miR-21在川崎病急性期患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

賈連紅，潘璐璐，盧家程，耿志敏，吳蓉洲，褚茂平

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　兒童中心，浙江　溫州　325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院　兒童心臟中心，溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江　溫州　325027）

?

miR-21在川崎病急性期患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

賈連紅1，潘璐璐2，盧家程1，耿志敏1，吳蓉洲2，褚茂平2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒童中心，浙江溫州325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童心臟中心，溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325027）

［摘 要］目的：探討micrRNA-21（miR-21）在川崎病（KD）患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院2014年1月-2015年6月收治的33例KD患者以及15例健康體檢者的血清標(biāo)本，以 cel-miR-39為外參基因，通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測血清miR-21的表達(dá)，并通過受試者工作特征（ROC）曲線評估其作為KD疾病標(biāo)記物的診斷價(jià)值。結(jié)果：miR-21在KD急性期患兒血清中表達(dá)水平明顯高于健康兒童血清（P＜0.05），恢復(fù)期則降低至正常水平。ROC曲線顯示，以miR-21診斷KD的曲線下面積（AUC）為0.736（95%CI：0.531～0.941），當(dāng)臨界值（診斷閾值）取1.09時(shí)，其診斷靈敏度和特異度分別為0.846和0.714。血清miR-21表達(dá)與KD臨床特征相關(guān)分析顯示，高血小板水平血清中miR-21表達(dá)更高。結(jié)論：KD患者血清miR-21水平顯著升高，可能是KD診斷的潛在血清標(biāo)志物之一。

［關(guān)鍵詞］川崎?。籱icroRNA-21；疾病診斷

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種主要發(fā)生在5歲以下嬰幼兒的急性發(fā)熱出疹性疾病，其主要病理改變?yōu)槿矸翘禺愋匝苎?，其中冠狀動脈損害（coronary artery lesion，CAL）是KD嚴(yán)重并發(fā)癥，已取代風(fēng)濕熱成為兒童后天性心臟病的主要病因［1-2］。由于KD的病因未明、發(fā)病機(jī)制不清，因此早期診斷并規(guī)范治療對降低KD冠狀動脈并發(fā)癥極為重要。然而，目前臨床上對KD的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)［3-4］，缺乏特異性的檢驗(yàn)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，血清中游離存在的miRNA是多種疾病新的生物標(biāo)志。為此本研究選擇與多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的microRNA-21（miR-21），測定其在KD急性期血清中的表達(dá)水平，探討miR-21在KD診斷中的臨床價(jià)值。

1　資料和方法

1.1一般資料 選擇溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院2014年1月-2015年6月確診并收治的KD患兒33例，診斷依據(jù)美國兒童心臟協(xié)會制定的標(biāo)準(zhǔn)［5］，其中男25例，女8例，年齡均為5歲以下，平均（25.6±18.6）月，經(jīng)超聲心動圖檢測，存在冠狀動脈擴(kuò)張或動脈瘤病變，即CAL（+）13例，無冠狀動脈病變，即CAL（-）20例；KD恢復(fù)期組兒童均為急性期治療后兒童，共15例，其中男11例，女4例，平均年齡（21.8±18.7）月。選擇同期門診體檢健康兒童15例，其中男11例，女4例，年齡均為5歲以下，平均（20.4±9.9）月，排除肺、肝、腎、腦等重大疾病。各組研究對象的年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。臨床資料見表1。

表1　3組研究對象臨床資料（±s）

表1　3組研究對象臨床資料（±s）

D-二聚體（μg/mL）男女性別（n/%）組別　例數(shù)　年齡（月）　白細(xì)胞（×109/L）血小板（×109/L）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L）谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L）健康兒童　15　11/73.3　4/26.7　20.4± 9.9　8.17±2.59　341.5± 71.52　20.58±　9.81　37.35±　6.32　0.39±0.19 KD恢復(fù)期　15　11/73.3　4/26.7　21.8±18.7　8.27±2.63　582.31±126.09 60.73± 61.88　63.54± 31.40　0.84±0.66 KD急性期CAL（+）13　10/76.9　3/23.1　26.4±18.1　18.98±9.30 421.50±117.36 70.71± 58.96　50.21± 49.90　1.27±0.97 CAL（-）　20　15/75.0　5/25.0　24.6±19.2　14.86±5.39 395.40±121.40 75.27±115.32 58.47±129.28　1.48±1.16

1.2主要試劑與儀器 Tri-reagent-BD購自美國Sigma公司；miScript II RT Kit、miScript Primer Assay、miScript SYBRGreen PCR Kit購自QIAGEN公司；外參cel-miR-39由上海吉瑪公司合成。定量PCR儀器為Bio-Rad的C1000 Touch Thermal Cycler。

