兩種培養(yǎng)基對(duì)羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響

弓慧敏， 白　瑞， 賈宗菲， 董常生， 龐全海*

(1山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部形態(tài)學(xué)教研室，太原　030025； 2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院； *通訊作者，E-mail：pangquanhai@126.com)

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兩種培養(yǎng)基對(duì)羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響

弓慧敏1， 白瑞2， 賈宗菲2， 董常生2， 龐全海2*

(1山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部形態(tài)學(xué)教研室，太原030025；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；*通訊作者，E-mail：pangquanhai@126.com)

摘要：目的比較K-SFM和DMEM/F12兩種培養(yǎng)基對(duì)羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響。方法取2-3歲羊駝背部皮膚，采用聯(lián)合酶消化法分離毛囊干細(xì)胞，用無血清角質(zhì)化培養(yǎng)基(K-SFM)和自配無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12)培養(yǎng)羊駝毛囊干細(xì)胞，比較羊駝毛囊干細(xì)胞的生長狀況，用CK19、integrin-β1特異性標(biāo)志物免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞。結(jié)果免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為羊駝毛囊干細(xì)胞。兩種培養(yǎng)基均能培養(yǎng)一定量的羊駝毛囊干細(xì)胞，培養(yǎng)基K-SFM有利于羊駝毛囊干細(xì)胞的增殖，細(xì)胞生長數(shù)量多，細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，增殖速度快；DMEM/F12培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞活力不強(qiáng)，傳代次數(shù)少，增殖速度慢。結(jié)論成功分離并鑒定了羊駝毛囊干細(xì)胞，建立了適于羊駝毛囊干細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)基，K-SFM培養(yǎng)基較自配培養(yǎng)基DMEM/F12更適合羊駝毛囊干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：羊駝；毛囊干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；免疫細(xì)胞化學(xué)

羊駝(Lama pacos)屬于哺乳綱、偶蹄目、駱駝科、美洲駝屬，其毛具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。羊駝毛有22種自然色澤，羊駝毛織成的衣服輕盈、柔軟，是半細(xì)毛類中特別優(yōu)良的毛纖維，被視為紡織品中的“軟黃金”。

目前，有關(guān)毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells，F(xiàn)SC)的分離培養(yǎng)，在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中以鼠的觸須毛囊[1-3]、外科獲取的人頭皮樣本[4]為毛囊干細(xì)胞的組織來源。樣本經(jīng)中性蛋白酶DispaseⅡ酶處理，分離去除表皮，或者用胰酶/EDTA處理的毛囊組織，獲得單細(xì)胞懸液培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，角化細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等[5,6]，而在體內(nèi)(移植后)可分化為神經(jīng)元、黑色素細(xì)胞等。另外，毛囊干細(xì)胞還能分化成毛囊、皮脂腺、表皮[7]等，毛囊周期生長是由毛囊干細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的共同作用完成。因此，毛囊干細(xì)胞對(duì)毛發(fā)的再生以及毛色的影響起著重要的作用[8,9]。由于羊駝皮膚組織更新速度快、再生能力強(qiáng)，來源充足、取材方便、創(chuàng)傷小，其對(duì)自體細(xì)胞構(gòu)建的組織不存在排斥反應(yīng)，可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增，因此，來自皮膚局部的干細(xì)胞受到了重視。

由于羊駝皮膚毛囊相對(duì)大鼠毛囊要細(xì)小，單根毛發(fā)顯微切割過程持續(xù)時(shí)間長，容易污染，而且工作強(qiáng)度大。DispaseⅡ酶屬于中性蛋白酶，常用來分離皮膚的表皮和真皮進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[10,11]，是分離組織和細(xì)胞的一種性質(zhì)穩(wěn)定的消化酶，它不損傷細(xì)胞膜[12-14]。本實(shí)驗(yàn)初步探討了羊駝毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，為羊駝毛發(fā)及毛色的研究以及干細(xì)胞分化成其他功能細(xì)胞的研究建立了一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。

1材料和方法

1.1動(dòng)物

2-3歲雌性羊駝，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝養(yǎng)殖基地(原種引自澳大利亞)。

1.2主要試劑及其配制

牛血清白蛋白(BSA)、胰島素樣生長因子(IGF-1)均購自美國Sigma公司。DispaseⅡ酶購自美國Gibco公司。胰蛋白酶購自美國Sigma公司。EDTA購自美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程有限公司。CK19和β1-整合素購自武漢博士德生物工程有限公司。

K-SFM無血清培養(yǎng)基：1 000 ml K-SFM+5 μl/ml BPE+0.1 μl/ml EGF+0.5 μg/ml氫化可得松+5 μl/ml胰島素，均購自美國Gibco公司。

