甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變影響因素及細(xì)胞區(qū)室結(jié)構(gòu)分析

楊　柳， 唐云仙， 廖　芬， 汪　淼， 梁永檢， 楊麗濤*， 黃東亮， 李楊瑞，

( 1. 廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 南寧 530004； 2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所/中國農(nóng)科院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530007 )

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甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變影響因素及細(xì)胞區(qū)室結(jié)構(gòu)分析

楊柳2， 唐云仙1， 廖芬1， 汪淼2， 梁永檢1， 楊麗濤1*， 黃東亮2， 李楊瑞1， 2

( 1. 廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 南寧 530004； 2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所/中國農(nóng)科院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530007 )

摘要：該研究通過綜合分析對甘蔗(ROC 22)莖尖離體培養(yǎng)褐變不同條件因素的影響以及褐變細(xì)胞區(qū)室結(jié)構(gòu)的變化，探討了甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變的機(jī)理機(jī)制。結(jié)果表明：不同芽位莖尖誘導(dǎo)成活率具有明顯差異，隨著芽位的增加，誘導(dǎo)成活率不斷降低；不同季節(jié)取芽對外植體莖尖總酚類物質(zhì)含量無明顯影響；但不同芽位及不同催芽天數(shù)，外植體芽的總多酚含量明顯不同，隨著催芽天數(shù)的增加，不同芽位的多酚含量呈現(xiàn)由低升高的趨勢；蔗芽在培養(yǎng)4周時多酚含量較低，適宜進(jìn)行采芽接種培養(yǎng)；從褐變甘蔗莖尖的解剖結(jié)構(gòu)變化分析，褐變甘蔗莖尖細(xì)胞離體培養(yǎng)初期細(xì)胞核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形，線粒體有腫脹拉長，部分液泡膜開始分解；中后期質(zhì)壁分離更為嚴(yán)重，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量溶酶體，線粒體等細(xì)胞器全分解，細(xì)胞膜、液泡膜、核膜、線粒體膜的雙層膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損和缺口；而正常發(fā)育的莖尖細(xì)胞，能基本保持細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只有少量的溶酶體出現(xiàn)。因此，可以推測細(xì)胞核和線粒體結(jié)構(gòu)變形以及膜系統(tǒng)的大量破損是甘蔗莖尖培養(yǎng)褐變死亡的原因。

關(guān)鍵詞：褐變， 莖尖， 甘蔗， 多酚類物質(zhì)

近年來，甘蔗莖尖脫毒健康種苗技術(shù)健康技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善，已經(jīng)在世界上主要的甘蔗種植國家得到普遍的應(yīng)用(Lee & Bressan， 2005; Yang et al， 2010; 楊柳等， 2011)。我國自20世紀(jì)80年代初從巴西引進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)，逐步建立起包括病原菌的去除(李文鳳等， 2009)、組織培養(yǎng)快繁(陳彪等， 2001)、病原檢測(沈萬寬等， 2007)、田間擴(kuò)繁與栽培(鄧展云等， 2010; 李松等， 2010)為一體的甘蔗莖尖脫毒健康種苗技術(shù)體系，并成功地推廣應(yīng)用于我國主要的甘蔗種植區(qū)域。

褐變(又稱酚污染或酚害) 也是植物組織培養(yǎng)過程中致使誘導(dǎo)率較低、生長緩慢的主要因素(Krishna et al， 2008)，嚴(yán)重時會導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞、組織、外植體的死亡，且褐變的嚴(yán)重程度與外植體組織的基因型、取材部位及生長狀態(tài)具有重要的關(guān)系(Uchendu et al， 2011)，褐變現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因是因?yàn)橥庵搀w組織細(xì)胞中的PPO(多酚氧化酶)與天然底物酚產(chǎn)生醌引起的酶促褐變。多酚類物質(zhì)是普遍存在于正常植物的細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)組織細(xì)胞受到脅迫時會作為防御物質(zhì)大量積累；而在植物組織培養(yǎng)的過程中剪切外植體是必不可少的步驟，因此，在酚類物質(zhì)會因?yàn)橥饨鐐γ{迫而大量積累，當(dāng)多酚氧化酶被激活，酚類物質(zhì)被氧化，產(chǎn)生醌類物質(zhì)，使植物組織變褐并產(chǎn)生毒害作用。由于植物組織培養(yǎng)過程中褐變普遍存在，有關(guān)褐變的控制方法也有大量的報道，主要的控制方法總體可以分為兩種：培養(yǎng)基中添加抗氧化劑物質(zhì)(抗壞血酸、抗褪黑素、檸檬酸等)來減少酚類物質(zhì)的氧化；培養(yǎng)基中添加強(qiáng)吸附劑(活性炭、聚乙烯比咯烷酮PVP、高分子吸附樹脂等)(Peiser et al， 1998)。在這兩種方法基礎(chǔ)上增加轉(zhuǎn)接繼代的頻率也是有效控制褐變的重要措施。也有報道指出培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸解氨酶(PAL)抑制劑2-氨基茚磷酸(AIP)可以有效地降低培養(yǎng)組織中多酚類物質(zhì)的合成，從而降低外植體培養(yǎng)的褐變程度(Andrew & Praveen， 2013)。

