姜黃素對原發(fā)性肝癌組織中肝星狀細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究*

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安710061)　李福廣　徐　軍

?

姜黃素對原發(fā)性肝癌組織中肝星狀細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究*

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安710061)李福廣徐軍

摘要目的：探索姜黃素對肝星狀細(xì)胞增殖、侵襲能力及相關(guān)分子表達(dá)的影響。方法：取新切取的肝細(xì)胞癌組織,利用組織消化分離培養(yǎng)法,提取活化狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞,鑒定細(xì)胞類型、評估細(xì)胞活性及純度。對新鮮提取的肝星狀細(xì)胞,經(jīng)不同濃度的姜黃素干預(yù)后用MTT法檢測細(xì)胞增殖,用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測姜黃素對肝癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞侵襲能力的影響。分別提取細(xì)胞總mRNA及總蛋白,運(yùn)用Realtime-PCR檢測姜黃素對肝癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞侵襲相關(guān)分子(MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白)表達(dá)影響。結(jié)果：姜黃素可以抑制肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴效應(yīng)；姜黃素處理可以降低肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞侵襲能力；姜黃素可以下調(diào)肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞侵襲相關(guān)分子MMP-2、I 型膠原的表達(dá),上調(diào)TIMP-1、層粘連蛋白的表達(dá)。結(jié)論：姜黃素可以抑制肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞的增殖,并降低其侵襲能力,該作用可能與調(diào)控侵襲相關(guān)分子MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白等的表達(dá)有關(guān)。

主題詞姜黃素癌,肝細(xì)胞細(xì)胞增殖@肝星狀細(xì)胞

我國是世界上原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)之一,肝癌標(biāo)化發(fā)病率是25.7/10萬,為僅次于肺癌、胃癌的最常見惡性腫瘤[1]。間質(zhì)化是原發(fā)性肝細(xì)胞癌重要特征，腫瘤微環(huán)境在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝細(xì)胞癌微環(huán)境中的重要組分,研究證實(shí)肝星狀細(xì)胞高度參與肝細(xì)胞癌的起源、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程,是肝細(xì)胞癌細(xì)胞外基質(zhì)的重要來源[2]。姜黃素是從天然植物姜科、天南星科等中提取的一種多酚類化學(xué)物質(zhì),近年來研究表明,姜黃素是一種優(yōu)良的抗腫瘤藥物[3]。研究證實(shí)其與纖維化肝組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞活性相關(guān),但姜黃素對肝細(xì)胞癌相關(guān)性星狀細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究擬探索姜黃素對肝細(xì)胞癌相關(guān)性星狀細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其可能機(jī)制，從而為姜黃素用于肝癌的治療提供依據(jù)。

材料和方法

1材料本實(shí)驗(yàn)所用原代肝星狀細(xì)胞(HSC)從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本中分離提取。標(biāo)本獲取前獲得患者許可,并經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。切取1.0～1.5 g肝癌組織,立即放置于4℃無菌的含有青霉素和鏈霉素的Hanks平衡鹽中,于無菌操作臺,在37 ℃含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中剪刀剪碎肝細(xì)胞癌組織至極微小的碎片組織,利用無菌PBS漂洗3次肝癌碎片組織后置于含0.05 %膠原酶P、0.02 %鏈霉蛋白酶以及0.1 %DNA酶的Gey平衡鹽消化液(GBSS)中,于37 ℃水浴振蕩45 min,以從肝癌碎片組織中分離HSC。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為澳大利亞Hyclone公司產(chǎn)品。四甲基偶氮唑鹽MTT、青霉素、鏈霉素、鹽霉素為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Realtime PCR試劑盒購自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司；所需引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)合成；兔抗鼠MMP-2、兔抗β-actin及兔抗TIMP-1購自美國Santa Cruz公司；鼠抗I 型膠原、鼠抗層粘連蛋白、鼠抗GFAP及鼠抗α-SMA抗體購自美國Cell signaling公司；山羊抗兔及山羊抗鼠二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司；RIPA蛋白裂解液購自上海申能博彩生物科技公司。