1.3RNA提取和miR-21表達(dá)檢測 所有兒童抽取空腹靜脈血2 mL，經(jīng)3 000 r/min離心10 min分離血清，經(jīng)12 000 r/min高速離心15 min去除細(xì)胞碎片，取上層血清200 μL，加入750 μL Trizol劇烈震蕩后加入等量外參，冰上放置15 min后加入200 μL氯仿劇烈震蕩30 s，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min后，取上清350 μL于新去RNase的EP管內(nèi)，加入等量異丙醇-20 ℃過夜后，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，棄上清后加入1 mL 80%乙醇洗滌，離心后加入15 μL DEPC水溶解RNA，利用miScript II RT Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模版，在C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀上，利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）對miR-21進(jìn)行定量檢測。按照試劑盒說明書，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 15 min，95 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有樣品均做3個(gè)平行孔，循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。以cel-miR-39為外參，miR-21的相對表達(dá)量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct外參基因。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較KD患兒與健康兒童血清miR-21表達(dá)的差異，采用配對t檢驗(yàn)比較KD患兒急性期與恢復(fù)期血清miR-21表達(dá)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析和曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）評估血清miRNA作為疾病診斷標(biāo)記物的價(jià)值。

2　結(jié)果

2.1miR-21在KD患者血清中表達(dá)分析 由于KD血清miRNA定量檢測目前尚無適宜的內(nèi)參基因，為此本研究選用與人無同源性的線蟲cel-miR-39作為外參照。結(jié)果顯示，KD急性期、健康兒童及KD恢復(fù)期血清miR-21表達(dá)水平分別為3.04±1.76、1.13± 0.89及1.75±1.14，KD急性期患兒血清miR-21表達(dá)水平明顯高于健康對照兒童（P＜0.05），而疾病恢復(fù)期即下降至接近健康兒童水平。

2.2血清miR-21作為KD疾病診斷的評價(jià) 利用R軟件制作ROC曲線，評價(jià)miR-21在KD中的診斷價(jià)值。如圖1所示，血清miR-21診斷KD的ROC曲線的AUC為0.736（95%CI：0.531～0.941），當(dāng)臨界值（診斷閾值）取1.09時(shí)，其靈敏度為0.846，特異度為0.714，具有較好的診斷價(jià)值。

2.3血清miR-21表達(dá)水平與KD臨床特征關(guān)系 進(jìn)一步分析血清miR-21相對表達(dá)量與KD患兒臨床特征的關(guān)系，結(jié)果如表2所示，miR-21在血小板計(jì)數(shù)高于300×109/L的兒童血清中的表達(dá)明顯高于血小板計(jì)數(shù)正常兒童的血清（P＜0.05），而在其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將33例KD患兒按照有無CAL進(jìn)行分類，分析發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)在有無CAL中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　血清miR-21對KD急性期診斷作用的ROC曲線

表2　miR-21與KD臨床特征相關(guān)性分析（n=33，±s）

表2　miR-21與KD臨床特征相關(guān)性分析（n=33，±s）

臨床特征　miR-21　P白細(xì)胞（×109/L）5～12　3.90±2.65　0.297 ＞12　2.26±2.18血小板（×109/L）100～300　0.91±1.21　0.041 ＞300　3.47±2.22谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L）7～40　2.63±2.11　0.988 ＞40　2.65±2.60谷草轉(zhuǎn)氨酶（U/L）13～35　2.46±1.98　0.776 ＞35　2.84±2.79 D-二聚體（μg/mL）0～0.5　1.02±0.98　0.297 ＞0.5　2.93±2.36 CAL （-）　2.93±7.05　0.839 （+）　2.50±3.44

3　討論

KD，又稱為黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，由日本的川崎富首次報(bào)道，是一種以全身中小血管炎為主要病變的急性全身出疹性免疫性疾病，主要累及中小動脈，尤其是冠狀動脈，雖然醫(yī)學(xué)診療技術(shù)不斷發(fā)展，以丙種球蛋白為主的綜合治療方案取得了一定的效果，但仍有部分KD患者診斷不及時(shí)，導(dǎo)致并發(fā)嚴(yán)重冠狀動脈病變。因此及時(shí)診斷KD，是預(yù)防冠狀動脈并發(fā)癥的最佳手段。

