ERα通過Notch1信號通路刺激NCI-H23細胞增殖

趙智麗， 韓雅莉

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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ERα通過Notch1信號通路刺激NCI-H23細胞增殖

趙智麗， 韓雅莉

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:為了探討Notch1信號通路在ERα誘導(dǎo)NCI-H23增殖中的作用，將NCI-H23非小細胞肺癌細胞經(jīng)E2、DATP或siRNA干預(yù)后，采用MTT、細胞集落分析、PI分析、western blotting的方法檢測細胞的增殖和蛋白表達變化.結(jié)果與空白對照相比E2使細胞增殖能力加強，處于增殖期細胞比例是對照組的1.33倍，Bcl-2和PCNA表達增加，Bax表達減少；DATP合并E2處理后細胞增殖能力明顯下降，與E2作用組相比P<0.01，增殖期細胞比例是E2組的0.66倍，Bax表達明顯增加，細胞生存能力下降；當(dāng)siRNA沉默Notch1 表達后E2再刺激使細胞ERα表達明顯低于轉(zhuǎn)染control siRNA組，E2在Notch信號減弱后對細胞增殖的刺激作用被削弱.得出了E2刺激細胞增殖需要Notch信號參與，減少Notch信號傳導(dǎo)可以抑制E2對細胞的促增殖作用的結(jié)論.

關(guān)鍵詞:Notch1信號通路； 雌激素受體； 非小細胞肺癌

肺癌由于發(fā)病率高、致死率高，已經(jīng)成為人類最致命的癌癥之一，在癌癥發(fā)病率中位居第二，5年生存率不足15%，其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的85%[1].眾所周知，吸煙是罹患肺癌的首要原因，但隨著女性肺癌發(fā)病率的不斷上升性別因素已成為學(xué)者們關(guān)注的另一個重要因素.有調(diào)查顯示男性肺癌患者中吸煙人數(shù)占85%，而女性只占47%，提示肺癌的發(fā)生存在很大性別差異.研究表明雌激素與吸煙之間存在協(xié)同效應(yīng)，可增強吸煙誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生[2].同時，雌激素還影響肺癌患者的預(yù)后[3-4]：接受過雌激素替代治療的肺癌患者死亡率高于未接受者，絕經(jīng)后女性肺癌死亡率低于老年男性.雌激素受體(ER)是雌激素發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，因此體內(nèi)雌激素受體水平直接與雌激素生理作用相關(guān).肺癌患者腫瘤組織中雌激素受體表達明顯高于腫瘤旁正常組織，并且與肺癌發(fā)生關(guān)系密切.本研究旨在探討雌激素與Notch通路在促進肺癌細胞增殖方面的關(guān)系.

1材料與方法

1.1試劑

NCI-H23(ATCC)，DMEM培養(yǎng)基(Sigma, 美國)，小牛血清(FBS)(Sigma, 美國)，結(jié)晶紫(Sigma, 美國)，噻唑藍(Sigma, 美國)、抗ERα、Bcl-2、Bax、PCNA、Notch1、Hes1一抗(cell signaling, 美國)，抗兔、羊二抗(Santa Cruz, 美國)，E2(Sigma, 美國)，DATP(Sigma, 美國)，Notch1 siRNA( Santa Cruz, 美國).

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

NCI-H23用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS置于37 ℃、CO25%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2MTT

NCI-H23長至80%融合時用0.25%胰酶消化，加入含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細胞密度至3×104/mL，以100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，E2組加入含E2終濃度為10-7mol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，E2+DAPT組加入含E2和DATP終濃度分別為10-7mol/L、10-5mol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，對照組加DMEM完全培養(yǎng)基.每組設(shè)6個復(fù)孔， 24 h后加入MTT 15 μL/孔孵育4 h，檢測570 nm吸光度值.實驗重復(fù)3次.

1.2.3細胞集落分析

NCI-H23細胞長至80%融合時0.25%胰酶消化，加入含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)，以500個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基處理組加入含E2 或E2+DAPT 的DMEM完全培養(yǎng)基(E2、DAPT濃度同1.2.2)，對照組加DMEM完全培養(yǎng)基，每組設(shè)2個復(fù)孔，每3 d換液.培養(yǎng)7 d后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入濃度為0.5%的結(jié)晶紫溶液1.5 mL，室溫靜置30 min，蒸餾水洗去多余結(jié)晶紫溶液，室溫晾干.實驗重復(fù)3次.