DMEM/F12自配培養(yǎng)基：1 000 ml DMEM/F12+2%BSA+100 ng/ml EGF+0.5 μg/ml氫化可得松+5 μl/ml胰島素+10 ng/ml IGF-1。

1.3毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取羊駝背部直徑約0.8 cm的皮膚樣本，置DMEM培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆谩⑵つw樣本置于75%乙醇中消毒3 min，無菌操作移入PBS中，用眼科鑷和眼科剪及手術(shù)刀片刮去皮膚表面臟物，去除真皮脂肪組織；將樣本切成約0.2 cm×0.3 cm的條塊，用含雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)的PBS沖洗4次，將其浸泡在0.2%DispaseⅡ酶中，37 ℃消化2 h。取出組織置于PBS中用眼科鑷分離毛囊，PBS中漂洗毛囊后，置于0.25%胰蛋白酶∶0.02% EDTA(1∶1)中37 ℃消化2 min，終止液終止消化，用彎頭滴管吹打，200目濾網(wǎng)過濾，將濾過物1 000 r/min離心10 min，移入24孔培養(yǎng)板上，置于37 ℃，飽和溫度，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)第1,3,5代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察比較。

1.4細(xì)胞生長曲線測(cè)定

分別取K-SFM和DMEM/F12兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長良好的第3代羊駝毛囊干細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔0.2 ml，分為2組，分別采用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的生長狀況并拍照，同時(shí)每天每組取3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，繪制細(xì)胞生長曲線，分析不同培養(yǎng)基對(duì)羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響。

1.5細(xì)胞克隆形成率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15-17]的方法，分別取K-SFM和DMEM/F12兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的第3代細(xì)胞稀釋成克隆密度(1細(xì)胞/μl溶液)，每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，分別培養(yǎng)7-9 d，固定后用姬姆薩法染色，在解剖鏡下計(jì)克隆數(shù)，按式計(jì)算，克隆形成率=克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%[15-17]。

1.6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)志CK和integrin-β1

選用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長良好的第3代細(xì)胞，用0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)37 ℃消化3 min，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于12孔板上的其中6孔，每孔預(yù)先放入處理好的細(xì)胞爬片(蓋玻片)。將接種好的12孔板放入37 ℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)3-5 d，細(xì)胞達(dá)到70%左右時(shí)，吸出預(yù)檢測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，用緩沖液DPBS清洗細(xì)胞爬片后，用4%多聚甲醛固定爬片20-30 min，DPBS沖洗除去固定液，按免疫組化試劑盒操作程序進(jìn)行CK19、integrin-β1免疫細(xì)胞化學(xué)染色(CK19、integrin-β1為源于人、小鼠、大鼠的多克隆抗體)，分兩組，每組3孔。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較

用K-SFM分離培養(yǎng)第1代羊駝毛囊干細(xì)胞，第2天可見部分細(xì)胞貼壁(細(xì)胞周圍無光暈)，部分未貼壁(細(xì)胞周圍有光暈)，在開始培養(yǎng)的3 d內(nèi)，細(xì)胞呈圓形，未伸展成多角形的形態(tài)，從第6天開始可見呈多角形的細(xì)胞，形成幾個(gè)細(xì)胞聚集的呈小島狀均勻分布小克隆(見圖1A)，此后細(xì)胞增殖加速，10-15 d細(xì)胞可接近融合，鏡下觀察毛囊干細(xì)胞呈扁平多角形或鋪路石狀(見圖1B)。

用DMEM/F12分離培養(yǎng)第1代羊駝毛囊干細(xì)胞，前3 d與KSF培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞無明顯差別，第6天形成小的、不明顯的聚集，細(xì)胞開始增殖，呈圓形，未伸展成多角形的形態(tài)(見圖1E)，一直到第11天才會(huì)呈均勻分布狀態(tài)，細(xì)胞集落中細(xì)胞的大小不等，形態(tài)不一，有些細(xì)胞呈老化狀態(tài)，體積變大，出現(xiàn)空泡(見圖1F)。

胰酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，加培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞進(jìn)行傳代，按1∶2傳，K-SFM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基的兩組細(xì)胞均為第2天開始貼壁生長。K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀況良好，呈克隆狀小島樣生長，形態(tài)一致，3-5 d多個(gè)小島樣克隆匯合，排列緊密，只有少量懸浮細(xì)胞(見圖1C，D)，前10代細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，12代開始細(xì)胞生長緩慢，形成的小島樣克隆較小且不規(guī)則，小克隆之間匯合時(shí)間延長至12 d，細(xì)胞普遍較大，排列疏松，出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象，能傳代生長至15代，另外，在消化過程中，12代以后的細(xì)胞不易脫落，胰酶消化時(shí)間逐漸延長，可延長至10 min。而DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢，貼壁細(xì)胞相對(duì)要少，相對(duì)不易貼壁，總有部分細(xì)胞呈半貼壁狀態(tài)，懸浮細(xì)胞多，不易匯合，需一周左右才能匯合，細(xì)胞體積較大，排列疏松，第5代開始逐漸老化，只可傳代至8代(見1G，H)。