2細(xì)胞培養(yǎng)原代HSC含10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含青霉素、鏈霉素各100 ng/ml)培養(yǎng)于37 ℃含5 %CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),用0.25 %的胰酶消化傳代,選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。

3MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的HSC制成細(xì)胞懸液,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞于96孔板中接種HSC,待細(xì)胞貼壁后,加0.1 %FBS的DMEM培養(yǎng)基過夜饑餓處理。將饑餓后的HSC設(shè)立6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)孔,分別給以0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM等濃度的姜黃素進(jìn)行干預(yù),干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h、72 h。上述干預(yù)時(shí)間點(diǎn)到底后,每孔加入MTT溶液10 μl(濃度5 mg/ml),繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去上清,每孔再加入DMSO溶液200 μl,當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶并充分溶解后,檢測OD(490 nm)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。以O(shè)D值為縱軸，時(shí)間為橫軸，繪制細(xì)胞生長曲線圖。

4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力取2代以內(nèi)的HSC種植到6孔板,分別給予0 μM、10 μM、20 μM的姜黃素進(jìn)行干預(yù)48 h后,收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸單細(xì)胞，取8×104個(gè)細(xì)胞種植到包被有基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)，下室為700 μl含20 %胎牛血清的培養(yǎng)基。放培養(yǎng)箱36 h后,固定染色,擦拭膜上細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)視野，應(yīng)用Nikan攝像系統(tǒng)200倍鏡下照相并計(jì)數(shù)。以穿過基質(zhì)膠的下室細(xì)胞數(shù)作為觀察指標(biāo)。

5Realtime-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)將0 μM、10 μM及20 μM姜黃素干預(yù)24 h后的HSC按Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用Taka逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，得到的cDNA用于Real-time-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中含有：2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA),上游與下游引物各1 μl,2×SYBY green PCR Master 10 μl,用ddH2O水補(bǔ)足體積至20μl。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,58 ℃退火30 s,74℃延伸30 min,共40個(gè)循環(huán)；74℃延伸10 min以終止反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參照,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。Realtime PCR反應(yīng)完成后,待測基因的表達(dá)水平通過△△CT計(jì)算方法進(jìn)行定量表達(dá)?！鳌鰿T =實(shí)驗(yàn)組(CT目的基因- CTGAPDH)-對照組(CT目的基因-CTGAPDH)。擴(kuò)增用目的基因引物見表1。

附表　引物設(shè)計(jì)序列

結(jié)果

1肝星狀細(xì)胞的提取與鑒定本實(shí)驗(yàn)成功提取到肝細(xì)胞癌組織內(nèi)的肝星狀細(xì)胞。在倒置光學(xué)顯微鏡下,觀察到由肝癌組織內(nèi)提取、培養(yǎng)后第1天的肝星狀細(xì)胞呈多樣的星形狀(見圖1 A、B),提取后第1天行臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活力達(dá)85 %以上。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是肝癌組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞的特有成分,常作為肝星狀細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物；平滑肌肌動蛋白(a-SMA)則是活化的肝星狀細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志,它的高表達(dá)常常提示肝星狀細(xì)胞具有活化表型[4]。對提取后第1～2天的肝星狀細(xì)胞行GFAP、a-SMA的免疫熒光實(shí)驗(yàn),證實(shí)由上述實(shí)驗(yàn)方法提取的細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)需要的活化狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞(見圖1 C、D)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn),我們選取經(jīng)過2～3次傳代培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。

A、B：光鏡下,由肝癌組織中提取后第1天的肝星狀細(xì)胞(A圖放大倍數(shù)5×,B圖放大倍數(shù)20×)；C：提取后第1 天肝星狀細(xì)胞GFAP的免疫熒光圖(放大倍數(shù)20×)；D提取后第1天肝星狀細(xì)胞a-SMA的免疫熒光圖(放大倍數(shù)20×)