1.2.4PI檢測

NCI-H23細胞長至80%融合時0.25%胰酶消化，加入含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)，以3×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)6 h，待細胞完全貼壁后換成無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，吸去培養(yǎng)基，處理組加入含E2 或E2+DAPT 的DMEM完全培養(yǎng)基(E2、DAPT濃度同1.2.2)，對照組加DMEM完全培養(yǎng)基，每組設(shè)2個復(fù)孔.24 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗1次，0.25%胰酶消化，終止消化后1 200 r/min 離心5 min，PBS洗1次，加75%乙醇3 mL固定，-20 ℃保存.用前離心去除乙醇，加PI染液1 mL，流式細胞儀檢測DNA含量.實驗重復(fù)3次.

1.2.5siRNA干預(yù)

NCI-H23長至80%融合時0.25%胰酶消化，調(diào)整密度至10×104/mL，以2 mL /孔接種于6孔板中置37 ℃、CO25%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，處理組轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA，對照組轉(zhuǎn)染control siRNA.轉(zhuǎn)染24 h后吸去培養(yǎng)基，E2組加入含E2終濃度10-7mol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，對照組加DMEM完全培養(yǎng)基.

轉(zhuǎn)染液準備(單孔量)將4 μL siRNA滴入100 μL的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中制成溶液A；將6 μL siRNA轉(zhuǎn)染試劑滴入100 μL的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中制成溶液B.將溶液A加入到溶液B中制成轉(zhuǎn)染混合液，移液器上下輕輕混勻，室溫靜置30 min.往裝有轉(zhuǎn)染混合液的EP管中加入0.8 mL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，輕輕混勻.吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基潤洗細胞，最后加入轉(zhuǎn)染液.6 h后換液.再24 h后收集細胞提取總蛋白.實驗重復(fù)3次.

1.2.6Western Blot

NCI-H23長至80%融合后用0.25%胰酶消化，計數(shù)并接種4.5×105個細胞于6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后吸去培養(yǎng)基，經(jīng)過與1.2.2和1.2.5相同處理后收集細胞提取總蛋白.總蛋白提取方法如下：于冰上用細胞刮收集細胞后離心去除培養(yǎng)基，PBS洗1次，離心去除PBS后加蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑和PSMF)200 μL，移液器反復(fù)吹打并置于冰上60 min， 4 ℃ 10 000 rcf離心10 min，收集上清-80 ℃保存?zhèn)溆?蛋白于用前定量并制備成上樣樣品.電泳、轉(zhuǎn)膜、0.5%脫脂牛奶封閉，PBS洗膜5 min，孵育ERα、Bcl-2、Bax、PCNA、Notch1、Hes1一抗4 ℃過夜，PBS洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，PBS洗膜3次，每次10 min，ECL顯影.實驗重復(fù)3次.

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0對數(shù)據(jù)計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1E2促進NCI-H23細胞增殖

如圖1～5所示，10-7mol/L E2作用24 h后吸光度值高于對照組，表示E2處理后細胞活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞集落分析結(jié)果顯示用含E2 10-7mol/L的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后NCI-H23增殖形成的集落較對照組數(shù)量多、面積大，同等面積集落中E2處理組細胞多、著色深，說明E2處理可使細胞增殖速度加快.PI流式細胞術(shù)結(jié)果提示E2使S期NCI-H23細胞比例增加明顯，為對照組(cont組)的1.33倍，G0-G1期細胞比例降低.Western blot 結(jié)果顯示10-7mol/L E2作用24 h后PCNA 、Bcl-2表達增加，Bax表達減少，提示細胞在E2作用下增殖能力和抗凋亡能力增強.