兩種培養(yǎng)基均能培養(yǎng)擴(kuò)增一定量的羊駝毛囊干細(xì)胞，但K-SFM培養(yǎng)基有利于羊駝毛囊干細(xì)胞的增殖，細(xì)胞生長數(shù)量多，細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，增殖速度快，而DMEM/F12培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞活力不強(qiáng)，傳代次數(shù)少，增殖速度慢。

A-D分別為K-SFM培養(yǎng)基第1代第6，10天、3代第7天和5代第6天;E-H分別為DMEM-F12培養(yǎng)基第1代第6和11天d、3代第6天和5代第6天圖1　兩種培養(yǎng)基羊駝毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)和傳代的形態(tài)學(xué)觀察比較 (×200)Figure 1　Comparison of the morphology of hair follicle stem cells between two culture mediums (×200)

2.2兩種培養(yǎng)基對(duì)毛囊干細(xì)胞生長的影響

從第3代細(xì)胞生長曲線可以看出，兩種培養(yǎng)基中毛囊干細(xì)胞在接種前2 d生長緩慢，2-4 d進(jìn)入倍增期，此后兩組之間細(xì)胞增長走勢(shì)不同，K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)入倍增期后仍然保持增殖態(tài)勢(shì)，沒有明顯平臺(tái)期，而DMEM-F12培養(yǎng)基毛囊干細(xì)胞增殖緩慢，進(jìn)入倍增期，從第5天開始出現(xiàn)接觸抑制，生長速度減慢，進(jìn)入平臺(tái)期(見圖2)。K-SFM組和DMEM-F12組間細(xì)胞增殖數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3兩種培養(yǎng)基對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖的影響

由圖3可看出，兩種培養(yǎng)體系對(duì)羊駝毛囊干細(xì)胞克隆形成率有明顯的影響，K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)基細(xì)胞克隆形成率明顯高于DMEM-F12培養(yǎng)基細(xì)胞的克隆形成率，而且兩種培養(yǎng)體系都是第5代干細(xì)胞克隆形成率高于第3,7,9代。通過t檢驗(yàn)，K-SFM組和DMEM-F12組之間細(xì)胞克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

同一時(shí)間與K-SFM組比較,*P<0.01圖2 第3代羊駝毛囊干細(xì)胞生長曲線Figure2 Thegrowthcurveofpassage3alpacahairfolliclesstemcellsbetweentwogroups

2.4毛囊干細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

CK19、integrin-β1是毛囊干細(xì)胞及祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行上述指標(biāo)檢測(cè)，羊駝毛囊干細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果可以看出，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞CK19均呈現(xiàn)陽性，在細(xì)胞膜內(nèi)外表達(dá)，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈褐色(見圖4A、B)，而空白對(duì)照無表達(dá)，作為陰性對(duì)照(見圖4C)。兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞integrin-β1也呈陽性表達(dá)，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈褐色(見圖4D、E)，而空白對(duì)照無表達(dá)，作為陰性對(duì)照(見圖4F)。

相同代次與K-SFM組比較，*P<0.01圖3　不同代次兩組羊駝毛囊干細(xì)胞克隆形成率比較Figure3　Comparison of clone formation rate in different passage between two groups

A-C分別為K-SFM培養(yǎng)第3代細(xì)胞CK19陽性表達(dá)、integrin-β1陽性表達(dá)、對(duì)照組;D-F分別為DMEM/F12培養(yǎng)第3代細(xì)胞CK19陽性表達(dá)、integrin-β1陽性表達(dá)、對(duì)照組圖4　毛囊干細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 (×300)Figure 4　Immunocytochemical identification of hair follicle stem cells (×300)

3討論

本實(shí)驗(yàn)選用的兩種培養(yǎng)基均為無血清培養(yǎng)基。雖然血清中含有多種黏附因子可促進(jìn)細(xì)胞貼壁，但血清的成分復(fù)雜，可促進(jìn)細(xì)胞復(fù)層化和分化[12]，故實(shí)驗(yàn)中采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。此外，研究顯示血清中的一些成分和Ca2+可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分裂促其分化，最終細(xì)胞發(fā)生老化、凋亡[18]，使用無血清培養(yǎng)基可以排除血清中許多未知因素的干擾，并減少動(dòng)物血清帶來的不利影響[10,12]。

