外源一氧化氮對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長及部分抗逆指標的影響

杜卓濤，楊　衍，朱國鵬，田麗波，*，商　桑，*

(1.海南大學 園藝園林學院/熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

外源一氧化氮對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長及部分抗逆指標的影響

杜卓濤1，楊衍2，朱國鵬1，田麗波1，*，商桑1，*

(1.海南大學 園藝園林學院/熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

摘要：為探討外源一氧化氮(NO)提高苦瓜抗冷性的內(nèi)在機制，以碧綠苦瓜幼苗為試材，對其施加不同濃度(0，0.1，0.5，1.0，1.5和2.0 mmol·L-1)的外源NO供體(SNP)并進行低溫(8 ℃)處理，研究外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗的生長、相對電導率、丙二醛(MDA)、脯氨酸含量以及過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的影響。結(jié)果顯示：SNP處理提高了莖粗/株高和葉面積/根體積的比值，降低了苦瓜幼苗葉片相對電導率和 MDA含量，提高了葉片脯氨酸含量和SOD，CAT，POD三種酶的活性，從而降低低溫脅迫對苦瓜幼苗的傷害。低濃度的SNP處理的苦瓜幼苗抗冷效果好于高濃度的，尤其以0.5 mmol·L-1SNP處理效果最佳。結(jié)果表明：低溫脅迫下，適宜濃度的外源NO通過提高抗氧化酶活性，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，降低膜透性和膜脂過氧化水平，保護了細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高苦瓜幼苗抗低溫脅迫的能力，促進了苦瓜幼苗的生長。

關(guān)鍵詞：苦瓜；外源NO(SNP)；低溫脅迫；防御酶

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種廣泛存在于植物體的信號分子，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的諸多生理過程，是當前植物逆境生理和信號轉(zhuǎn)導領(lǐng)域的研究熱點[1]。已有研究表明，NO可增強植物抗逆性，在緩解植物鹽脅迫、堿脅迫、溫度脅迫、重金屬脅迫、水分脅迫、紫外線輻射脅迫、滲透脅迫、光照脅迫等所引起的傷害中起著重要作用[2-3]。NO 可上調(diào)滲透脅迫及活性氧清除酶類基因的表達，提高水稻的耐鹽性及耐熱性[4]，還可調(diào)控高溫脅迫下擬南芥葉片的非光化學猝滅來維護 PSⅡ的正常生理功能[5]。近幾年研究表明，外源 NO能增強姜[6]葉片的抗氧化酶活性，減輕膜脂過氧化程度，緩解高溫脅迫對幼苗氧化損傷的影響。另外，NO可緩解低溫對植物的傷害已經(jīng)在多種作物上得到了證實。Lamattina等[2]研究報道外源 NO 能提高小麥、玉米種子和幼苗的抗低溫能力。研究發(fā)現(xiàn)，外源 NO可緩解低溫脅迫對玉米[7]、番茄[8]、黃瓜[9]幼苗生長的抑制作用，還可以通過提高棉花[10]、蝴蝶蘭[11]幼苗的保護酶活性，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，來減輕低溫脅迫對幼苗的傷害，提高其抗低溫脅迫的能力。樊懷福等[9]報道外源NO能顯著提高黃瓜幼苗葉片的凈光合速率和葉綠素含量，顯著降低低溫對膜造成的傷害。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)為葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物?？喙喜粌H有豐富的營養(yǎng)價值，而且有降血糖、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗艾滋病等很高的藥用功效。近幾年來，隨著人們對苦瓜的營養(yǎng)價值及諸多食療功效的深刻認識，苦瓜生產(chǎn)發(fā)展迅速，栽培面積逐年擴大，從而推動了苦瓜育種研究工作的深入開展[12]?？喙舷矞?、耐熱、不耐寒，在反季節(jié)栽培時常常遭遇低溫，造成冷害。孫奉良[13]開展了苦瓜耐低溫指標鑒定的研究，提出冷害指數(shù)、電導率、脯氨酸含量、丙二醛含量等生理生化指標可作為鑒定苦瓜耐低溫能力的指標。黃玉輝等[14]指出苦瓜幼苗葉片經(jīng)低溫脅迫后，丙二醛相對增加量與冷害指數(shù)呈顯著正相關(guān)，POD活性、SOD活性、可溶性糖含量與冷害指數(shù)呈顯著負相關(guān)。程世強等[15]指出低溫脅迫降低了苦瓜發(fā)芽種子成苗率，還增加了苦瓜幼苗葉片質(zhì)膜相對透性、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量，提高SOD，POD 活性，還降低了CAT活性和根系活力。已有研究表明，應用油菜素內(nèi)酯可緩解低溫脅迫對苦瓜的傷害[16]。硝普鈉(SNP)是現(xiàn)已廣泛使用的外源 NO供體，每0.5 mmol·L-1SNP大約可釋放2.0 μmol·L-1的NO[17]。外源NO供體SNP可緩解低溫脅迫對作物的傷害，在番茄[8]、棉花[10]、黃瓜[18]上得到了證實。