圖1　E2對NCI-H23細胞增殖的影響(MTT)

圖2　E2對NCI-H23細胞增殖的影響(克隆培養(yǎng))

圖3　E2對NCI-H23細胞周期的影響

圖4　E2 對蛋白表達的影響(Western blot)

圖5　E2 對蛋白表達的影響

2.2DATP抑制E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖

如圖6～10所示，DATP+E2共同作用組細胞活性較E2單獨作用組明顯降低且低于cont組，兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示DATP不僅可以逆轉(zhuǎn)E2引起的細胞增殖，可能對腫瘤細胞本身的增殖也具有抑制作用；集落形成分析顯示DATP+E2共同作用組集落形成減少，細胞增殖速度減慢，與cont組接近，與E2組差異明顯，該結(jié)果與MTT結(jié)果一致；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示與E2組相比DATP+E2聯(lián)合作用的S期細胞比例下降，僅為E2組增殖期細胞的66%，G0-G1期細胞比例增加，同樣說明DATP能夠減慢E2引起的細胞快速增殖，與cont組相比DATP+E2組 S期細胞比例低于cont組，說明DATP+E2組細胞增殖較cont組慢，與MTT、集落分析結(jié)果吻合；Western blot 結(jié)果顯示DATP+E2共同處理的NCI-H23細胞與E2單獨作用組相比增殖相關(guān)蛋白Bcl-2、PCNA表達明顯降低，細胞增殖能力減弱，并且低于cont組.除上述結(jié)果外，圖9、圖10還顯示與cont組相比E2刺激使Notch1、Hes1表達升高，DATP+E2共同處理后的NCI-H23不僅Notch1、Hes1表達降低ERα表達也明顯減少，提示Notch1信號可能參與E2的促進細胞增殖作用，DATP+E2聯(lián)合作用導(dǎo)致的細胞增殖速度減慢、增殖能力下降或許與DATP抑制ERα表達有關(guān).

圖6　DATP對E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖的影響(MTT)

Fig.6The effect of DATP on NCI-H23 proliferation of E2-induced(MTT)

圖7　DATP對E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖的影響(克隆培養(yǎng))

Fig.7The effect of DATP on NCI-H23 proliferation of E2-induced (clone assay)

圖8　DATP對E2誘導(dǎo)增殖的NCI-H23細胞周期的影響

Fig.8The effect of DATP on cell cycle of NCI-H23 of E2-induced

圖9DATP對E2誘導(dǎo)增殖的NCI-H23細胞蛋白表達的影響(Western blot)

Fig.9The effect of DATP on protein expression in E2-induced NCI-H23(Western blot)

圖10DATP對E2誘導(dǎo)增殖的NCI-H23細胞蛋白表達的影響

Fig.10The effect of DATP on protein expression in E2-induced NCI-H23

2.3Notch信號通路參與E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖

如圖11～12所示，與cont相比Notch siRNA可以使NCI-H23細胞ERα表達減少，E2作用后Notch1 siRNA+E2組的ERα表達仍明顯低于E2單獨作用組，該結(jié)果與圖9～10描述相一致，并進一步佐證Notch1信號參與調(diào)節(jié)E2的生物作用.綜合圖9～12的提示，沉默Notch1后ERα表達受到抑制，抑制Notch1表達一定程度上可以削弱E2的作用.

3討論

雌激素是女性體內(nèi)維持女性健康的重要激素，是預(yù)防女性肺疾病的重要物質(zhì).近年來，人們對雌激素的認識不斷加深.研究顯示：雌激素參與調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖使女性更易罹患某種類型的肺癌[5]；血清雌激素水平和肺癌患者總生存期之間存在負相關(guān)關(guān)系[6]；非小細胞肺癌患者癌組織中雌激素水平高于正常肺組織[7-8].研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體水平不僅與腫瘤的形成有關(guān)，還刺激腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，因此也與肺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)[9].作為配體雌激素的生理病理作用均離不開其受體，因此在與雌激素有關(guān)的肺癌發(fā)生方面雌激素受體的作用不可取代.于肺癌患者癌組織中ERα和ERβ表達量增加均顯著.