圖1肝星狀細(xì)胞的提取與鑒定

2姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞的增殖將含有不同終濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)姜黃素的培養(yǎng)基分別干預(yù)融合度為30 % ～ 40 %的HSC至不同的時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、48 h、72 h),采用MTT法評估姜黃素對肝星狀細(xì)胞增殖性的影響見附表。與0 μM對照組相比,姜黃素在5～40μmol/L濃度范圍內(nèi)對HCS增殖能力均具有一定的抑制作用,呈現(xiàn)一定的濃度依耐性和時(shí)間依耐性。相比對照組，5 μM組可抑制HSC增殖,但強(qiáng)度并不大,連續(xù)干預(yù)72 h,抑制率僅(16.41±2.14)%；40 μM組則可明顯抑制其的增殖,干預(yù)48 h后抑制率即可達(dá)(36.72±2.26)%,同時(shí),注意到相比20 μM組,40 μM組對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制率提升并不明顯，此結(jié)果提示隨著姜黃素干預(yù)濃度的提高，其對HSC的抑制效率提升潛力下降，濃度依耐性特點(diǎn)逐漸消失。

3姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞的侵襲見圖2。與0 μM的對照組相比,在給予10 μM、20 μM 姜黃素干預(yù)48 h后肝星狀細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(P< 0.05),且20 μM的姜黃素干預(yù)濃度較10 μM抑制作用更為明顯(P< 0.05),提示姜黃素對肝星狀細(xì)胞侵襲性的抑制作用具有濃度依耐性。由于此實(shí)驗(yàn)是在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的,故可有效排除肝星狀細(xì)胞增殖所產(chǎn)生的干擾。

附表　姜黃素對肝星狀細(xì)胞增殖的影響±s,n=3)

注：各組時(shí)間點(diǎn)與0 μM組比較，*P<0.05

與0 μM組比較,*P<0.05

A：姜黃素干預(yù)48h后肝星狀細(xì)胞Tanswell實(shí)驗(yàn)的代表性圖；B：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,姜黃素對肝星狀細(xì)胞侵襲相關(guān)分子表達(dá)的影響

圖2姜黃素對肝星狀細(xì)胞侵襲性的影響

4姜黃素對肝星狀細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將肝星狀細(xì)胞種植到6孔板，分別給予0 μM、10 μM、20 μM的姜黃素進(jìn)行干預(yù)36 h后，收集細(xì)胞，提取姜黃素干預(yù)后肝星狀細(xì)胞的總mRNA。通過Realtime-PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測肝星狀細(xì)胞內(nèi)侵襲相關(guān)基因(MMP-2、TIMP-1、I 型膠原及層粘連蛋白)的變化見圖3。結(jié)果顯示,姜黃素干預(yù)36 h后，相比0 μM對照組,10 μM組、20 μM組肝星狀細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)MMP-2及I 型膠原mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)，TIMP-1及層粘連蛋白的mRNA水平明顯升高,且20 μM組的變化更為明顯,提示姜黃素對肝星狀細(xì)胞內(nèi)侵襲相關(guān)基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)具有濃度依耐性。姜黃素干預(yù)48 h后,收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot分析。與PCR檢測結(jié)果一致,姜黃素干預(yù)可以顯著降低肝星狀細(xì)胞MMP-2、I 型膠原蛋白的表達(dá)水平,并提高TIMP-1、層粘連蛋白的表達(dá)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞的侵襲能力可能是通過抑制侵襲相關(guān)基因MMP-2、I 型膠原的表達(dá)以及提高TIMP-1、層粘連蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

與0μM組比較,*P<0.05,** P<0.01

討論

近年來的研究證實(shí)肝星狀細(xì)胞通過合成分泌細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子與ECM組分,高度參與肝細(xì)胞癌的起源、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程[5]。Amann等[6]研究顯示,活化的肝星狀細(xì)胞還可以通過高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素-1等促進(jìn)肝癌生長。本實(shí)驗(yàn)通過組織消化培養(yǎng)法提取了肝細(xì)胞癌組織內(nèi)活化的HSC,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測分析提示新鮮提取的細(xì)胞純度達(dá)到75%～85%，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活力達(dá)85%以上,以此應(yīng)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