miRNA在心血管中的研究屢見不鮮。Fish等［6］發(fā)現(xiàn)，miR-126在血管發(fā)育過程中，尤其是在保持血管的完整性和血管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Mitchell等［7］證實(shí)血清中存在豐富而且穩(wěn)定的miRNA，這些miRNA不易被血清中的RNase降解，而血清標(biāo)本易于取得，且對患兒的損傷小，其作為生物標(biāo)記物具有明顯優(yōu)勢。血清中miR-29a和miR-92a的表達(dá)情況對結(jié)直腸癌的早期診斷具有一定價(jià)值［8］。而miRNA在KD中的研究報(bào)道較少，2013年，Shimizu等［9］首次報(bào)道差異表達(dá)的miR-145可能通過TGF-β通路參與KD的發(fā)生。Yun等［10］通過芯片發(fā)現(xiàn)，與健康兒童比較，KD患兒血清中存在特異相關(guān)的miRNAs，如miRNA-200c和miRNA-371-5p。Rowley等［11］認(rèn)為miRNA可能成為KD的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Ni等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155、miR-21和miR-31能夠調(diào)控Treg細(xì)胞基因的表達(dá)從而參與KD的發(fā)生。

miR-21在心血管病中的作用備受關(guān)注。Zhou等［13］發(fā)現(xiàn)，miR-21參與了血管炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Li等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-21能夠通過靶向AP-1調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而參與血管疾病的發(fā)生。另外，miR-21在動脈粥樣硬化循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）中呈高表達(dá)，能夠通過TGF-β通路影響EPCs的增殖［15］，動脈粥樣硬化斑塊中miR-21亦呈高表達(dá)狀態(tài)［16］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-21可以通過對肌球蛋白的作用而影響平滑肌的功能［17］，肺動脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)過低氧處理后miR-21表達(dá)升高［18］。Ji等［19］證實(shí)，在損傷的血管中miR-21表達(dá)增高，而抑制miR-21表達(dá)后，血管損傷程度有所減輕。剪切力是引起血管損傷的常見因素，當(dāng)剪切力作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)量升高［20-21］。由此可見，miR-21在多種心血管疾病中發(fā)揮一定作用，有望成為心血管疾病治療新的靶點(diǎn)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a在KD急性期血清中表達(dá)上調(diào)，并且對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長及遷移有一定影響［22］，提示miR-23a的異?？赡軈⑴cKD內(nèi)皮細(xì)胞的損傷過程。本課題組還發(fā)現(xiàn)，與健康兒童比較，KD外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的miR-130a和miR-125b存在差異表達(dá)，證實(shí)miR-130a和miR-125b可能參與了KD的發(fā)生與發(fā)展，可以作為KD診斷及預(yù)后評估的一項(xiàng)新的生物標(biāo)志物［23］。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-21在KD患者血清中的表達(dá)明顯升高，將血清miR-21作為KD診斷指標(biāo)，其靈敏度和特異度均大于70%。但本研究所納入樣本量有限，仍存在偶然誤差的可能，其靈敏度和特異度以及臨界值的選擇還需在大樣本量的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 杜忠東， 梁璐， 孟曉萍， 等. 1995-1999年北京住院小兒川崎病流行病學(xué)調(diào)查［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志， 2003， 83（21）︰ 38-42.

［2］ 張永蘭， 杜忠東， 趙地， 等. 2000-2004年北京川崎病住院患兒流行病學(xué)調(diào)查［J］. 實(shí)用兒科臨床雜志， 2007， 22（1）︰ 12-15.

［3］ YIM D， CURTIS N， CHEUNG M， et al. An update on Kawasaki disease II︰ clinical features，diagnosis， treatment and outcomes ［J］. J Paediatr Child Health， 2013， 49（8）︰ 614-623.

［4］ AYUSAWA M， SONOBE T， UEMURA S， et al. Revision of diagnostic guidelines for Kawasaki disease （the 5th revised edition）［J］. Pediatr Int， 2005， 47（2）︰ 232-234.

［5］ NEWBURGER J W， TAKAHASHI M， GERBER M A， et al. Diagnosis， treatment， and long-term management of Kawasaki disease︰ a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever， Endocarditis， and Kawasaki Disease， Council on Cardiovascular Disease in the Young，American Heart Association［J］. Pediatrics， 2004， 114（6）︰1708-1733.

［6］ FISH J E， SANTORO M M， MORTON S U， et al. miR-126 regulates angiogenic signaling and vascular integrity［J］. Dev Cell， 2008， 15（2）︰ 272-284.

［7］ MITCHELL P S， PARKIN R K， KROH E M， et al. Circulation microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2008， 105（30）︰10513-10518.

［8］ HUANG Z， HUANG D， NI S， et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer［J］. Int J Cancer， 2010， 127（1）︰ 118-126.

［9］ SHIMIZU C， KIM J， STEPANOWSKY P， et al. Differential expression of miR-145 in children with Kawasaki disease［J］. PloS One， 2013， 8（3）︰ e58159.

［10］ YUN K W， LEE J Y， YUN S W， et al， et al. Elevated serum level of microRNA （miRNA）-200c and miRNA-371-5p in children with Kawasaki disease ［J］. Pediatr Cardiol， 2014，35（5）︰ 745-752.

