生長抑制因子4在人胃癌中的表達(dá)及其意義

程海燕，沈哲，陳衛(wèi)昌，嚴(yán)蘇

（1.紹興第二醫(yī)院　消化內(nèi)科，浙江　紹興　312000；2.蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院　消化內(nèi)科，江蘇蘇州　215006）

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生長抑制因子4在人胃癌中的表達(dá)及其意義

程海燕1，沈哲1，陳衛(wèi)昌2，嚴(yán)蘇2

（1.紹興第二醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江紹興312000；2.蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇蘇州215006）

［摘 要］目的：探討多種人胃癌細(xì)胞株中及胃癌組織中生長抑制因子4（ING4）的表達(dá)及其意義。方法：體外培養(yǎng)3種分化不同的胃癌細(xì)胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜細(xì)胞GES-1，收集紹興第二醫(yī)院病理科40例原發(fā)胃癌患者的石蠟標(biāo)本。以RT-PCR、Western Blot法分別檢測4種細(xì)胞株ING4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織及癌旁組織中ING4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：SGC-7901、BGC-823組中ING4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較MKN-1、GES-1組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BGC-823組中ING4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較SGC-7901組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MKN-1組與GES-1組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。胃癌組織中ING4表達(dá)陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：ING4作為抑癌基因參與了胃癌的發(fā)生，且與胃癌分化程度有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］生長抑制因子4；胃癌細(xì)胞系；反轉(zhuǎn)錄PCR；蛋白質(zhì)印跡法；免疫組織化學(xué)法

生長抑制因子4（inhibitor of growth family member4，ING4）是由Shiseki等人發(fā)現(xiàn)的生長抑制因子家族的新成員，它是一種重要的抑癌因子。目前研究認(rèn)為，ING4屬胞內(nèi)蛋白，在人類正常組織中均有表達(dá)，而在多數(shù)腫瘤中出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平下降［1-2］。本實(shí)驗(yàn)主要檢測ING4 mRNA及其蛋白在不同分化的胃癌細(xì)胞及胃癌組織中的表達(dá)水平，探討其可能的表達(dá)機(jī)制及臨床意義。

1　材料和方法

1.1材料 胃癌細(xì)胞MKN-1（高分化）、SGC-7901（中分化）、BGC-823（低分化）以及人胃黏膜細(xì)胞GES-1均為蘇州大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室惠贈。收集紹興第二醫(yī)院病理科40例原發(fā)胃癌患者的石蠟標(biāo)本，依照病理科提供的資料進(jìn)行癌組織及癌旁組織分類，患者年齡40～84歲。RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，ING4、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，ING4一抗購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：不同細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為5% CO2，37 ℃，細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶后，分別收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞4×106個，將實(shí)驗(yàn)分為GES-1、MKN-1、SGC-7901、BGC-823組。

1.2.2RT-PCR檢測ING4 mRNA表達(dá)：用Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA。4 μg無DNA的總RNA反轉(zhuǎn)錄（mRNA至cDNA），PCR反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行。該體系含有cDNA 2.0 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，ING4及β-action的上、下游引物（由primer 5軟件設(shè)計(jì)，南京金斯瑞生物科技公司合成）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0．2 μL。擴(kuò)增基因的引物序列：ING4上游引物序列5’-GCGTCG ACATGGATGATGGGATGTATTTGGAAC-3’，下游引物序列為5’-GCAAGCTTCTATTTCTTCCGTTCTTGGGAG-3’，擴(kuò)增片段248 bp。用β-actin作為內(nèi)參照，上游引物為5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’，下游引物序列為5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，其預(yù)測的產(chǎn)物長度為183 bp。PCR擴(kuò)增的條件均為94 ℃預(yù)變性5 min，繼而95 ℃ 20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在含10 mg/mL 2.5 μL溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后用凝膠成像分析儀開始攝像分析。最后用UVISOFT軟件處理數(shù)據(jù)，將目的條帶與內(nèi)參條帶的平均灰度之比作為目的基因表達(dá)的相對含量。

1.2.3Western Blot檢測ING4蛋白表達(dá)：4組各取5×105個細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取40 μg總蛋白制樣，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，用TBST配制的5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，再用l︰1 000稀釋的一抗37 ℃搖床孵育1 h以上，l︰10 000稀釋的二抗室溫孵育3 h，將膜放入盛有TBST的平皿中進(jìn)行洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑溫浴20 min后曝光、顯影和定影，對結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析（明基5000掃描儀），與對照組結(jié)果進(jìn)行對比。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測胃癌組織中ING4蛋白的表達(dá)：將40例胃癌組織及癌旁組織的蠟塊，進(jìn)行ING4抗體的免疫組織化學(xué)檢測。具體步驟參照酶底物顯色劑（AEC-0037）說明書進(jìn)行。在×40視野下觀察標(biāo)本。ING4蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕褐色或深棕色顆粒。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s或百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測各組細(xì)胞ING4 mRNA的表達(dá) GES-1組、MKN-1組、SGC-7901組、BGC-823組細(xì)胞ING4 mRNA平均表達(dá)強(qiáng)度分別為：0.46±0.15、0.44± 0.11、0.32±0.08、0.23±0.04，隨著胃癌細(xì)胞的分化程度降低、惡性程度升高，ING4 mRNA表達(dá)逐漸下降，其中BGC-823組、SGC-7901組分別與GES-1細(xì)胞組比較ING4 mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），MKN-1細(xì)胞組與GES-1細(xì)胞組比較ING4 mRNA表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖1）。