鑒于低溫對苦瓜幼苗的影響較大，需要采用簡單而有效的措施緩解低溫脅迫對幼苗而影響，而外源NO在緩解低溫脅迫對苦瓜的影響方面的研究少見報道，因此本研究通過對苦瓜幼苗根際施加外源NO，初步探討不同濃度的外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長和抗逆指標的影響，為制定苦瓜低溫冷害有效的防御措施提供依據(jù)及技術(shù)支持，對提高苦瓜的抗逆能力具有重要的意義。

1材料與方法

1.1試材及處理

供試苦瓜品種為碧綠苦瓜，購于海南省農(nóng)業(yè)科學院種子公司。試驗所用外源NO供體硝普鈉(SNP)由上海生工公司提供。

試驗于2012年在海南大學農(nóng)科實踐教學基地大棚進行。種子經(jīng)溫湯浸種催芽后，1穴1粒播于育苗穴盤，基質(zhì)采用V(田園土)∶V(椰糠)∶V(有機肥)=2∶1∶1配制而成，并用多菌靈滅菌。采用單因子隨機區(qū)組設(shè)計，待2葉1心時選取整齊一致的幼苗放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制晝夜溫度為8 ℃(經(jīng)過預實驗，將低溫脅迫溫度設(shè)定在8 ℃)，光照強度90 μmol·m-2·s-1，光照時間10 h，暗期14 h，對幼苗分別施用濃度為0(CK蒸餾水)，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol·L-1的SNP澆根，早晚各施1次，每次20 mL，每個處理20株，重復3次，低溫脅迫8 d。

1.2測定方法

低溫脅迫結(jié)束后，取完整植株用清水洗凈，將根部附著的基質(zhì)土壤等去除。莖高采取單個植株，用直尺直接測量(從生長點到根莖結(jié)合處)；莖粗采用50分度格游標卡尺測量根莖結(jié)合處；葉面積用YMJ-C活體葉面積測定儀進行測定。根體積使用EPSON EXPERSSION 1680臺式掃描儀及圖像分析軟件WinRHIZO測量。計算莖粗/株高和葉面積/根體積。采用氮藍四唑NBT法[19]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用愈創(chuàng)木酚法[19]測定過氧化物酶(POD)活性。采用過氧化氫還原法，參考Bailly方法[20]，測定過氧化氫酶(CAT)的活性。采用電導率儀法[21]進行測定相對電導率(RC)。采用酸性茚三酮比色法[22]測定脯氨酸(Pro)含量。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法[23]測定丙二醛(MDA)含量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 進行統(tǒng)計，處理后的結(jié)果用SPSS 17.0軟件按照Duncan新復極差法分析差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長的影響

由表1可知：不同濃度SNP處理的苦瓜幼苗莖粗/株高、葉面積/根體積均高于對照，在SNP處理濃度(0～0.5 mmol·L-1)較低時，隨著SNP濃度的升高， 莖粗/株高、葉面積/根體積也逐漸增加。在SNP濃度為0.5 mmol·L-1時，兩項比值均達到最大值，與對照相比均有顯著差異。而SNP濃度為0.5～2.0 mmol·L-1時，2項比值均降低。

