比較PCR-熒光探針法與其他方法對性病門診中衣原體和淋球菌檢出率的影響

吳開奇鐘 琦周平玉　樓永良*. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室（浙江溫州　505）；. 上海市第十人民醫(yī)院檢驗科； . 上海市皮膚病醫(yī)院性病科；

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比較PCR-熒光探針法與其他方法對性病門診中衣原體和淋球菌檢出率的影響

吳開奇1鐘 琦2周平玉3樓永良1*
1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室（浙江溫州325035）；2. 上海市第十人民醫(yī)院檢驗科； 3. 上海市皮膚病醫(yī)院性病科；

摘要目的 比較PCR-熒光探針法與乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）和淋球菌培養(yǎng)法對性病門診就診者生殖道分泌物中沙眼衣原體和淋球菌檢出率，控討PCR-熒光探針法的優(yōu)勢。方法 采集2015年3月至2015年12月上海市皮膚病醫(yī)院虬江分院性病門診就診的428位患者的生殖道分泌物，采用PCR-熒光探針法檢測分泌物中的衣原體和淋球菌，并與乳膠法和淋球菌培養(yǎng)法對比。結(jié)果 （1）PCR熒光探針法在衣原體的檢測中，428份標(biāo)本中衣原體陽性檢出率顯著高于乳膠法（9.95% vs 4.21%）P＜0.01。（2）PCR熒光探針法在淋球菌的檢測中，428份標(biāo)本中淋球菌陽性檢出率顯著高于淋球菌培養(yǎng)法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）。（3）PCR熒光探針法在性病門診的應(yīng)用顯著增加衣原體和淋球菌陽性率的檢出，有助于臨床感染的早期診斷和及時治療。結(jié)論PCR-熒光探針法的敏感性顯著高于乳膠法和淋球菌培養(yǎng)法，適合廣泛應(yīng)用于性病門診中檢測衣原體和淋球菌，有助于臨床早期診斷和治療。

關(guān)鍵詞衣原體， 沙眼；奈瑟球菌， 淋病；PCR-熒光探針法

衣原體和淋病雙球菌是引起泌尿生殖道感染的常見病原體，在女性感染患者中可以引起宮頸炎，尿道炎、盆腔炎、異位妊娠、早產(chǎn)及不孕，甚至可以通過垂直傳播引起嬰兒眼結(jié)膜炎和呼吸道感染等嚴(yán)重后果［1-3］；男性感染者則可以發(fā)生前列腺炎、尿道炎、附睪炎癥等不良結(jié)局［4］。研究顯示，當(dāng)患者有衣原體感染而無臨床癥狀的出現(xiàn)時，往往感染被疏忽，而導(dǎo)致后續(xù)嚴(yán)重的并發(fā)癥［5］。同樣，女性淋病大多無癥狀，在臨床上也常常易被漏診，最終導(dǎo)致慢性盆腔綜合征等嚴(yán)重后果［6］。更棘手的是傳統(tǒng)的衣原體抗原檢測法敏感性較低，約為50%～70%，衣原體培養(yǎng)法耗時，操作復(fù)雜，對實驗人員要求高，臨床很少應(yīng)用［7］；同時臨床發(fā)現(xiàn)女性淋病大多數(shù)無癥狀，往往會延遲就診而影響培養(yǎng)結(jié)果，造成對結(jié)果的誤判。這些因素均給臨床診斷和治療帶來困擾，因此早期發(fā)現(xiàn)病原體的存在，及時采取治療措施可以避免不孕不育等嚴(yán)重不良結(jié)局的產(chǎn)生。本研究主要采用了PCR-熒光探針法檢測性病門診采集的生殖道分泌物標(biāo)本中衣原體和淋球菌，并與乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）及淋球菌培養(yǎng)法比較分析，探討熒光PCR方法在生殖道分泌物樣本中用來檢測衣原體和淋球菌的優(yōu)越性，分析其對性病門診中衣原體和淋球菌陽性檢出率的影響。