褐變也是甘蔗組織培養(yǎng)過程中的重要限制因素，特別是在甘蔗莖尖離體誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，褐變會導(dǎo)致莖尖誘導(dǎo)出苗率降低，或者直接導(dǎo)致組織死亡。褐變死亡是導(dǎo)致甘蔗莖尖離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)成活率較低的主要原因。目前針對甘蔗莖尖離體培養(yǎng)莖尖褐變，主要是通過培養(yǎng)基中添加強(qiáng)吸附劑、抗氧化物質(zhì)、增加轉(zhuǎn)接繼代頻率等措施來降低褐變危害，并取得了一定的效果。防止褐變最常用的就是添加吸附劑或褐變抑制劑。如黃誠梅等(2004)的研究表明，甘蔗莖尖組織預(yù)先在無菌水中浸泡30 min ，再接種到6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1MS 培養(yǎng)基中，可減輕外植體的褐變;莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接附加適量的活性炭(AC，以0.02%為宜，最高不超過0.05%)，減輕莖尖組織酚害的效果最理想。另外，在培養(yǎng)基中附加抗氧化劑(如聚乙烯吡咯烷酮，PVP)，或根據(jù)外植體的褐變情況及時轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中，均能減輕甘蔗莖尖組織的酚害。賢武等(2000)認(rèn)為液體濾紙橋震動培養(yǎng)效果最好，褐變最輕，莖尖存活數(shù)多，叢芽誘導(dǎo)率高。這是因?yàn)橐后w培養(yǎng)有利于外植體周圍的有害物質(zhì)擴(kuò)散，減少了對外植體的毒害。另外在防止褐變中多次轉(zhuǎn)接也可以減輕褐變，但此方法需要耗費(fèi)大量的物力和人力。但有關(guān)莖尖褐變的影響因素分析以及褐變機(jī)理的研究較少，因此，本研究主要是通過對莖尖離體培養(yǎng)褐變不同條件因素的影響以及褐變細(xì)胞區(qū)室結(jié)構(gòu)的變化觀察的綜合分析分析，探討甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變的機(jī)理，以期為提高甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率提供理論支持。

1材料與方法

1.1 材料

甘蔗品種為ROC 22，試供材料均來源于廣西農(nóng)科院甘蔗研究所試驗(yàn)基地。試驗(yàn)材料主要用于進(jìn)行恒溫催芽和莖尖離體培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 方法

取單芽時期為春季(3月)、夏季(6月)、秋季(9月)、冬季(12月)；以+1葉芽位為1位芽，依次往基部方向取3、5、7位芽，單芽蔗莖長度為5 cm，進(jìn)行恒溫38 ℃培養(yǎng)；恒溫培養(yǎng)催芽時間分別設(shè)為2周、3周、4周、5周四個處理，因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為三因素四水平試驗(yàn)(表 1)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照正交表L16(4^3)， 共計(jì)16個處理組合，每個處理100個芽，3次重復(fù)。

1.2.1 誘導(dǎo)成活率的統(tǒng)計(jì)在不同催芽時間處理結(jié)束后，取出甘蔗單芽苗，在超凈臺剝?nèi)ジ收崆o尖，進(jìn)行液體濾紙橋離體培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS + 2，4-D 2.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 糖 30 g·L-1，每個處理40個莖尖，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)成活率。

1.2.2 PPO活性測定在不同催芽時間處理結(jié)束后，取出甘蔗單芽苗30株，取甘蔗莖尖樣品0.2 g，加入5 mL pH 6.0的磷酸緩沖液，冰浴研磨，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，上清液為粗酶液。PPO測定參照何思蓮等(2009)的方法。