圖1　4種細(xì)胞ING4 mRNA表達(dá)情況

2.2Western Blot檢測各組細(xì)胞ING4蛋白的表達(dá) GES-1組、MKN-1組、SGC-7901組、BGC-823組相對灰度比分別為0.56±0.06、0.54±0.05、0.39± 0.03、0.25±0.01，隨著胃癌細(xì)胞的分化程度降低、惡性程度升高，ING4蛋白表達(dá)逐漸下降，其中BGC-823組、SGC-7901組分別與GES-1組比較，ING4蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），MKN-1組與GES-1組比較，ING4的蛋白表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖2）。

圖2　4種細(xì)胞ING4蛋白表達(dá)情況

2.3免疫組織化學(xué)檢測胃癌組織中ING4蛋白的表達(dá) 胃癌組織及癌旁組織中ING4蛋白表達(dá)情況見表1。具體評判標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞中充滿了棕色顆粒的為陽性結(jié)果，其中，棕黃色為+，棕色為++，深棕色為+++，沒有棕色顆粒的為陰性結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　免疫組織化學(xué)檢測ING4蛋白在胃癌組織中的表達(dá)（n=40）

3　討論

胃癌是一種高發(fā)生率的惡性腫瘤，發(fā)生率居消化道腫瘤的首位。目前國內(nèi)早癌的發(fā)現(xiàn)率仍低下，絕大部分發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，且手術(shù)根治率低，術(shù)后5年生存率一直維持在30%左右。因此，探索能夠預(yù)測胃癌及診斷的敏感指標(biāo)，是眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)，其中關(guān)于生長抑制因子家族新成員ING4的研究更為熱門。

ING4是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它位于染色體12p13.31，包含了8個外顯子和7個內(nèi)含子，有13 000個堿基對，編碼248個氨基酸。ING4基因突變或缺失導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，可能與腫瘤細(xì)胞異常增殖、阻滯腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，ING4在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［4］、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株［5］、結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO［6］等多種惡性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)明顯下降。2013年Zeng等［7］研究發(fā)現(xiàn)ING4表達(dá)水平的高低與肝癌的惡性程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中、低分化細(xì)胞株中ING4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較胃癌高分化細(xì)胞株及正常胃黏膜細(xì)胞株明顯降低；低分化細(xì)胞株中ING4表達(dá)水平較中分化細(xì)胞株又明顯降低；而高分化細(xì)胞株ING4表達(dá)水平與胃正常黏膜細(xì)胞株之間無明顯差異。這與Shi等［8］研究發(fā)現(xiàn)ING4在胃腺癌細(xì)胞系表達(dá)下降一致，其機(jī)制可能是胃癌細(xì)胞中ING4下調(diào)導(dǎo)致NF-κB激活，有利于胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中ING4蛋白表達(dá)陽性率明顯低于癌旁組織。這與錢莉等［9］研究發(fā)現(xiàn)ING4蛋白在胃腺癌組織中明顯減少的結(jié)果相似。

綜上所述，ING4在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，且隨著胃癌細(xì)胞的惡性程度增高，表達(dá)逐漸降低，胃癌組織中ING4蛋白陽性率亦明顯低于癌旁組織，證實(shí)ING4表達(dá)降低與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

?臨 床 經(jīng) 驗(yàn)?

Expression and significance of ING4 in human gastric cancer

CHENG Haiyan1， SHEN Zhe1， CHEN Weichang2， YAN Su2. 1.Department of Digestion， Shaoxing Second Hospital， Shaoxing， 312000； 2.Department of Digestion， the First Affi liated Hospital of Soochow Medical University， Suzhou， 215006

Abstract：Objective： To study the expression and significance of inhibitor of growth family member 4 （ING4） in many kinds of human gastric cancer cells and gastic cancer tissue. Methods： In the experimental group， there were three different typs of gastric cancer cells， MKN-1 （high differentiation）， SGC-7901 （moderate differentiation）and BGC-823 （low differentiation）. In the control group， there was a normal gastric mucosal cells GES-1. All cell lines were cultured in vitro. The mRNA and protein expression of ING4 were analyzed by RT-PCR and Western blot. Whether there was ING4 protein expression in gastric cancer tissue and adjacent tissue by immunohistochemistry. Results： The mRNA and protein expression of ING4 in SGC-7901 and BGC-823 groups were signifi cantly lower than that in MKN-1 and GES-1 groups. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. The mRNA and protein expression of ING4 in BGC-823 group were signifi cantly lower than that in SGC-7901 group. The difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. But there was no signifi cant different between MKN-1 group and GES-1 group （P＞0.05）. The positive rates of expression of ING4 protein in gastric cancer tissue was signifi cantly lower than that in adjacent tissue， the difference was statistically signifi cant （P＜0.05）. Conclusion： ING4 protein as a tumor suppressor is associated with the development and prognosis of the gastric cancer， which provide theoretical basis for clinical use ING4 gene targeted therapy for gastric cancer in the future.

Key words：ING4； gastric cancer cell line； RT-PCR； Western blot； imunocytochemistry

［中圖分類號］R735.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.011

收稿日期：2016-01-18

作者簡介：程海燕（1981-），女，江蘇鹽城人，主治醫(yī)師，碩士。