材料和方法

一、研究對象

本實驗的研究對象為2015年3月份到12月份于上海市皮膚病醫(yī)院虬江路分院性病科門診就診且疑有泌尿生殖道感染的患者，所有患者在近一周內(nèi)未使用抗生素。標(biāo)本采集方法為將無菌拭子輕輕伸入男性尿道口內(nèi)2～3 cm處或女性宮頸口內(nèi)1～2 cm處捻轉(zhuǎn)數(shù)次并停留2min后取出，將拭子頭浸入無菌生理鹽水標(biāo)本管中和特殊培養(yǎng)基中保存，待測衣原體、淋球菌等。在此期間一共采集到428位患者的尿道或?qū)m頸分泌物，患者平均年齡（34.3±10.3）歲，范圍（5～78）歲，其中男性271名，平均年齡為（35.8±10.1）歲；女性157名，平均年齡為（31.7±9.2）歲；主要研究人群年齡段為20～40歲，占總?cè)藬?shù)的77%。

二、檢測方法

（一）PCR-熒光探針法

衣原體、淋球菌檢測的試劑由上?？迫A生物工程股份有限公司提供，檢測步驟一致，按照試劑盒說明書操作及熒光PCR儀器的軟件分析，得到樣本的檢測結(jié)果。PCR反應(yīng)條件為樣本在50℃用UNG酶處理反應(yīng)2min，93℃預(yù)變性2min，93℃變性10s，60℃退火、延伸及檢測熒光30s，共40次循環(huán)。

（二）乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）

在標(biāo)本處理管中加入標(biāo)本處理液A8滴，將采集樣本拭子與A液體反復(fù)擠壓混勻，再加入標(biāo)本處理液B 8滴，充分混勻后取3滴至反應(yīng)板加樣孔中，10～20 min后觀察結(jié)果。試劑由杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司供應(yīng)，詳細(xì)操作和步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進行。

（三）淋球菌培養(yǎng)法

淋球菌培養(yǎng)采用Thayer-Martin 選擇性瓊脂基礎(chǔ)（MTM瓊脂基礎(chǔ)）培養(yǎng)基，將采集的拭子標(biāo)本接種至培養(yǎng)基中，在5% CO2溫箱35℃培養(yǎng)48～72h后再進行判斷結(jié)果。

三、結(jié)果判斷

PCR-熒光探針法：陽性結(jié)果為樣本循環(huán)域值（cycle threshold， Ct）≤37，而Ct無數(shù)值或＞40的樣本為陰性結(jié)果，若37＜Ct＜40的樣本進行復(fù)測，復(fù)測結(jié)果＜40為陽性，否則為陰性。

乳膠法：10～20 min后在質(zhì)控條帶和反應(yīng)區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶為陽性結(jié)果；只在質(zhì)控區(qū)呈現(xiàn)紅色條帶為陰性結(jié)果；若是質(zhì)控區(qū)無紅色條帶出現(xiàn)，試劑失效，應(yīng)更換試劑重新檢測。

培養(yǎng)法：挑取直徑0.5～1.0 mm圓形、凸起、濕潤光滑、半透明或灰白色、邊緣呈花瓣狀的典型菌落，分別進行革蘭染色和氧化酶反應(yīng)，并挑取菌落傳代待做進一步生化反應(yīng)；氧化酶實驗于3～5 s內(nèi)出現(xiàn)鮮紅色后變成黑色和革蘭染色后鏡下可見革蘭陰性腎形雙球菌，則判斷為淋球菌陽性。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，不同方法陽性檢出率的比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、PPCCRR-熒光探針法與乳膠法對生殖道分泌物中衣原體檢出率的比較

P C R -熒光探針法對衣原體檢測陽性率為9.35%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乳膠法4.21%（P＜0.01），并且分別在男性和女性中的陽性檢出率也都明顯高于乳膠法（男，9.96% vs 4.06%，P＜0.01；女，8.83% vs 4.45，P＜0.05），不同年齡群中也都高于乳膠法，見表1（＜20歲人群研究對象較少，故無意義）。

表1　PCR--熒光探針法和沙眼衣原體抗原檢測法對衣原體的檢測結(jié)果比較

二、PPCCRR-熒光探針法與淋球菌培養(yǎng)法對生殖道分泌物中淋球菌檢出率的比較

淋球菌PCR-熒光探針法陽性檢出率高于培養(yǎng)法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）；在男性和女性中其陽性率也顯著高于培養(yǎng)法（男9.96% vs 3.69%，P＜0.01；女2.55% vs 1.27%，P＞0.05），不同年齡段PCR熒光探針法陽性檢出率高。見表2（＜20歲人群研究對象較少，故無比較意義）。