許多研究報(bào)道，毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為無血清角質(zhì)化培養(yǎng)基[1,11,18,19]和自配無血清培養(yǎng)基DMEM/F12[3,12,20]，故本實(shí)驗(yàn)采用這兩種培養(yǎng)基進(jìn)行比較培養(yǎng)，旨在選擇更適合羊駝毛囊干細(xì)胞的生長條件。在角朊細(xì)胞生長過程中存在兩種主要的生長因子增殖信號(hào)途徑，即胰島素激活途徑和表皮生長因子(EGF)激活途徑[2]，故在培養(yǎng)基中添加胰島素和EGF。鑒于氫化可的松可抑制成纖維細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的增殖[10,21]，能夠進(jìn)一步的純化毛囊干細(xì)胞，故此實(shí)驗(yàn)中在培養(yǎng)體系中添加了氫化可的松。

K-SFM培養(yǎng)基富含銅、硒、鋅等微量元素和豐富的必需氨基酸，可為毛囊干細(xì)胞的生長提供良好的營養(yǎng)[10,18]，獲得較純的毛囊干細(xì)胞，且具有良好的增殖能力，能形成較多的克隆。

形態(tài)學(xué)觀察顯示，兩種培養(yǎng)基均能培養(yǎng)一定量的羊駝毛囊干細(xì)胞，K-SFM培養(yǎng)基細(xì)胞生長數(shù)量多，細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，增殖速度快，DMEM/F12培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞活力不強(qiáng)，傳代次數(shù)少，增殖速度慢。由此可知，K-SFM培養(yǎng)基更利于羊駝毛囊干細(xì)胞的生長和增殖，在體外培養(yǎng)條件下，無血清K-SFM培養(yǎng)基更能保持毛囊干細(xì)胞高增殖、低分化的生長特性。

外根鞘細(xì)胞與表皮細(xì)胞均屬于上皮細(xì)胞，但它們?cè)隗w內(nèi)表達(dá)的角蛋白具有明顯的差異，表皮細(xì)胞表達(dá)CK1和CK10等分子量較大的分化標(biāo)記蛋白，而在毛囊外根鞘中表達(dá)CK6、CK16和CK19等分子量較小的增殖相關(guān)角蛋白[22]，CK19可作為皮膚干細(xì)胞的標(biāo)記[23]。β1整合素被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[12]，Moll[24]發(fā)現(xiàn)β1整合素在毛囊部和基質(zhì)處的角質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)，β1整合素陽性細(xì)胞包含了干細(xì)胞和部分祖細(xì)胞[12]。故本實(shí)驗(yàn)選用CK19和β1整合素做羊駝毛囊干細(xì)胞的分子標(biāo)記物，實(shí)驗(yàn)表明，均為陽性表達(dá)，與史明艷等[20]對(duì)山羊毛囊干細(xì)胞的鑒定結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)利用DispaseⅡ酶分離毛囊的真皮鞘以純化培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞，再用胰酶消化毛囊得到毛囊干細(xì)胞。這樣避免了拔毛法造成毛囊的損傷和工作量大等問題，而且減少了操作過程中的污染問題，也減少了成纖維細(xì)胞的生長，提高了毛囊干細(xì)胞的純度。

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Effect of two kinds of culture medium on the alpaca hair follicle stem cell growth and proliferation

GONG Huimin1, BAI Rui2, JIA Zongfei2, DONG Changsheng2, PANG Quanhai2*

(1DepartmentofMorphology,JinciCollegeofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030025,China;2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:pangquanhai@126.com)

Abstract：ObjectiveTo compare the effect of K-SFM and DMEM/F12 on alpaca hair follicle stem cell growth and proliferation.MethodsSkins were collected from the back of 2-3-year-old alpaca. The alpaca hair stem cells were disassociated with collagenase and trypsin. The keratinocyte serum free medium(K-SFM) and the self-made serum-free medium (DMEM/F12) were used to culture the alpaca follicle stem cells, and then the growth conditions were compared. The expression of CK19 and integrin-β1 was detected in stem cells.ResultsThe cultured cells expressed CK19 and integrin-β1 and desmin in cytoplasm, demonstrating that they were indeed alpaca hair follicle stem cells. Some alpaca hair follicle stem cells were cultured in both two kinds of medium. K-SFM was beneficial to the growth of the alpaca follicle stem cells, with a large number of the cells, the powerful ability of cellclone formation, and the rapid reproduction. After cultured with DMEM/F12, the number of the alpaca follicle stem cells was less, its vitality was lower, its passage was decreased, and its reproduction was slower.ConclusionThe present study successfully isolate and identify the alpaca hair follicle stem cells, and K-SFM medium is more suitable for the culture of alpaca hair follicle stem cells in vitro.

Key words:alpaca;hair follicle stem cells;cell culture;immunocytochemistry

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972223);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(412528);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后基金資助項(xiàng)目(614114)

作者簡介：弓慧敏，女，1983-05生，碩士，助教，E-mail：397362842@qq.com

收稿日期：2016-01-10

中圖分類號(hào)：R329.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)05-0424-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.006