益氣復(fù)脈方對(duì)慢性心衰大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶活性調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張秋月，王保和，劉偉爽，鄧雅芳

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 300193)； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

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益氣復(fù)脈方對(duì)慢性心衰大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶活性調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張秋月1，王保和2，劉偉爽1，鄧雅芳1

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 300193)； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

摘要：目的觀察注射用益氣復(fù)脈方(凍干)(YQFM)對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑制因子(TIMPs)蛋白表達(dá)的影響，探討益氣復(fù)脈方對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用與心肌細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)重構(gòu)的相關(guān)性。 方法100只雄性wistar大鼠中隨機(jī)選取90只通過腹主動(dòng)脈縮窄法制作大鼠慢性心力衰竭模型，10只作為假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后8 w，以多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)≤60%為成模標(biāo)志。成模大鼠隨機(jī)分為6組：空白模型組、卡托普利組(卡托普利片4.88 mg/kg)、生脈組(生脈注射液4 mL/kg)及益氣復(fù)脈中、低、高(520 mg/kg，260 mg/kg，1040 mg/kg)劑量組。連續(xù)給藥14 d后，以HE染色法觀察大鼠心肌組織病理變化以蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)大鼠心肌組織中MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2的含量。結(jié)果與假手術(shù)組比較，空白模型組心肌間質(zhì)膠原纖維大量增生，EMC結(jié)構(gòu)顯著改變，可見局灶性纖維瘢痕；MMP-2、MMP-3、MMP-9含量顯著升高(P<0.01)，TIMP-1/2含量顯著降低(P<0.01)，MMP-2/TIMP-2比值升高為假手術(shù)組的4倍～6倍。與空白模型組比較，各治療組心肌肌束間及血管周圍膠原纖維出現(xiàn)輕、中度增生，MMP-2、MMP-3、MMP-9降低，TIMP-1/2升高，MMP-2/TIMP-2比值降低為假手術(shù)組的1～3倍。其中，YQFM各劑量組MMP-2、MMP-3、MMP-9含量顯著低于生脈組(P<0.05)，除YQFM低劑量組MMP-2顯著高于卡托普利組(P<0.05)外，其余各YQFM組MMP-2、MMP-3、MMP-9含量與卡托普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。YQFM各劑量組TIMP-2含量顯著高于生脈組(P<0.05)，與卡托普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；YQFM各劑量組TIMP-1含量與MMP-2/TIMP-2比值顯著低于卡托普利組(P<0.05)，與生脈組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)論慢性心衰大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增生、膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致EMC重構(gòu)，與基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)有關(guān)。益氣復(fù)脈方通過降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，維持 MMP-2/TIMP-2動(dòng)態(tài)平衡，抑制MMPs活性，改善慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的程度，緩解大鼠慢性心衰癥狀。

關(guān)鍵詞：慢性心衰；基質(zhì)金屬蛋白酶；組織抑制因子；益氣復(fù)脈方；蛋白質(zhì)印跡法

心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， EMC)的重構(gòu)是多種因素引起基質(zhì)膠原增生、膠原網(wǎng)結(jié)構(gòu)改變的過程，是慢性心力衰竭心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMPs)在EMC降解和膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)過程中起重要作用。本研究觀察益氣復(fù)脈方(YQFM)對(duì)慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)大鼠心肌組織中MMP-2， MMP-3， MMP-9及TIMP-1，TIMP-2蛋白表達(dá)的影響，探討益氣復(fù)脈方對(duì)MMPs系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用與EMC重構(gòu)的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1動(dòng)物100只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重220 g～250 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證號(hào)：SCXK(京)2009-0004]。每籠5只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑注射用益氣復(fù)脈(凍干)，每瓶裝0.65 g(相當(dāng)于紅參0.5 g，五味子0.75 g，麥冬1.5 g)，天津天士力之驕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20060463；產(chǎn)品批號(hào)：20130805)?？ㄍ衅绽科?2.5 mg，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31022986；產(chǎn)品批號(hào)：1402032)。生脈注射液，每支25 mL，江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20053993；產(chǎn)品批號(hào)：13070803)；MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2抗體(Abcam公司，美國(guó))由天津易生源生物技術(shù)有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器5418R低溫離心機(jī)、高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，BSA124S-CW電子天平(Sartorius公司，德國(guó))，移液槍(Eppendorf公司，法國(guó))，微量加樣吸頭(北京中衫金橋生物有限公司)，PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))，醫(yī)用X射線膠片(柯達(dá)公司，美國(guó))，通用顯影粉、酸性定影粉(天津天陸海感光材料廠)，電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、DYCZ-20C垂直電泳槽、DYCP-40C轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)，TS-8轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)。