表1SNP對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長的影響

Table 1Effect of SNP on growth of bitter melon seedlings under low temperature stress

SNP濃度/(mmol·L-1)莖粗/株高葉面積/根體積0(CK)0.628±0.01bB5.31±0.21bA0.10.654±0.02abAB6.47±0.28abA0.50.706±0.03aA7.24±0.25aA1.00.700±0.03aA7.19±0.36aA1.50.657±0.02abAB6.15±0.23abA2.00.664±0.01abAB5.95±0.29abA

注：采用Duncan新復極差法進行差異顯著性多重比較，數(shù)據(jù)=平均值±標準誤，同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫和大寫字母分別表示處理間在0.05和0.01水平存在顯著性差異。下同。

2.2外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗防御酶系的影響

由表2可知：經(jīng)外源NO處理后，低溫脅迫下苦瓜幼苗的SOD活性均比對照(CK)有所提高，分別高出對照1.05%，2.16%，1.42%，0.46%，0.35%。0.5，1.0 mmol·L-1的SNP處理效果和對照相比有顯著差異，其中以0.5 mmol·L-1SNP處理效果最好，差異極顯著。與對照相比，0.1，0.5，1.0，1.5 mmol·L-1SNP處理后，苦瓜幼苗的POD活性分別比對照提高6.01%，52.85%，69.18%，7.43%，而2.0 mmol·L-1SNP處理比對照低7.32%。不同濃度的SNP對POD活性的作用有明顯的濃度效應，低濃度(0.1，0.5，1.0，1.5 mmol·L-1)促進，而高濃度(2.0 mmol·L-1)抑制，并且以1.0 mmol·L-1SNP處理提高POD的活性的效果最好，與對照相比有極顯著性差異。0.1，0.5，1.0 mmol·L-1SNP處理后，苦瓜幼苗的CAT活性分別較對照高3.32%，47.57%，91.81%，1.5，2.0 mmol·L-1分別較對照低13.94%，26.33%。不同濃度的SNP對CAT的作用有明顯的濃度效應，低濃度(0.1，0.5，1.0 mmol·L-1)促進，而高濃度(1.5，2.0 mmol·L-1)抑制，并且以1.0 mmol·L-1SNP處理提高CAT活性的效果最好，與對照相比有極顯著性差異。

2.3外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗相對電導率的影響

由圖1可知：經(jīng)過SNP處理的苦瓜幼苗葉片相對電導率均低于對照，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol·L-1SNP處理分別較比對照減少了6.2%，58.1%，42.4%，39.9%和37.6%。其中0.5 mmol·L-1SNP處理抑制電解質(zhì)增多的效果最好，差異達顯著水平。

表2SNP對低溫脅迫下苦瓜幼苗SOD，POD和CAT活性的影響

Table 2Effect of SNP on the activities of SOD， POD and CAT of bitter melon seedlings under low temperature stress

SNP濃度/(mmol·L-1)SOD活性/(U·g-1)POD活性/(U·g-1·min-1)CAT活性/(U·g-1·min-1)0(CK)752.19±0.70cB109.22±6.22bB4.52±0.85bcB0.1760.12±5.20abcAB115.78±28.29bB4.67±0.93bcB0.5768.46±2.70aA166.94±15.14aAB6.67±0.25abAB1.0762.90±0.91abAB184.78±9.50aA8.67±0.38aA1.5755.66±3.55bcAB117.33±16.59bB3.89±0.29cB2.0754.85±2.76bcB101.22±16.73bB3.33±0.69cB

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。圖1　SNP對低溫脅迫下苦瓜幼苗相對電導率的影響Fig.1　Effect of SNP on relative conductivity of bitter melon seedlings under low temperature stress

2.4外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗脯氨酸含量的影響

由圖2可知：與對照相比，0.5，1.0 mmol·L-1SNP處理比對照提高了135.6%，114.4%，差異達極顯著水平，0.1，2.0 mmol·L-1SNP處理比對照僅提高了4.2%和69.9%，差異不顯著。說明適宜濃度的SNP處理可以提高低溫脅迫下苦瓜葉片的脯氨酸含量，其中以0.5 mmol·L-1SNP處理的效果最好。

