康萊特對晚期乳腺癌患者血清miRNA- 21的影響研究

汪霄浙江省人民醫(yī)院腫瘤內科，浙江杭州　310024

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康萊特對晚期乳腺癌患者血清miRNA- 21的影響研究

汪霄
浙江省人民醫(yī)院腫瘤內科，浙江杭州310024

[摘要]目的明確康萊特注射液對晚期乳腺癌患者血清miRNA-21水平的影響，為康萊特注射液在晚期乳腺癌患者中的療效提供更充分的證據。方法2014年7月～2015年7月期間，收集82例晚期乳腺癌患者的詳細資料及血清樣本?；颊邞谜憬等R特藥業(yè)有限公司提供的康萊特注射液200 mL靜滴，1次/d，治療21 d。收集患者治療后的血清樣本。比較治療前后患者KPS評分、體重以及血清中miRNA-21檢測值的變化。結果在82例晚期乳腺癌患者中，65.9% KPS評分提高，58.5%體重增加，康萊特注射液治療后患者血清中miRNA-21（2.02±0.12）表達明顯低于治療前（3.64±0.31）（P＜0.05）。結論康萊特注射液明顯降低晚期乳腺癌患者血清miRNA-21的水平，為康萊特注射液在晚期乳腺癌患者中的療效提供客觀的證據。

[關鍵詞]乳腺癌；康萊特；miRNA-21；晚期

乳腺癌是全世界范圍內女性常見的惡性腫瘤之一，美國癌癥協(xié)會報道，美國每年有12萬乳腺癌新發(fā)病例，發(fā)病率約為72.2/10萬。我國雖然屬于乳腺癌的低發(fā)病率國家，但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，年增長率達到2%，在城市，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤[1]。晚期乳腺癌患者往往由于一般情況差、卡氏評分低、惡病質等原因不能耐受化放療，僅以姑息治療為主。如何有效改善晚期乳腺癌患者的生活質量、延長生存期已成為晚期乳腺癌治療中的重要部分?？等R特的有效抗癌成分是從中藥薏苡仁中提取，從而制成中藥注射劑。近年來，國內有相關文獻報道康萊特注射液可以改善晚期惡性腫瘤患者的生活質量[2]。但研究結果缺乏客觀的指標支持，無法從客觀的生物分子水平論證其有效性。本研究通過對晚期乳腺癌患者使用康萊特注射液前后對血清中miRNA-21值進行比較，明確康萊特注射液對晚期乳腺癌患者的作用，為康萊特注射液在晚期乳腺癌患者中的療效提供更充分的依據，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年7月～2015年7月我院診治的82例患者，均為女性，年齡40～69歲，平均52.6歲。經過手術病理或穿刺病理確診為乳腺癌，腫瘤分期為Ⅳ期，無法耐受放化療；治療前Karnofsky評分均≥40分，且停止其他治療已1個月以上。

1.2研究方法

收集82例晚期乳腺癌患者的詳細資料及血清樣本?；颊邞谜憬等R特藥業(yè)有限公司提供的康萊特注射液200 mL靜滴，1次/d，治療21 d。收集患者治療后的血清樣本?？等R特治療前后對患者進行Karnofsky評分，治療前后測量患者體重，康萊特治療過程中觀察不良反應。比較康萊特治療前后血清miRNA-21值。

1.3mi RNA-21測定

血清分裝后儲存于-80℃。對收集血清樣本進行RNA提取。在進行血清miRNA-21定量前，首先需要選擇一種合適的內參。由于目前尚無公認可用于miRNA相對定量的內參，因此，我們采用加入外源miRNA-cel-miRNA-39作為內參的方法，此miRNA不在人類表達。用Taqman miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA特異性頸環(huán)結構進行反轉錄。將相關試劑于冰上解凍；以提取的小RNA為模版進行逆轉錄反應；待反應結束后，產物保存在4℃，準備進行q PCR分析。

熒光定量PCR檢測miRNA-21。計算每種反應組分的用量，每個指標做3管重復：選用的Taq ManRMicroRNA Human Assays為：hsa-miR-21，目標序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT -GGATATTCGCACTGGATACGCTCAAC；創(chuàng)建相對定量的反應板文件。

1.4觀察指標

觀察Karnofsky評分、體重值、不良反應情況及miRNA-21值。

1.5評價標準

1.5.1Karnofsky（KPS）評分康萊特治療前后，對患者進行Karnofsky（KPS）評分，如果治療后比治療前評分增加20分以上，為顯著改善；如果治療后比治療前評分增加10～20分，為改善；評分沒有增加，為穩(wěn)定；評分減少10分以上，為減退。