表 1　試驗(yàn)處理因素及水平設(shè)計(jì)

1.2.3 總酚含量的測定多酚提取采用甲醇水溶液浸提法(Gorinstein et al， 2004)。在不同催芽時間處理結(jié)束后，取出甘蔗單芽苗30株，取甘蔗莖尖樣品0.2 g研磨，加入2 mL 40%的甲醇浸提液，55 ℃水浴浸提30 min。浸提完畢后，3 000 r·min-1離心10 min，得多酚粗提液。多酚含量測定采用Folin-Ciocalteau法(Pastrana-bonilla et al， 2004)，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察在立體顯微鏡下，剝?nèi)〕龈收崆o尖原生分生組織進(jìn)行濾紙橋液體離體培養(yǎng)，對不同培養(yǎng)天數(shù)的逐漸褐變的莖尖材料進(jìn)行電鏡組織觀察， 連續(xù)觀察30 d。電鏡檢測方法如下：將離體培養(yǎng)莖尖投入2.5% 戊二醛及4%甲醛混合固定液固定1～2 h后用2%鋨酸作后固定， 0～4 ℃下固定過夜。按常規(guī)梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、電鏡觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多因素方差分析，使用Excel 軟件進(jìn)行作圖比較。

2結(jié)果與分析

2.1 甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變影響因素分析

表2結(jié)果顯示，取芽季節(jié)對甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率(Sig.=0.135>0.05)、總酚類物質(zhì)含量(Sig.=0.162>0.05)沒有顯著影響，取芽季節(jié)對多酚氧化酶活性在Sig. =0.01<0.05水平上影響顯著，但在Sig.<0.01水平上沒有顯著影響；但催芽時間和不同芽位對甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率、莖尖多酚氧化酶活性及總酚類物質(zhì)含量都有顯著的影響。莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率影響因素相關(guān)分析表明，總酚類物質(zhì)含量與誘導(dǎo)成活率呈顯著負(fù)相關(guān)，Pearson 相關(guān)性系數(shù)為0.818，顯著性Sig.=0.01；而莖尖誘導(dǎo)成活率與多酚氧化酶活性也呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著(表 3)。

表 2　甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變影響因素的總體效應(yīng)分析

表 3　甘蔗莖尖誘導(dǎo)成活率影響因素的相關(guān)性分析

以不同季節(jié)采收甘蔗ROC 22為材料，從葉稍部下+1葉的第1個芽位起，共選用4個芽作為外植體，即1， 3， 5， 7位芽，在大棚中催芽，分別在催芽14、21、28、35和42 d后采集材料，同時測定莖尖多酚含量及多酚氧化酶活性，無菌條件下莖尖離體濾紙橋接種培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率(表3)。

圖1結(jié)果顯示，不同芽位莖尖誘導(dǎo)成活率具有明顯差異，隨著芽位的增加，誘導(dǎo)成活率不斷降低，1位芽誘導(dǎo)成活率最高，這說明單芽外植體材料組織越越鮮嫩誘導(dǎo)成活率越高；在不同季節(jié)進(jìn)行外植體材料取樣對莖尖誘導(dǎo)成活率影響差異不大；外植體單芽催芽4周后剝?nèi)∏o尖進(jìn)行濾紙橋離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率較高，與其他催芽時間相比較差異顯著。

不同芽位在不同催芽培養(yǎng)時間的多酚氧化酶活性表現(xiàn)不同。催芽14 d的芽位(1～6)中酶活最低，在3～6位芽中，催芽28 d的酶活也較低；在第1～3位芽中，21 d催芽的酶活最高，但在第4～6位芽中，則以35 d催芽的酶活最高(圖2)。

圖 1　不同條件對甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率的影響Fig. 1　Survival rate of sugarcane stem tip which were induced in vitro tissue culture effected by different influence factors

圖 2　甘蔗莖尖不同條件下的多酚氧化酶活性變化Fig. 2　Sugarcane stem tip polyphenol oxidase activity changes effected by different influence factors

圖 3　甘蔗莖尖不同條件下的總酚類物質(zhì)含量變化Fig. 3　Sugarcane stem tip polyphenol compounds content changes effected by different influence factors