1.4造模100只大鼠中隨機(jī)選取90只，依據(jù)文獻(xiàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備大鼠慢性心力衰竭模型[1]。術(shù)后8周，以多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)≤60%，同時(shí)大鼠出現(xiàn)體重減輕、精神萎靡、毛色無光澤作為心衰模型成功的標(biāo)志納入心衰模型組。余10只為假手術(shù)組，腹主動(dòng)脈只穿線不結(jié)扎，常規(guī)飼養(yǎng)12周。

1.5分組給藥將成模大鼠隨機(jī)分為6組：①空白模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)，常規(guī)飼養(yǎng)；②卡托普利組：1.56 mg/mL的卡托普利懸濁液，4.88 mg/kg，每日灌胃；③生脈組：生脈注射液4 mL/kg，尾靜脈注射；④益氣復(fù)脈中劑量組(YQFM-M)：注射用益氣復(fù)脈(凍干)0.65 g溶于4 mL生理鹽水，520 mg/kg，尾靜脈注射；⑤益氣復(fù)脈低劑量組(YQFM-L)：0.65 g藥物溶于8 mL生理鹽水，濃度為中劑量組的0.5倍，260 mg/kg 尾靜脈注射；⑥益氣復(fù)脈高劑量組(YQFM-H)：0.65 g藥物溶于2 mL生理鹽水，為中劑量組2倍濃度，1 040 mg/kg 尾靜脈注射。

1.6HE染色法觀察大鼠心肌病理改變連續(xù)給藥14 d后，處死大鼠，取出心臟，于左心室中部沿橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余心尖部迅速置于凍存管內(nèi)，液氮保存用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm～6 μm切片，脫蠟后HE染色，100倍鏡下觀察大鼠心肌組織病理變化。

1.7蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織中MMPs，TIMPs含量以Western blot法對(duì)心肌組織內(nèi)MMP-2，MMP-3，MMP-9以及TIMP-1，TIMP-2進(jìn)行半定量檢測(cè)。 收集大鼠心肌的培養(yǎng)細(xì)胞充分裂解后，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各細(xì)胞樣本相應(yīng)目的蛋白含量，提取總蛋白-80 ℃保存。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后將凝膠上分離到的蛋白條帶用半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。曝光及洗片后用image J軟件分析灰度值，并以各目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值， 計(jì)算相對(duì)灰度值，表示目的蛋白的含量。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況術(shù)后8 w，模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠出現(xiàn)：體重減輕、食量減少、精神萎靡、活動(dòng)度降低；皮毛干枯欠順滑、毛色暗黃無光澤，備皮部位毛發(fā)生長(zhǎng)緩慢、稀疏；四肢及尾部皮色淡白，尾靜脈充盈較差，血管纖細(xì)，顏色黯淡。給藥14 d后，各治療組大鼠活動(dòng)度明顯增強(qiáng)、皮毛光澤度增加；益氣復(fù)脈中/高劑量組大鼠四肢及尾部色澤紅潤(rùn)，尾靜脈充盈度較好，明顯優(yōu)于其他治療組。

2.2心肌組織 HE染色結(jié)果病理結(jié)果顯示：術(shù)后10周，假手術(shù)組大鼠心臟結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，心肌肌束間散在少量膠原纖維，心肌細(xì)胞排列規(guī)整(見圖A)?？瞻啄Ｐ徒M心肌肌束間及血管周圍膠原纖維顯著增生，可見灶性纖維瘢痕，心肌細(xì)胞萎縮或壞死，排列紊亂，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，ECM重度重構(gòu)(見圖B)。卡托普利組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，形態(tài)正常，偶見心肌肌束間及血管周圍膠原纖維增生，ECM重構(gòu)不明顯(見圖C)；YQFM中/高劑量組心肌肌束間及血管周圍膠原纖維輕度增生，偶見心肌細(xì)胞萎縮，心肌細(xì)胞排列規(guī)整，出現(xiàn)輕度ECM重構(gòu)見圖E/G；生脈組/YQFM低劑量組 心肌肌束間及血管周圍膠原纖維輕、中度增生，間質(zhì)血管輕度擴(kuò)張充血，偶見灶性區(qū)中度增生，局部心肌細(xì)胞萎縮，排列稍紊亂， ECM中度重構(gòu)(見圖D/F)。

注：A為假手術(shù)組 B為空白模型組 C為卡托普利組 D為生脈組 E/F/G為益氣復(fù)脈中/低/高劑量組

圖1各組大鼠心肌HE染色圖片(×100)

2.3心肌組織MMPs，TIMPs含量比較

2.3.1MMP-2，MMP-3，MMP-9相對(duì)灰度值比較與假手術(shù)組比較，空白模型組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。卡托普利組MMP-2，MMP-9灰度值與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，生脈組MMP-2，MMP-9灰度值與空白模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各治療組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值均顯著低于空白模型組(P<0.01，P<0.05)，顯著高于假手術(shù)組(P<0.05，P<0.01)。其中，YQFM各劑量組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值顯著低于與生脈組(P<0.05)；除YQFM低劑量組MMP-2灰度值顯著高于卡托普利組(P<0.05)外，其余各YQFM組MMP-2，MMP-3，MMP-9灰度值與卡托普利組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，詳見圖2。