［11］ ROWLEY A H， PINK A J， REINDEL R， et al.A study of cardiovascular miRNA biomarkers for Kawasaki disease［J］. Pediatr Infect Dis J， 2014， 33（12）︰ 1296-1299.

［12］ NI F F， LI C R， LI Q， et al. Regulatory T cell microRNA expression changes in children with acute Kawasaki disease［J］. Clin Exp Immunol， 2014， 178（2）︰ 384-393.

［13］ ZHOU J， WANG K C， WU W， et al. MicroRNA-21 targets peroxisome proliferators-activated receptor-alpha in an autoregulatory loop to modulate flow-induced endothelial infl ammation ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108（25）︰10355-10360.

［14］ LI Y， YAN L， ZHANG W， et al. MicroRNA-21 inhibits platelet-derived growth factor-induced human aortic vascular smooth muscle cell proliferation and migration through targeting activator protein-1［J］. Am J Transl Res， 2014， 6（5）︰507-516.

［15］ ZUO K， LI M， ZHANG X， et al. MiR-21 suppresses endothelial progenitor cell proliferation by activating the TGF-beta signaling pathway via downregulation of WWP1［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8（1）︰ 414-422.

［16］ RAITOHARJU E， LYYTIKAINEN L P， LEVULA M， et al. miR-21， miR-210， miR-34a， and miR-146ab are up-regulated in human atherosclerotic plaques in the Tampere Vascular Study［J］. Atherosclerosis， 2011， 219（1）︰ 211-217.

［17］ WANG M， LI W， CHANG G Q， et al. MicroRNA-21 regulates vascular smooth muscle cell function via targeting tropomyosin 1 in arteriosclerosis obliterans of lower extremities［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2011， 31（9）︰ 2044-2053.

［18］ SARKAR J， GOU D， TURAKA P， et al. MicroRNA-21 plays a role in hypoxia-mediated pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and migration［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2010， 299（6）︰ L861-L871.

［19］ JI R， CHENG Y， YUE J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation ［J］. Circ Res， 2007， 100（11）︰ 1579-1588.

［20］ ROY S， KHANNA S， HUSSAIN S R， et al. MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction︰ miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue［J］. Cardiovasc Res， 2009， 82（1）︰ 21-29.

［21］ CHENG Y， ZHU P， YANG J， et al. Ischaemic preconditioning-regulated miR-21 protects heart against ischaemiareperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4［J］. Cardiovasc Res， 2010， 87（3）︰ 431-439.

［22］ 褚茂平， 胡晨， 周愛華， 等. 川崎病血清特異相關(guān)miR-23a對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長及遷移的影響［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 45（5）︰ 321-326.

［23］ 褚茂平， 周愛華， 胡晨， 等. miR-130a和miR-125b在川崎病外周血細(xì)胞中的表達(dá)及意義［J］. 浙江醫(yī)學(xué)， 2015， 37（5）︰357-362.

（本文編輯：丁敏嬌）

Expression of miR-21 in patients with the acute phase of Kawasaki disease and its clinical signifi cance

JIA Lianhong1， PAN Lulu2， LU Jiacheng1， GENG Zhimin1， WU Rongzhou2， CHU Maoping2. 1.Department of Children’s Center， the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Children’s Heart Center， the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital， Institute of Cardiovascular Development & Translational Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To study the expression of miR-21 in the serum of patients with Kawasaki disease and its clinical signifi cance. Methods： Thirty-three cases of Kawasaki disease and 15 healthy control were collected from the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University in 2014 and 2015. With cel-miR-39 as the external reference gene， the expression of miR-21 was detected with realtime quantitative PCR， and its signifi cance as a marker in diagnosis was evaluated by ROC curve. Results： The expression of miR-21 in serum of KD patients was signifi cantly higher than that in the healthy control group （P＜0.05）， and return to normal level after treatment. ROC curve indicated miR-21 had a sensitivity of 84.6% and a specifi city of 71.4% for distinguishing KD patients from healthy children with an area under the curve （AUC）were 0.736 （95%CI︰ 0.531～0.941）. Further analysis of the clinical pathological features indicated that the level of serum miR-21was associated with PLT. Conclusion： Serum miR-21 level is signifi cantly elevated in KD patients， it may be used as a potential biomarker in diagnosis of KD.

Key words：Kawasaki disease； microRNA-21； disease diagnosis

［中圖分類號］R725.4

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.005

收稿日期：2016-01-22

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12H02003）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012ZDA035）；浙江省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（2015C33163）。

作者簡介：賈連紅（1988-），女，河北三河人，碩士生。

通信作者：褚茂平，主任醫(yī)師，Email：chmping@hotmail.com。