不同季節(jié)取芽對外植體莖尖總酚類物質(zhì)含量沒有明顯影響；但不同芽位及不同催芽天數(shù)，外植體芽的總多酚含量明顯不同，隨著催芽天數(shù)的增加，不同芽位的多酚含量呈現(xiàn)由高降低的趨勢；催芽2周和3周的芽體所含多酚含量較高；而催芽4～5周的芽體所含多酚含量則較低，尤以4周的芽體最低。因此，在蔗芽在培養(yǎng)4周時期多酚含量較低，適宜進(jìn)行采芽接種培養(yǎng)。

2.2 莖尖培養(yǎng)過程細(xì)胞組織的形態(tài)變化

莖尖培養(yǎng)后按接種后1～14 d分別取樣固定材料，做電鏡切片觀察。以新鮮外植體材料作正常細(xì)胞對照。觀察到，在1～4 d時，外觀看未發(fā)現(xiàn)明顯褐變的情況發(fā)生。從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)看，培養(yǎng)1 d內(nèi)，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)在有明顯的變形，細(xì)胞壁的框架結(jié)構(gòu)仍存在。培養(yǎng)2 d時，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)仍保持完整，線粒體結(jié)構(gòu)并未發(fā)現(xiàn)變形。細(xì)胞膜，液泡膜，核膜，線粒體膜的雙層膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。但從第2天開始，可以觀察到質(zhì)壁開始分離。培養(yǎng)第4天后，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形，線粒體有腫脹拉長，部分液泡膜開始分解。培養(yǎng)第10～14天后，莖尖細(xì)胞明顯褐變，細(xì)胞核出現(xiàn)變形，質(zhì)壁分離更為嚴(yán)重，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量溶酶體，液泡也吞噬一些物質(zhì)，空腔的線粒體增多。細(xì)胞膜，液泡膜，核膜，線粒體膜的雙層膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，缺口。而正常發(fā)育的莖尖的細(xì)胞，還能基本保持細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只有少量的溶酶體出現(xiàn)。培養(yǎng)20 d后，完全褐化變黑的莖尖細(xì)胞，胞質(zhì)完全溶解，整個細(xì)胞只剩下框架，液泡，線粒體等細(xì)胞器全分解(圖4)。

3討論與結(jié)論

甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變與外植體采集時間、采集部位、培養(yǎng)基成分及繼代轉(zhuǎn)接頻率等有重要關(guān)系。

圖 4　甘蔗 (ROC22) 莖尖培養(yǎng)過程細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的變化　A. 正常細(xì)胞； B. 培養(yǎng)1 d細(xì)胞； C,D. 培養(yǎng)2 d細(xì)胞； E,F. 培養(yǎng)4 d細(xì)胞； G. 10 d正常細(xì)胞； H,I. 培養(yǎng)10 d褐變細(xì)胞； J. 14 d正常細(xì)胞； K. 培養(yǎng)14 d褐變細(xì)胞； L. 培養(yǎng)20 d褐變細(xì)胞。 CW. 細(xì)胞壁； N. 細(xì)胞核； MIT. 線粒體； MB. 溶酶體； MW. 液炮; CYT. 高爾基體。Fig. 4　Sugarcane stem tip cell structure changes in the process of in vitro tissue culture　 A. Normal cell; B. Cell after 1 d inoculation; C， D. Cell after 2 d inoculation; E， F. Cell after 4 d inoculation; G. Normal cell after 10 d inoculation; H， I. Browning cell after 10 d inoculation; J. Normal cell after 14 d inoculation; K. Browning cell after 14 d inoculation; L. Browning cell after 20 d inoculation. CW. Cell wall; N. Nucleus; MIT. Mitochondria; MB. Lysosome; MW. Vacuole; CYT. Dictyosome.