1.5.2體重康萊特治療后與治療前相比，體重增加2.5 kg以上，為體重增加；治療后與治療前相比，減少2.5 kg以上，為體重下降；如果增加或減少都沒有超過2.5 kg，為穩(wěn)定。

1.5.3不良反應按WHO藥物毒性分級標準評價不良反應。

1.6統(tǒng)計學方法

本研究采用2-ΔΔCt法分析樣本miRNA-21的表達量。采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，樣本miRNA-21的表達水平以（±s）表示，采取獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1治療前后Karnofsky（KPS）評分比較

康萊特治療前，患者的KPS評分主要處于40～59分的區(qū)間內，平均分值為47.2分。而康萊特治療后，患者的KPS評分的平均分值上升到60.9分，整整提高13.7分，而治療后評分主要處于50～69分的區(qū)間內。其中，改善31例，顯著改善23例，穩(wěn)定26例，減退2例。使用康萊特后，KPS評分得到提高患者共有54例，占總人數的65.9%。見表1。

表1　康萊特治療前后患者KPS評分比較（n）

2.2體重值

患者在康萊特治療前的平均體重值為53.1 kg，康萊特治療后的平均體重值為57.5 kg。其中，體重增加48例（58.5%），體重穩(wěn)定28例（34.1%），體重下降6例（7.3%）?？等R特注射液能夠改善患者食欲及一般情況，使患者體重增加。

2.3不良反應

按WHO藥物毒性分級標準評價，研究中所有患者均沒有心電圖、肝功能、腎功能的改變，也沒有發(fā)現任何過敏反應。只有1例患者發(fā)現輕度靜脈炎，對癥處理后好轉。

2.4康萊特注射液治療前后患者血清中miRNA-21變化

康萊特注射液治療后患者血清中miRNA-21 （2.02±0.12）表達明顯低于治療前（3.64±0.31）（t=2.19，P=0.027）。

3　討論

臨床研究表明，康萊特注射液是一種安全有效的廣譜抗癌新藥，而且能提供機體的免疫力，不良反應小，療效顯著[3]。但其抗腫瘤的機制仍亟待深入、系統(tǒng)的研究。

微小RNA（microRNA/miRNA）是一類內源性、非編碼的單鏈小分子RNA[4]。近年來，高通量芯片檢測技術以及高靈敏度實時反轉錄PCR（real-time RTPCR）技術得到了廣泛的應用，研究者們發(fā)現miRNA的高低水平和許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后存在密切的關系，在一些研究中，發(fā)現miRNA同時也發(fā)揮了重要的調控作用。失調的miRNA作為癌癥診斷、預后及治療相關的標記物的作用越來越受到重視。

有學者[5]通過一種叫微陣列的芯片，于2005年第一次從乳腺癌組織及細胞株中篩選出miRNA譜，其中發(fā)現在這些異常表達的miRNA譜中，29條miRNA表現為表達失調，在表達失調的miRNA中，有12條的表達下調，具體來說，miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-21以及miRNA-155這4種miRNA的變化最為明顯。相關研究還發(fā)現，有一些miRNAs的表達失調和乳腺癌的相關分子病理特征及類型明顯相關，其中包括ER、PR受體情況、腫塊體積、脈管是否侵犯、Ki67等；除此之外，通過其中15條miRNAs的表達情況，我們完全可以把正常的細胞組織和相關癌組織明確區(qū)分開。Mattie等[6]使用相同的方法檢測20個乳腺癌活檢標本的miRNA表達譜，研究發(fā)現，通過miRNA表達譜，能夠把HER-2及激素受體情況不同的分子分型的乳腺癌區(qū)分開。而我們都知道，分子分型不同的乳腺癌，它們具有完全不同的預后和治療手段，各種治療的組合情況也大不相同。近年來，有進一步的研究[7]證明；miRNA表達譜可以區(qū)分乳腺癌的五種分子亞型，而我們知道，各種乳腺癌的分子亞型與其預后及對不同治療方案的反應都是密切相關，證明通過miRNA表達譜可以幫助我們進行臨床決策。通過研究，Tavazoie等[8]篩選出多個乳腺癌MDA-MB-231衍生細胞株，這些細胞株具有較強的遠處轉移特性。同時，研究者也觀察到，乳腺癌的遠處轉移與miRNA的異常表達也是有緊密關系的，其中有兩種miRNA在抑制腫瘤遠處轉移中發(fā)揮非常重要的作用；如果乳腺癌患者中的這兩種miRNA表達缺失或較低，其發(fā)生轉移的可能性大，生存率也較別的乳腺癌患者要低得多。綜上所述，miRNA具有重要的價值，不管是對乳腺癌患者的預后判斷，還是在乳腺癌患者的治療選擇中，均起非常重要的作用。