三、PPCCRR熒光探針法與乳膠法及淋球菌培養(yǎng)法對性病門診就診者衣原體和淋球菌陽性檢出率的影響分析

428名就診者中衣原體和淋球菌兩種檢測方法的最終結(jié)果顯示，PCR 熒光探針法檢測衣原體陽性有40例（陽性率9.35%），淋球菌陽性有31例（陽性率7.24%）；而乳膠法檢測沙眼衣原體測陽性只有18例（陽性率4.21%），淋球菌培養(yǎng)法陽性只有12例（2.80%），這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR熒光探針法；在男性和女性中同樣顯示PCR熒光探針法在衣原體和淋球菌檢測中的陽性率高；在對就診患者按年齡分布分析后發(fā)現(xiàn)在21～40年齡段檢查衣原體和淋球菌的人數(shù)最多，但乳膠法和淋球菌培養(yǎng)法的檢測陽性率均較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR熒光探針法；＜20歲就診者人數(shù)較少，其結(jié)果無意義，見圖1。以上結(jié)果PCR熒光探針法檢測衣原體和淋球菌中有較高的靈敏度，可以提高衣原體和淋球菌陽性檢出率，有利于就診患者的早期診斷和治療，尤其是性病門診中就診患者多為生育階段人群并且部分患者無臨床癥狀表現(xiàn)，可以避免不孕不育嚴(yán)重后果的發(fā)生。

表2　PCR--熒光探針法和淋球菌培養(yǎng)法對淋球菌檢測結(jié)果的比較

討　論

衣原體、淋球菌是常見的性傳播感染的病原體，目前其感染率在世界范圍內(nèi)一直居高不下并呈上升態(tài)勢［8，9］。盡管大多數(shù)男性淋球菌感染后可以出現(xiàn)尿頻、尿急、尿道流膿等急性癥狀，但大多數(shù)衣原體感染者及女性淋病患者感染后可以呈隱匿狀態(tài)長期潛伏或因患者無臨床癥狀或癥狀輕微，未及時就診引發(fā)多種并發(fā)癥，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果［5，6］。已知，衣原體、淋球菌感染可以引起育齡期人群的不孕不育，而長期感染更是主要罪魁［3，10］，而且無癥狀的感染者同時是最危險的傳染源，給家庭和性伴的健康帶來隱患。因此，對衣原體、淋球菌的隱匿感染不容忽視，早期發(fā)現(xiàn)，及時治療，對切斷傳染源、預(yù)防并發(fā)癥意義重大，敏感和可靠的診斷技術(shù)是實現(xiàn)這一目標(biāo)的前提條件。

圖11　PPCCRR熒光探針法較其他方法檢測衣原體和淋球菌的陽性率比較A：PCR熒光探針法和乳膠法檢測衣原體陽性率比較；B： PCR熒光探針法和淋球菌培養(yǎng)法檢測淋球菌陽性率比較