由于植物藥的易獲取性、用藥安全性等因素,其抗癌作用越來越受到重視,姜黃素即為其中的典型代表,具有發(fā)展為臨床化療藥的潛力,近年來已有大量研究聚焦于姜黃素對肝細(xì)胞癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制[7]。肝星狀細(xì)胞為肝細(xì)胞癌組織內(nèi)尤為關(guān)鍵的間質(zhì)成分,同時(shí)也為肝纖維化、肝硬化逐漸進(jìn)展的核心促進(jìn)因素。既往的研究結(jié)果提示姜黃素可抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[8]，然而姜黃素對肝癌細(xì)胞相關(guān)性星狀細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先通過組織消化培養(yǎng)法，從新鮮切取的肝細(xì)胞癌組織內(nèi)成功提取到活化的肝星狀細(xì)胞。對新鮮提取的肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞，分別給予不同終濃度姜黃素處理后發(fā)現(xiàn)，相較0 μM組，5 μM組、10 μM組、20 μM組、40 μM組的肝星狀細(xì)胞增殖性均明顯下降，并且呈一定的濃度依耐性和時(shí)間依耐性，以10 μM組、20 μM組的干預(yù)效率最佳。進(jìn)一步利用Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較0 μM組，10 μM組、20 μM組的肝星狀細(xì)胞侵襲性顯著被抑制。既往已有大量研究證實(shí)MMP-2可顯著提高HSC、肝癌細(xì)胞等的侵襲力，相反TIMP-1、層粘連蛋白則抑制HSC的侵襲轉(zhuǎn)移能力。與此相吻合的是,本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)給予10 μM或者20 μM姜黃素處理后，比起0 μM處理組，肝星狀細(xì)胞內(nèi)MMP-2表達(dá)下調(diào),而TIMP-1、層粘連蛋白表達(dá)上調(diào)。I 型膠原為肝星狀細(xì)胞合成分泌的重要細(xì)胞外基質(zhì)成分，本實(shí)驗(yàn)中我

們注意到,相較對照組,姜黃素干預(yù)組HSC合成分泌的I 型膠原蛋白明顯增加；此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示姜黃素同樣可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞組織內(nèi)HSC合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分的功能,與姜黃素對肝纖維化、肝硬化組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞發(fā)揮的作用保持一致。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素可以抑制肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞的增殖,并降低其侵襲能力,該作用可能與調(diào)控侵襲相關(guān)分子MMP-2、TIMP-1、I 型膠原、層粘連蛋白等的表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 高姍.上海市區(qū)原發(fā)性肝癌的流行病學(xué)研究[D].復(fù)旦大學(xué),2011.

[2] Yang JD,Nakamura I,Roberts LR.The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma: current status and therapeutic targets[J]. Semin Cancer Biol,2011,21(1)：35-43.

[3] 吳宏，閆國誠，王雙全,等.姜黃素對胃癌細(xì)胞放療增敏作用的研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2014,43(2)：137-139.

[4] Tacke F,Weiskirchen R.Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2012,6(1):67-80.

[5] 鄭旭銳,樊英華,韋永紅,等.姜黃素對肝星狀細(xì)胞JAK2-STAT3信號通路的影響[J].陜西中醫(yī),2013,34(9)： 151-152.

[6]Amann T,Bataille F,Spruss T,etal.Activated hepatic stellate cells promote tumorigenicity of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009,100(4):646-653.

[7]苗久旺,張欽德.姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號途徑研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī),2014,35(12)：1692-1694.

[8]趙景潤.姜黃素對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響的初步研究[D] .暨南大學(xué),2004.

(收稿：2015-12-18)

【中圖分類號】R737.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.003

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30371398)