圖2　SNP對低溫脅迫下苦瓜幼苗脯氨酸含量的影響Fig.2　Effect of SNP on proline content of bitter melon seedlings under low temperature stress

2.5外源NO對低溫脅迫下苦瓜幼苗丙二醛含量的影響

由圖3可見：由0.1，0.5，1.0，1.5和2.0 mmol·L-1SNP處理組比對照組分別降低了18.7%，55.5%，36.3%，37.2%和7.5%，其中0.5 mmol·L-1SNP處理時MDA含量最小，差異達顯著水平。說明在低溫脅迫下，適宜濃度SNP能有效降低膜脂過氧化的程度，保持膜穩(wěn)定性，提高苦瓜幼苗的抗冷性。

3結(jié)論與討論

育苗的核心問題是培育壯苗，除了使用與幼苗生長有關(guān)的一些數(shù)量性狀，如莖粗、莖高、葉片數(shù)、葉面積、根體積、花芽數(shù)等來描述秧苗的質(zhì)量外，也可以使用由它們構(gòu)成的相對指標，如莖粗/莖高、葉面積/根體積、苗幅/苗高等進行描述，相對指標比單一指標更為穩(wěn)定[24]，通常相對指標數(shù)值越大，秧苗的質(zhì)量越高。本試驗發(fā)現(xiàn)，施用適宜濃度的外源NO后，低溫脅迫下的秧苗莖粗/莖高和葉面積/根體積比值均顯著超過了對照，從而說明外源NO對在低溫逆境下培育壯苗具有重要的作用。

圖3　SNP對低溫脅迫下苦瓜幼苗丙二醛(MDA)含量的影響Fig.3　Effect of SNP on MDA content of bitter melon seedlings under low temperature stress

植物遭受冷害脅迫后產(chǎn)生大量自由基、活性氧，引起膜脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)活性降低甚至喪失，細胞膜受損，透性增大、電導率增大，導致植物代謝紊亂[25]。由SOD，POD和CAT組成的活性氧清除系統(tǒng)，三者協(xié)調(diào)作用，能有效清除植物體內(nèi)的自由基和過氧化物[26]。脯氨酸除可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在清除ROS、提高抗氧化能力、穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)、降低細胞酸性和解除氨中毒等方面起重要作用[27]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[28]。本試驗表明：低溫脅迫下，外源NO可提高SOD，POD，CAT的活性，降低相對電導率，降低膜透性，保護細胞膜免受或減少損傷，提高苦瓜幼苗抗低溫脅迫的能力。本試驗還發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol·L-1SNP處理可有效緩解低溫脅迫對苦瓜幼苗的影響，高濃度和低濃度的SNP對低溫脅迫緩解作用較小，高濃度的SNP有時會產(chǎn)生相反的作用。由于外源NO的作用機制非常復雜，SNP的濃度效應是否是由NO對生物體的雙重作用引起目前還有爭議，還需進一步深入研究。

綜上所述，在低溫脅迫下，外源NO可以增加苦瓜幼苗葉片脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，提升SOD，CAT，POD等3種抗氧化酶活性，清除低溫脅迫產(chǎn)生的多余自由基，降低相對電導率和 MDA含量保護膜的完整，防止膜質(zhì)過氧化，從而增強了苦瓜幼苗對低溫脅迫的適應性，促進了低溫脅迫下苦瓜幼苗的生長。

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(責任編輯張韻)