表1　大鼠心肌組織MMP-2，MMP-3，MMP-9相對(duì)灰度值比較(±s)

2.3.2TIMP-1/2相對(duì)灰度值比較空白模型組大鼠TIMP-1/2灰度值顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)，給藥各組TIMP-1/2灰度值較空白模型組顯著上升(P<0.01或P<0.05)。其中，卡托普利組TIMP-1灰度值明顯高于生脈組及益氣復(fù)脈各劑量組(P<0.05)，與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。YQFM各劑量組TIMP-2灰度值顯著高于生脈組(P<0.05)，與卡托普利組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖2。

表2　大鼠心肌組織TIMP-1，TIMP-2，MMP-2/TIMP-2相對(duì)灰度值比較(±s)

2.3.3MMP-2/TIMP-2含量比值空白模型組大鼠MMP-2/TIMP-2比值顯著升高，達(dá)到假手術(shù)組的4倍～6倍(P<0.01)。與空白模型組比較，給藥各組MMP-2/TIMP-2比值顯著下降(P<0.01)，為假手術(shù)組的1倍～3倍；YQFM各劑量組與生脈組差異不明顯(P>0.05)，卡托普利組MMP-2/TIMP-2比值<1，顯著低于其他給藥組(P<0.05)。詳見表2。

注：A為假手術(shù)組 B為空白模型組 C為卡托普利組D為生脈組 E/F/G為益氣復(fù)脈中/低/高劑量組。

圖2各組大鼠MMPs，TIMPs蛋白含量條帶圖

3討論

在CHF進(jìn)展過程中，EMC合成與降解失衡，使心肌細(xì)胞間質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)與成分發(fā)生改變，從而導(dǎo)致心肌組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)功能的異常。存在于心肌中的MMPs活性的增強(qiáng)是心室重構(gòu)的始動(dòng)因素[2]。其中，明膠酶(MMP-2和MMP-9)、基質(zhì)分解素(MMP-3) 可分解多數(shù)ECM成分；MMP-3的活性早期升高有利于其它MMPs的激活[3]。因此，MMP-2、MMP-3、MMP-9是心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)時(shí)主要的酶。TIMPs是MMPs特異性內(nèi)源抑制因子，TIMPs與MMPs以1∶1(摩爾比)的比例結(jié)合形成的MMP-TIMP復(fù)合體的形式，抑制MMPs的活性。TIMP -1主要抑制MMP -1、MMP -3和MMP -9；TIMP -2主要抑制MMP -2，并只隨MMP -2表達(dá)而表達(dá)。通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，TIMPs可以阻斷活化的MMPs與膠原結(jié)合，進(jìn)而減少基質(zhì)降解[4]。MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡是維持心肌膠原纖維及心臟結(jié)構(gòu)正常的重要因素。研究表明，隨著MMPs活性升高，TIMPs是降低的[5]。在心肌病晚期，心肌內(nèi)MMPs活性升高，與TIMPs對(duì)MMPs的抑制作用喪失有關(guān)；減少M(fèi)MPs-TIMPs復(fù)合物水平可使MMPs活性升高[6]。

本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生病理學(xué)改變：正常形態(tài)的膠原網(wǎng)絡(luò)降解，異常結(jié)構(gòu)的膠原大量增生沉積，形成灶性纖維瘢痕，引發(fā)EMC重構(gòu)。這與CHF大鼠心肌MMP-2，MMP-3，MMP-9含量增加、活性增強(qiáng)，TIMP-1，TIMP-2含量下降、對(duì)MMPs抑制作用減弱，MMP-2/TIMP-2比值顯著升高有關(guān)。經(jīng)藥物治療后，各組MMPs含量下降，TIMPs含量升高。益氣復(fù)脈(凍干)對(duì)MMP-2，MMP-3，MMP-9的降低作用與對(duì)TIMP-2的升高作用與卡托普利等效，均優(yōu)于生脈注射液；益氣復(fù)脈(凍干)對(duì)TIMP-1的升高作用與對(duì)MMP-2 /TIMP-2比值的降低作用不及卡托普利，與生脈注射液無差異。