本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗外植體的采集時間對甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率的具有一定影響，其中與其他季節(jié)相比夏季采芽莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率較高，但差異不顯著。盧文祥等(2002)研究發(fā)現(xiàn)甘蔗外植體的最佳采集時期是每年6-8月，認(rèn)為此時甘蔗生長處于拔節(jié)期，而冬季采集的外植體容易褐變且誘導(dǎo)期長。本研究發(fā)現(xiàn)位于頂部芽位的單芽經(jīng)催芽后莖尖離體培養(yǎng)成活率較高，且受酚害影響較小，其主要原因是頂部芽位的多酚氧化酶活性較低，總酚含量也較低，所以受褐變影響較小。黃誠梅等(2004)研究發(fā)現(xiàn)甘蔗外植體的部位在甘蔗組織培養(yǎng)中，由于在生長點(diǎn)附近的酚類物質(zhì)、酶比較多，所以甘蔗的芽繁培養(yǎng)的褐變程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于嫩葉的組織培養(yǎng)，但該研究并未對不同甘蔗單芽離體培養(yǎng)的褐變影響進(jìn)行分析。甘蔗腋芽催芽時間對莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率具有重要的影響，本研究發(fā)現(xiàn)催芽3～4周后，進(jìn)行莖尖離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)成活率較高。以甘蔗腋芽催芽2周后即可進(jìn)行離體取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)(秦延豪， 1997; 盧文祥等， 2002; 黃誠梅等， 2004)，但未對不同催芽時間進(jìn)行篩選方面的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率與多酚氧化酶活性也呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，這可能與多酚氧化酶在酶促褐變的過程中受到多種因素的影響有關(guān)，如培養(yǎng)基pH值、光照強(qiáng)度、培養(yǎng)基成分等，鄰位多酚類物質(zhì)是甘蔗PPO 的最適反應(yīng)底物，多酚氧化酶活性與pH值之間有很重要的關(guān)系，最適合反應(yīng)為6.2，低于5.8或者高于7.0時則較穩(wěn)定(Mahmud et al， 2014);甘蔗莖尖離體培養(yǎng)條件對其體內(nèi)的多酚氧化酶活性也有重要的影響，如溫度過高、光照過強(qiáng)都會增加PPO 的活性，從而加速培養(yǎng)組織褐變，甘蔗胚性細(xì)胞在光照2 500 lx 以上時細(xì)胞團(tuán)表面會出現(xiàn)褐變，在弱光下易出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)(Cheong et al， 2012)；秦延豪(1997)研究表明外源激素會增加植物組織培養(yǎng)過程中酚害現(xiàn)象的產(chǎn)生，這是因?yàn)榧に赜写碳ざ喾友趸富钚蕴岣叩淖饔?，不同激素水平與不同組合產(chǎn)生的褐變程度也不一樣，褐變最嚴(yán)重的激素組合為BA + KTT，最輕的為BA和BA+NAA，且濃度越低褐變越輕。

Yang et al(2010)采用固相微萃取技術(shù)與硅烷衍生化法結(jié)合氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用聯(lián)用來分析甘蔗莖尖多酚類物質(zhì)的種類，共得到6種多酚類物質(zhì)，分別為間丙烯酸苯酚；3-(2-含氧甲基苯酚)-2，4-二甲基戊醇；2-含氧甲基苯酚；2，6-二異丁基-4-甲基苯酚；4-4'-亞甲基(2，3，6-三甲基苯酚)；4，4'-亞甲基聯(lián)苯酚。本研究中發(fā)現(xiàn)甘蔗莖尖組織中多酚類物質(zhì)含量與莖尖離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率呈顯著負(fù)相關(guān)，說明甘蔗莖尖分類物質(zhì)含量與莖尖褐變具有重要的影響；黃誠梅等(2004)研究發(fā)現(xiàn)甘蔗組織培養(yǎng)過程中外植體中的多酚類物質(zhì)含量與甘蔗組織培養(yǎng)褐變有重要的關(guān)系，且發(fā)現(xiàn)甘蔗組織培養(yǎng)的外界溫度一般為26～28 ℃，多酚類物質(zhì)含量較低，可減輕褐變；印芳等(2006)對酚類物質(zhì)與蝴蝶蘭褐變關(guān)系的研究表明，綠原酸、鄰苯二酚、兒茶酚、咖啡酸及沒食子酸、對羥基苯甲酸、香豆酸可能與蝴蝶蘭褐變相關(guān)， 苯甲酸對蝴蝶蘭褐變影響很小; 在褐變過程中， 總酚含量越高， 褐變程度越嚴(yán)重。許傳俊等(2005)也認(rèn)為外植體總酚含量和PAL活性隨褐變程度加重逐漸增加， 兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。

從解剖電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變細(xì)胞初期細(xì)胞核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形，線粒體有腫脹拉長，部分液泡膜開始分解；中后期細(xì)胞核出現(xiàn)變形，質(zhì)壁分離更為嚴(yán)重，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量溶酶體，液泡也吞噬一些物質(zhì)，空腔的線粒體增多，細(xì)胞膜，液泡膜，核膜，線粒體膜的雙層膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，缺口。而正常發(fā)育的莖尖的細(xì)胞，還能基本保持細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，僅少量的溶酶體出現(xiàn)。因此，從解剖的甘蔗褐變莖尖細(xì)胞電鏡檢測結(jié)果，推測甘蔗莖尖培養(yǎng)褐變死亡的原因可能與其細(xì)胞核和線粒體結(jié)構(gòu)變形有關(guān)，膜系統(tǒng)的大量破損也是重要原因之一。