文獻表明，在結腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中，miRNA-21的表達存在上調[9]，這也表明miRNA-21對腫瘤的作用具有普遍性。而目前有很多的相關研究已經證明，miRNA-21作為一個癌基因[10]，它在多種實體腫瘤中，都有著非常重要的價值。在乳腺癌的細胞系、組織以及血清中，miRNA-21的表達上調，并且它還和乳腺癌的臨床分期以及相關預后有密切的關系，可作為乳腺癌治療效果的觀察指標[11]。

近年來人們發(fā)現血清中可以檢測出miRNA，且表達穩(wěn)定，相比較腫瘤組織中miRNA檢測技術復雜、創(chuàng)傷大的問題，外周血血清較容易取得和檢測，應用方便。在血清中，miRNA能夠較長時間的穩(wěn)定存在，并且，它也能耐RNA酶的降解，在各種環(huán)境（包括將其煮沸、反復凍融、酸堿侵蝕等）下都不會有損失[12]?？等R特是雙相廣譜的抗腫瘤藥物之一，它沒有細胞毒性，以往的研究認為，康萊特可以讓腫瘤細胞停滯于G2-M期，并誘導細胞凋亡[13]。也有文獻提出，康萊特注射液可以顯著改善惡性腫瘤患者的食欲，并提高患者的KPS評分[14]。國內有文獻報道，康萊特注射液能抑制下游cyclin D1、cyclin E表達，并阻止腫瘤細胞進入S期，這是其增殖抑制的相關機制[15]。有相關研究指出，康萊特注射液能夠抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，并且阻滯其細胞周期，從而使癌細胞出現凋亡，其相關機制可能是降低Bcl－2蛋白的表達以及增加Bax蛋白的活性[16]。在臨床工作中，康萊特聯合新輔助化療可以減輕局部晚期乳腺癌患者骨髓抑制，提高免疫功能和化療耐受性[17]。同時，也可以提高這類患者的化療有效率，相關機制也許是下調ki-67、Survivin的表達[18]。目前，國內尚未有關于康萊特注射液對血清miRNA-21水平影響方面的研究。通過本研究明確康萊特注射液對晚期乳腺癌患者血清miRNA-21的影響，使miRNA-21明顯下降，為康萊特注射液在晚期乳腺癌患者中的療效提供更充分的依據。

本研究結束后，我們將進一步探討miRNA-21在乳腺癌中通過作用于哪些靶基因發(fā)生作用，為進一步闡明乳腺癌發(fā)病機制奠定作用，為尋找新的潛在的分子治療靶點提供依據。

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Study on the effect of kanglaite injection on serum miRNA-21 in patients with advanced breast cancer

WANG Xiao
Oncology Department, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310024, China

[Abstract]Objective To make clear the effect of kanglaite injetion on patients with advanced breast cancer serum miRNA-21 levels, providing more sufficient evidence for the effort of Kanglaite Injetion in patients with advanced breast cancer. Methods From July 2014 to July 2015, 82 cases of advanced breast cancer with detailed information and serum samples were collected. Kanglaite injetion was from Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co. Ltd and were provided 200 mL intravenous drip,1 time/day, 21 days of treatment. Serum samples were collected from patients after treatments. For KPS score, weight and values of miRNA-21 detecion in the serum of patients before and after the change, the effect of Kanglaite injetion in the treatment of patients with advanced breast cancer were investigated. Results In 82 patients with advanced breast cancer, the 65.9% KPS score increased, and the 58.5% body weight increased, of Kanglaite injetion in the treatment of patients with serum of miRNA-21(2.02±0.12) expression was significantly lower than that before treatment(3.64±0.31)(P＜0.05). Conclusion The level of miRNA-21 in serum of patients with advanced breast cancer is decreased significantly by Kanglaite injetion, providing objective evidence for effort of Kanglaite injetion in patients with advanced breast cancer.

[Key words]Breast cancer; Kanglaite; miRNA-21; Advanced

[中圖分類號]R737.9

[文獻標識碼]B

[文章編號]1673-9701（2016）03-0070-03

[基金項目]浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目一般研究項目（2015 KYB032）

收稿日期：（2015-11-11）