中醫(yī)學(xué)將慢性心衰歸為“心悸”“怔仲”“水腫”“咳喘”“痰飲”“心痹”等病癥的范疇。心氣不足、氣陰兩虛乃至心陽(yáng)虛衰、本虛標(biāo)實(shí)為其主要的證候演變規(guī)律。益氣復(fù)脈方來源于張?jiān)厮夺t(yī)學(xué)啟源》中的名方生脈散，謂之“人有將死脈絕者，服此能復(fù)生之，其功甚大”。生脈注射液是生脈散經(jīng)現(xiàn)代方法提取紅參、麥冬、五味子的有效成分制成，具有益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫之效。該制劑可提高心肌收縮力、增強(qiáng)心臟泵血，且毒性小、安全度大[7]，為改善心功能、緩解心衰癥狀的常用藥物。注射用益氣復(fù)脈(凍干)是目前唯一的凍干粉劑型的益氣復(fù)脈劑，采用冷凍干燥技術(shù)提取，95%以上的明確成分可通過指紋圖譜得到體現(xiàn)，較傳統(tǒng)水針劑更加穩(wěn)定、質(zhì)量更可控[8]。

本研究中模型組大鼠在術(shù)后8周出現(xiàn)明顯的慢性心衰體征：體重減輕、精神萎靡、活動(dòng)度下降、四肢及尾部微循環(huán)障礙。給藥后大鼠心衰癥狀明顯緩解，活動(dòng)度增強(qiáng)；而中/高劑量的益氣復(fù)脈(凍干)對(duì)心衰大鼠皮膚、四肢、尾靜脈循環(huán)狀態(tài)的改善作用明顯優(yōu)于卡托普利、生脈注射液及低劑量益氣復(fù)脈(凍干)。有關(guān)模型動(dòng)物中醫(yī)證型規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化的研究證明：睡眠剝奪后引起大鼠左室功能的降低，與氣陰兩虛時(shí)，血運(yùn)無力相吻合[9]。

慢性心衰大鼠心功能降低，出現(xiàn)氣陰兩虛證候時(shí)，益氣復(fù)脈方對(duì)大鼠循環(huán)障礙癥狀的緩解作用，既是其益氣養(yǎng)陰、益心復(fù)脈功效的體現(xiàn)。這可能與益氣復(fù)脈方能降低MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，升高TIMP-1，TIMP-2的含量，維持 MMP-2/TIMP-2動(dòng)態(tài)平衡，抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，改善慢性心衰大鼠心室重構(gòu)的作用有關(guān)。

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(本文編輯 薛妮)

Regulative Effects of Yiqifumai Injection on the Activity of Matrix Metalloproteinase in Rats with Chronic Heart Failure

Zhang Qiuyue，Wang Baohe，Liu Weishuang，Deng Yafang

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

Abstract：Objective To investigate the regulative effect of Yiqi Fumai injection(YFI) on the activity of matrix metalloproteinase (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) in rats with chronic heart failure(CHF)，and explore the regulation of YFI on MMPs and its correlation with the reconstruction of myocardial extracellular matrix(EMC).MethodsOne hundred Wistar rats were randomly divided into sham group (n=10) and model group(n=90).The CHF rat model was established by abdominal aortic banding.After 8 weeks of operation， rats were divided into 6 groups：blank model group， captopril group，Shengmai injection(SMI) group， YFI groups(high-，medium-，low-dosage).After 14 days， the myocardial pathological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 in myocardial tissue were detected by western blotting.ResultsCompared with sham group， myocardial interstitial collagen fibers proliferated， EMC structure changed，focal fibrous scars were visible in blank model group.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio increased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 decreased in blank model group.Compared with blank model group group，the light and moderate proliferation of collagen fibers appeared around myocardial muscle bundle and vessels in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-2/TIMP-2 ratio decreased while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 increased in captopril group， SMI group， YFI groups.The contents of MMP-2，MMP-3，MMP-9 in YFI groups were lower than that in SMI group(P<0.05).The content of MMP-2 in YFI low-dosage group was higher than that in captopril group(P<0.05).The contents of TIMP-2 in YFI groups were higher than that in SMI group(P<0.05).The content of TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2 ratio in YFI groups were lower than that in captopril group(P<0.05).ConclusionThe myocardial interstitial collagen proliferation and collagen structure changes induce the reconstruction of EMC in rats with CHF， which is relevant to the enhancement of MMPs activity.YFI can inhibit MMPs activity and improve myocardial EMC remodeling by by lowering the content of MMP-2，MMP-3，MMP-9， increasing the content of TIMP-1，TIMP-2， maintaining MMP-2/TIMP-2 homeostasis in rats with CHF.

Key words：chronic heart failure； matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of metalloproteinase；Yiqi Fumai injection；western blotting

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金項(xiàng)目(No.81173241)

通訊作者：王保和，E-mail： wbh3423@sina.com

中圖分類號(hào)：R541.6R289.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．009

文章編號(hào)：1672-1349(2016)08-0825-05

Corresponding Author：Wang Baohe (The Affiliated Second Hosipital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin，China)

(收稿日期：2015-08-11)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·