目前衣原體、淋球菌感染的確診主要依賴實驗室檢查［8］，因此可靠的實驗室結(jié)果是診斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。乳膠法檢測沙眼衣原體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床實驗室，方法簡便、快捷，但敏感性不夠［11］；培養(yǎng)法被認(rèn)為是病原體檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［12］，但操作復(fù)雜、耗時長，費用昂貴，淋球菌培養(yǎng)法在淋球菌的檢測中具有高度特異性，但該方法易受到標(biāo)本采集、運送、保存等諸多因素的影響，尤其是女性感染時間較長的患者，結(jié)果可出現(xiàn)假陰性，而且需要48 h或更長時間才能得到結(jié)果［13］，期間患者因得不到及時治療可導(dǎo)致病原體的進一步傳播。PCR技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，已有研究應(yīng)用于結(jié)核桿菌、梅毒螺旋體、艾滋病毒等病原體感染的診斷和療效判斷中［14-16］。本研究中采集到我院性病門診428份生殖道分泌物的標(biāo)本，利用PCR-熒光探針法分別檢測衣原體和淋球菌，并與乳膠法和淋球菌培養(yǎng)法比較。結(jié)果顯示PCR熒光探針法在衣原體和淋球菌的檢測中，其陽性率顯著高于乳膠法和淋球菌培養(yǎng)法，PCR結(jié)果與其他相關(guān)研究也較為一致［17-19］，這提示我們?nèi)槟z法和淋球菌培養(yǎng)法可能不能完全滿足臨床診斷需求。在我們?nèi)虢M的患者中，部分患者有生殖道刺激癥狀的出現(xiàn)，乳膠法檢測沙眼衣原體為陰性，而PCR法可以檢測到衣原體的存在，對患者的診斷和治療提供了明確的依據(jù)?？紤]到PCR方法檢測的是病原體的核酸，可能存在治療后病原體核酸沒有清除而造成檢測結(jié)果的假陽性，我們特別關(guān)注首次就診時僅有PCR陽性而無臨床癥狀的患者，對這些患者進行治療后7d隨訪，結(jié)果顯示衣原體PCR結(jié)果均轉(zhuǎn)陰（結(jié)果未展示）。值得一提的是，2例女性其丈夫淋球菌培養(yǎng)和PCR都為陽性，臨床明確診斷為淋病，但她們淋球菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，PCR陽性，此時若僅僅依靠淋球菌的培養(yǎng)就會造成患者的漏診，留下健康隱患。PCR-熒光探針法操作步驟簡單，反應(yīng)時間短，結(jié)果判定簡單客觀，靈敏度高且特異性好，不易受外界其他因素影響，克服了傳統(tǒng)PCR交叉污染易出現(xiàn)假陽性的缺點［20］，在規(guī)范化實驗室的前提下，此方法適合應(yīng)用于臨床檢測大量樣本和在門診就診患者中作為篩查方法。同時我們的研究顯示，性病門診中21-40歲的就診者人數(shù)最多，此年齡段人群處于生育階段且性生活較為活躍，是衣原體和淋球菌感染的重點關(guān)注對象，而衣原體和淋球菌的感染可引起不孕不育，PCR熒光探針法的應(yīng)用可以避免不孕不育等嚴(yán)重結(jié)局的發(fā)生。

總之，通過本研究的闡述表明PCR-熒光探針法技術(shù)在衣原體和淋球菌檢測中的應(yīng)用可以提高檢出率，對臨床衣原體和淋球菌的感染的早期診斷有重要意義，尤其是在生育階段人群和無癥狀感染患者中，早期發(fā)現(xiàn)和及時治療可以避免不孕不育等嚴(yán)重不良結(jié)局的發(fā)生。

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（2016-01-08收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.005

中圖分類號R 759

*通訊作者，Email： lyl@wzmc.edu.cn

Detection rate analysis of Chlamydia and gonococcal infection in STD clinic using PCR fl uorescence probe method

Wu Kaiqi1， Zhong Qi2， Zhou Pingyu3， Lou Yongliang1*
1. School of Laboratory Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China；2. Clinical laboratory， Shanghai Tenth People's Hospital， Shanghai； 3. STD Institute， Shanghai Skin Disease Hospital， Shanghai Corresponding author： Lou Yongliang， Email： lyl@wzmc.edu.cn

AbstractObjectiveTo comparatively analyze the detection rate of trachomatis and gonorrhoeae in genital tract secretion using PCR fluorescence probe method， Emulsion method， and Neisseria gonorrhoeae culture method. MetthhooddssGenital tract secretion samples of 428 patients from Qiujiang Branch of Shanghai Skin Disease Hospital STD clinic during March 2015 to December 2015 were collected. Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae in genital tract secretions were detected by PCR- fl uorescent probe， Emulsion method and Neisseria gonorrhoeae culture method， respectively. Ressuullttss（1） Among 428 specimens， the positive rate of Chlamydia using PCR- fluorescent probe method was significantly higher than that using Emulsion method（9.95% vs 4.21%）， P＜0.01. （2） Among 428 specimens， the positive rate of Neisseria gonorrhoeae using PCR- fl uorescent probe method was signifi cantly higher than that using Neisseria gonorrhoeae culture method（7.24% vs 2.80%），P＜0.01. （3） PCR- fl uorescent probe method signifi cantly improved the detection rate of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， it also improved early diagnosis and therefore treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection. ConcluussiioonnDue to the higher sensitiveness of PCR- fl uorescent probe method， it can be widely used in the STD clinics to detect the Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， which are helpful to early diagnosis and treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection.

Key wordschlamydia trachomatis；neisseria gonorrhoeae；PCR fl uorescence probe method