Abstract: The purpose of this work was to separateNINandSusgene from Ougan fruit and analyze expression patterns of both two genes in different tissues at different development stages of fruits， which will provide some basic information for sugar metabolism of Ougan fruit and enrichNINandSusstudy on citrus fruit. Two full length sequences encodingNINandSusgenes were isolated. They were 1 932 and 2 418 bp in length， respectively， encoding putative proteins of 643 and 805 amino acid. Sequence alignment results showed that bothNINandSuswere highly conserved， and shared more than 70% sequence homology with other plants from NCBI and almost 100% homology with citrus fruit. GenBank accession number forNINandSusfrom Ougan fruit was KF694988 and KF694989， respectively. Relative molecular mass of the putative NIN and Sus protein was 72.18 and 92.19 ku， respectively， and the isoelectric point (pI) was 6.882 and 6.051， respectively. Phylogenetic analysis showed that putative NIN protein belonged to Group α， which might localize in plastid， and putative Sus protein belongs to Sus Ⅰ. Results of real-time quantitative PCR showed that the mRNA level of both two genes accumulated highly in stem， then leaf， peel and flesh in descending order. The transcription level ofNINin peel was higher than that in flesh， while the transcription level ofSusin peel was relative to that in flesh. At different development stages of fruit， both genes expressed the highest at 120 after full bloom and then maintained at a low level until fruit maturation. The study showed that bothNINandSusgenes expressed with tissue-specificity， and both expressed at a higher level at the immature stage and decreased towards the ripening stage.

Key words: Ougan fruit; neutral invertase; sucrose synthase; gene clone; gene expression

CLC number: S666.1 Document: A

Article ID: 1004-1524(2016)05-0782-08

Effects of exogenous NO on plant growth and resistant characteristics of bitter melon seedlings under low-temperature stress

DU Zhuo-tao1， YANG Yan2， ZHU Guo-peng1， TIAN Li-bo1，*， SHANG Sang1，*

(1.CollegeofHorticultureandLandscape/KeyLaboratoryofProtectionandDevelopmentalUtilizationofTropicalCropGermplasmResources，HainanUniversity，Haikou570228，China; 2.TropicalPastureResearchCenter，ChineseAcdemyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737，China)

Abstract:For exploring the internal mechanism of exogenous NO in improving the cold resistance of bitter melon， in this experiment， the variety of Bilv was taken as test material， different concentrations of sodium nitroprusside (SNP) (0， 0.1， 0.5， 1.0， 1.5 and 2.0 mmol·L-1) was employed as exogenous nitric oxide (NO) donor to study the effects of different concentrations of exogenous nitric oxide (NO) on the plant growth， relative electrical conductivity， MDA content， proline content and the activities of POD， SOD， CAT of bitter melon seedlings under 8 ℃ low-temperature stress. The results showed that the treatment of SNP could improve plant height/stem diameter and leaf area/root volume; reduce the relative electrical conductivity and content of MDA; increase proline content and the activities of POD， SOD and CAT of the bitter melon seedlings under low-temperature stress to reduce the damage caused by low-temperature. It was also found that the cold resistance effect of treatment with low concentration of SNP was better than that with high concentration， especially the treatment with 0.5 mmol·L-1SNP was the best. It indicated that the exogenous NO with proper concentration could promote the plant growth and enhance the bitter melon seedlings’ adaptability for low temperature stress through improving the activities of defensive enzymes， increasing the osmotic adjustment substance contents， reducing membrane lipid peroxidation and protecting the stability of cell membrane structure.

Key words:bitter melon; exogenous NO (SNP); low temperature stress; defensive enzyme

Gene clone， sequence analysis and gene expression of NIN and Sus from Ougan fruit

JIN Wei-wei， CHEN Gong-kai*， ZHU Jian-jun， GAO Ai-ling

(InstituteofPomology，WenzhouAcademyofAgriculturalSciences，Wenzhou325006，China)

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.11

收稿日期：2015-09-10

基金項目：國家自然科學基金項目(31460517)；海南省自然科學基金項目(311029)；海南省蔬菜生物學重點實驗室開放課題(SCKF201502)；國家科技支撐計劃項目子課題(2014BAD05B04)；海南大學中西部計劃學科建設(shè)項目(ZXBJH-XK008)

作者簡介：杜卓濤(1980—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail: dutao200588@126.com

*通信作者，田麗波，E-mail：faiy7play@163.com；商桑，E-mail: fair.play@163.com

中圖分類號：S642.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0776-06

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 776-781

http://www.zjnyxb.cn

杜卓濤，楊衍，朱國鵬，等.外源一氧化氮對低溫脅迫下苦瓜幼苗生長及部分抗逆指標的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(5)： 776-781.