圖11　siRNA 對蛋白表達的影響(Western blot)

Fig.11The effect of siRNA on protein expression (Western blot)

圖12　siRNA 對蛋白表達的影響

Notch信號通路為一條高度保守的信號通路，在細胞間信號傳遞中發(fā)揮重要作用，主要參與細胞增殖、分化、存活的調(diào)控，是胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵的信號通路之一.Notch信號錯誤可引發(fā)多種疾病，癌癥發(fā)生時Notch信號通路功能失調(diào).Notch1 是Notch受體中具有抑制凋亡、調(diào)控細胞周期、促進細胞增殖和存活功能的受體之一，也是乳腺癌中研究最多的Notch受體.可以通過激活ERα目的基因轉(zhuǎn)錄促進乳腺癌細胞增殖、刺激乳腺癌轉(zhuǎn)移等[10].Notch1在肺發(fā)育過程中表達于快速增殖的氣道上皮細胞中，參與肺上皮結(jié)構(gòu)的分化[11].起初對Notch1 在肺癌中的研究結(jié)果上是存在矛盾的，但新近研究一致認為非小細胞肺癌中Notch1表現(xiàn)為致癌作用，是重要的致癌基因.此外，Notch1還參與干細胞自我更新和增殖的調(diào)控，維持腫瘤干細胞干性，調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細胞分化[12-13].

作為至關(guān)重要的信號通路和非小細胞肺癌治療靶點，Notch信號通路無疑是新興的.目前關(guān)于ERα與Notch信號通路之間關(guān)系的研究主要集中于乳腺癌[14-15].基于二者在乳腺癌中的作用，我們推測Notch信號將參與雌激素誘導(dǎo)的肺癌細胞增殖.本實驗利用NCI-H23細胞觀察ERα與Notch信號通路在非小細胞肺癌細胞增殖中的表現(xiàn).首先利用E2干預(yù)確定雌激素對非小細胞肺癌的促增殖作用，結(jié)果顯示E2處理后NCI-H23細胞活性增強，處于增殖期細胞比例增加，抗凋亡蛋白和細胞增殖相關(guān)蛋白表達增加，說明細胞增殖能力提高，與現(xiàn)有研究一致；然后分別采用Notch抑制劑和siRNA干擾的方式判定Notch1 是否參與E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖，結(jié)果顯示Notch抑制劑和siRNA作用后，Notch1及其目的基因Hes1表達降低，ERα表達減少，NCI-H23細胞增殖能力減弱.因此我們認為Notch1信號通路參與E2誘導(dǎo)的NCI-H23細胞增殖，E2誘導(dǎo)NCI-H23細胞增殖部分依賴Notch1信號.

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Proliferation of NCI-H23 Promoted by ERα through Notch1 Signaling Pathway

Zhao Zhi-li, Han Ya-li

(School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Abstract:In order to explore the role of Notch1 signaling pathway in ERα-induced proliferation of NCI-H23, this research treats non-small cell lung cancer cells with E2, DATP or siRNA and analyzes the proliferation and protein expression of NCI-H23 by MTT, colony assay, PI assay and western blotting. The results show that E2 can enhance the proliferative ability with the proportion of NCI-H23 at S phase 1.33 fold of the controlled group. The expressions of Bcl-2 and PCNA in E2-treated cells are higher than the non-treated and Bax expression is decreased. The proliferative ability of DATP combined with E2 treatment declines evidently with P<0.01 and the cell proliferative proportion 0.66 time of E2 group. With the obvious increase of BAX expression and the decrease of cell viability, before treatment with E2 transfection Notch1 siRNA in NCI-H23, the results show that ERα expression is lower than the controlled siRNA. Thus it draws the conclusion that Notch signaling affects the E2-stimulated cell proliferation and the inhibition of Notch signaling can impair the influence of E2 in NCI-H23.

Key words:Notch1 signaling pathway; estrogen receptor; non-small cell lung cancer

收稿日期:2015- 07- 07

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30772739)

作者簡介:趙智麗(1986-)，女，博士研究生，主要研究方向為新藥物化學(xué)、抗腫瘤藥、中藥藥理.通信作者: 韓雅莉(1957-)，女，教授，主要研究方向為食品新藥物化學(xué)，E-mail:ylhan57@126.com

doi:10.3969/j.issn.1007- 7162.2016.03.016

中圖分類號:R318

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1007-7162(2016)03- 0088- 05