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Cell chamber structure and influences factors analysis on sugarcane stem tips browninginvitro

YANG Liu2， TANG Yun-Xian1， LIAO Fen1， WANG Miao2， LIANG Yong-Jian1，YANG Li-Tao1*， HUANG Dong-Liang2， LI Yang-Rui1，2

( 1.CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity， Nanning 530004， China； 2.SugarcaneResearchInstitute，GuangxiAcademyofAgriculturalSciences/SugarcaneResearchCenter，ChineseAcademyofAgriculturalSciences/GuangxiKeyLaboratoryofSugarcaneBiotechnologyandGeneticImprovement，MinistryofAgriculture/GuangxiKeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement， Nanning 530007， China )

Abstract:This research was mainly carried out to analyze the mechanism of sugarcane stem tip browning in vitro culture through investigating the influences factors which relate to phenolic browning and observing stem tip cellular compartments structure changes in the process of browning. Sugarcane variety ROC 22 which provided by sugarcane research institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences was selected as experiment material. The result showed that different axillary buds obtained obviously different induction survival rates， the more fresh buds resulted in the more high survival rate， the first position bud got the highest survival rate， that is to mean the more fresh bud get the more higher induction survival rate; the induction survival rate was not effected by different explants collecting seasons; pre-germination time 4 weeks resulted higher induction survival rate， and obtained significant difference compared with other pre-germination time treatments. Different buds with different pre-germination time treatments had obvious different total phenolic compounds content， the longer pre-germination time resulted in the lower phenolic compounds accumulated in stem tip cells， pre-germination time for 2 weeks and 3 weeks obtained higher total phenolic compounds in stem tip cells at different position buds， while pre-germination for 4 weeks and 5 weeks got low total phenolic compounds content， therefore， sugarcane axillary bud was pre-germinated for 4 weeks is a better period for induction tissue culture; stem tip total phenolic compounds content was not effected by explants collecting season；polyphenol oxidase acitivity changed significantly in different axillary buds with different pre-germination time treatments， lower polyphenol oxidase acitivity were obtained in 1-6 position buds with 2 weeks pre-germinated treatment and in 3-6 position buds with 4 weeks pre-germinated treatment; while higher polyphenol oxidase acitivity were obtained in 1-3 position buds with 3 weeks pre-germinated treatment and in 4-6 position buds with 5 weeks pre-germinated treatment. Sugarcane browning stem tips were observed by electron microscope， the result showed that the nucleus structure deformed， swollen mitochondria stretched， part of the vacuole membrane started to break down at the early browning stage; more serious plasmolysis appeared， a large number of lysosomes appeared in cytoplasm， organelles such as mitochondria completely decomposed， cell membrane， vacuole membrane， nuclear membrane and mitochondrial membrane broke down， cytoplasm completely dissolved， vacuoles mitochondria and other organelles completely decomposed at the later browning stage. This finding inferred that nucleus and mitochondria structural distortion and cell membrane systems break were the main reasons for sugarcane stem tip browning to death in the process of tissue culture in vitro.

Key words:browning， stem tips， sugarcane， phenolic compounds

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201409057

收稿日期:2014-11-29修回日期： 2015-06-01

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金 (2012jjBA30008， 2013GXNSFBA019064)； 廣西農(nóng)科院基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2012YZ14， 桂農(nóng)科2013YQ09)； 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (桂科攻1222009-1B)； 廣西“八桂學(xué)者”團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目[Supported by the Natural Science Foundation of Guangxi(2012jjBA30008，2013GXNSFBA019064); Basic Research Fund of Guangxi Academy of Agricultural Sciences(2012YZ14，2013YQ09); Guangxi Research and Development Plan(1222009-1B); Team Fund for “Bagui” Scholars of Guangxi; Open Fund for Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement]。

作者簡介：楊柳( 1983-)，男，安徽宿州市人，博士，副研究員，主要從事植物組織培養(yǎng)和甘蔗氮素生理研究，(E-mail)yangliutibs@126.com。*通訊作者： 楊麗濤，博士，教授，主要從事甘蔗育種及生理生化研究，(E-mail)litao61@hotmail.com。

中圖分類號：Q942.5， S566.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0574-08

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