)酯基和酚羥基等，這次官能團(tuán)經(jīng)常應(yīng)用于修飾生物電極，以提供更好的生物相容性。

固定化微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度隨時(shí)間的變化如圖2所示，30 min之內(nèi)固定化顆粒機(jī)械強(qiáng)度隨時(shí)間變化均勻降低。隨著時(shí)間增加，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度急速下降，原因可能是固定化微生物顆粒在測(cè)定過(guò)程中吸水使得顆粒逐漸膨脹，導(dǎo)致微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度迅速下降。

2.4 固定化微生物顆粒的膨脹性能

顆粒經(jīng)過(guò)活化后開(kāi)始出現(xiàn)水溶膨脹現(xiàn)象，這主要是因?yàn)镻VA與H3BO3進(jìn)行反應(yīng)形成凝膠時(shí),硼酸上的3個(gè)羥基只部分地進(jìn)行了反應(yīng),尚未完全反應(yīng)的羥基基團(tuán)與水形成氫鍵，使凝膠顆粒發(fā)生水溶膨脹的現(xiàn)象。圖3為由10 mg/LPVA-1%SA-1%AC包埋的微生物顆粒的膨脹性(a線(xiàn))與僅由10 mg/LPVA-1% SA 包埋的微生物顆粒的膨脹性(b線(xiàn))的比較。由圖可知，0～1 h之間a線(xiàn)上升速度明顯快于b線(xiàn)，1 h時(shí)PVA-SA-AC及PVA-SA包埋的固定化微生物顆粒的水溶膨脹系數(shù)分別增加了55%和40%，其原因可能是，AC可以使原本結(jié)構(gòu)緊密的顆粒變得相對(duì)疏松，易在水中膨脹。隨著時(shí)間的增加，1～5 h之間a線(xiàn)上升速度逐漸慢于b線(xiàn),5 h后相應(yīng)的膨脹系數(shù)分別增加了30%和31.25%。可見(jiàn)添加AC后更有利于長(zhǎng)期的固定化顆粒中微生物活性的保存。

選定優(yōu)化微生物固定顆粒，即10 g/L的PVA、1%的SA以及1%的AC共混包埋E.coli，建立微生物電化學(xué)傳感平臺(tái)，分別應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室采集的水樣、毒物DCP、農(nóng)藥乙嘧酚和除草劑五氰磺草胺的毒性檢測(cè)，并以?xún)H由10 g/L的PVA與1%的SA共混固定包埋的E.coli顆粒作為對(duì)照，結(jié)果如圖4所示：A、B、C和D分別為水樣、DCP、乙嘧酚和五氰磺草胺對(duì)固定化微生物顆粒的抑制曲線(xiàn)；曲線(xiàn)a和b分代表毒物對(duì)PVA-SA-AC固定的E.coli顆粒及PVA-SA固定的E.coli顆粒的抑制作用。

圖4A中水樣對(duì)優(yōu)化的固定微生物顆粒的作用隨水樣添加體積的增加而增加，其抑制率為5.74%～27.89%；而相同條件下，對(duì)照顆粒的抑制率僅為3.27%～17.78%。圖4B中，DCP的濃度為1～5 mg/L時(shí)對(duì)優(yōu)化的固定微生物顆粒的抑制率為30.23%～55.35%；相同條件下的DCP對(duì)對(duì)照顆粒的抑制率為18.21%～48.32%。圖4C為1～5 mg/L乙嘧酚對(duì)E.coli的抑制率，其中優(yōu)化顆粒被抑制為25.14%～46.23%，相應(yīng)的對(duì)照顆粒的被抑制為20.12%～38.33%。圖4D是1～5 mg/L五氰磺草胺對(duì)優(yōu)化顆粒的抑制率為23.11%～45.15%；同樣濃度范圍內(nèi)對(duì)對(duì)照顆粒的抑制率為19.32%～32.54%。結(jié)果顯示，所測(cè)毒物對(duì)E.coli的呼吸抑制作用大小順序?yàn)镈CP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水；經(jīng)優(yōu)化包埋的固定化顆粒對(duì)毒性的靈敏度明顯高于對(duì)照微生物顆粒，主要是因?yàn)锳C建立的疏松結(jié)構(gòu)在有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸?shù)耐瑫r(shí)，也加強(qiáng)了毒物與固定微生物的接觸，使其更加敏感。

3 結(jié)論

本文采用PVA-SA-AC摻雜膠體對(duì)E.coli進(jìn)行包埋，形成固定化微生物顆粒。通過(guò)計(jì)時(shí)電流法對(duì)固定微生物的活性變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，檢測(cè)其對(duì)各種毒物的靈敏度；通過(guò)浸泡和機(jī)械攪拌考察固定化顆粒的膨脹性能和機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)果表明，添加劑SA、AC以及交聯(lián)劑CaCl2的濃度對(duì)所固定的微生物顆?；钚浴C(jī)械強(qiáng)度及膨脹性能均有一定影響。其中添加劑SA與AC的最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，交聯(lián)劑CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。經(jīng)優(yōu)化的固定化微生物顆粒儲(chǔ)存80 d后活性仍可達(dá)19.54%，且其機(jī)械強(qiáng)度及膨脹性能均有所改善。相對(duì)于PVA-SA包埋E.coli顆粒，PVA-SA-AC固定化微生物顆粒對(duì)測(cè)試毒物具有更好的靈敏度，毒物毒性順序?yàn)镈CP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水?？梢?jiàn)，經(jīng)優(yōu)化的PVA-SA-AC固定化方法可有效提高固定化顆粒的物理性能和對(duì)毒物的靈敏度，延長(zhǎng)被固定菌株的活性，因此在水質(zhì)毒性檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

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〔責(zé)任編輯王勇〕

Application of polyvinyl alcohol-alginate-activated carbon immobilizedE.coliin testing toxicity of different wastewater

XU Yingchao， LIU Chang*， CHANG Xiaojie

(College of Pharmacy，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，Liaoning, China)

Abstract:To construct electrochemical detection toxicity of chemicals in water using ferricyanide as a probe, the toxicity of chemicals in different wastewater including laboratory wastewater, and poison of 3,5-dichlorophenol (DCP), pesticide ethirimol, herbicide five cyanide alachlor were determined by polyvinyl alcohol-alginate-activated carbon immobilizedE.coli. The following optimal experimental conditions were obtained.The quality score of sodium alginate and activated carbon additive are 1%, amount of cross-linking agent CaCl2is 2%. The order in the respiratory depression effect of toxicants on the microorganisms immobilized on particle are as following, DCP > ethirimol > five cyanide alachlor > laboratory waste, inhibition rate range of 30.23%～55.35%, 25.14%～46.23%, 20.12 %～38.33%～27.89% and 5.74%, respectively, and the sensitivity was significantly better than that treated by the PVA-SA immobilizedE.coli.Keywords: addition agent; immobilized microorganism; electrochemistry; toxicity testing

文章編號(hào)：1672-4291(2016)03-0085-06

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.03.335

收稿日期：2015-06-25

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金(2014022037)； 遼寧醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金(Y2012B006)

*通信作者：劉暢，女，副教授，博士。E-mail:liuchang_198006@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：X522

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A