抑郁小鼠大腦GABA及谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)變化*

吳　瓊,宋靖方,張小玲,蔡弘揚(yáng),常全忠

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抑郁小鼠大腦GABA及谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)變化*

吳瓊1,宋靖方2,張小玲1,蔡弘揚(yáng)1,常全忠3△

[摘要]目的研究抑郁癥發(fā)病中GABA及谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的變化。方法小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組，使用社會(huì)失敗模型對(duì)對(duì)照組小鼠造模，之后將其分為對(duì)抑郁癥敏感組及對(duì)抑郁癥不敏感組。將3組小鼠分別提取突觸蛋白，并使用Western blot檢測(cè)VGAT及VGLUT1表達(dá)豐度。結(jié)果對(duì)抑郁癥敏感組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，在接觸區(qū)域的停留時(shí)間顯著降低，且在角落區(qū)域的停留時(shí)間顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在前額葉皮層、海馬中和對(duì)照組與對(duì)抑郁癥不敏感組比較，對(duì)抑郁癥敏感組VGLUT1及VGAT的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)抑郁癥不敏感組與對(duì)照組相比其VGAT及VGLUT1水平的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在紋狀體，雖然對(duì)抑郁癥敏感組的小鼠VGAT及VGLUT1的表達(dá)水平均有增加(P<0.05)，但是對(duì)抑郁癥不敏感的小鼠這些蛋白表達(dá)也顯著增加。結(jié)論在抑郁癥發(fā)病中前額葉皮層及海馬興奮性與抑制性囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)異常，這可能與抑郁癥神經(jīng)遞質(zhì)紊亂有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]抑郁癥；谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；γ-氨基丁酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

抑郁癥是目前最高發(fā)的精神疾病,它的發(fā)病以青壯年為主，并且自殺率高、診斷率低，為社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)；目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，以往的研究多數(shù)集中在5-HT及膽堿能神經(jīng)元的研究上[1-2]。近年來的研究認(rèn)為，抑郁癥發(fā)病中GABA能與谷氨酸能突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)，突觸可塑性也發(fā)生了改變[3-4]；而對(duì)突觸體中GABA及谷氨酸的表達(dá)尚少見研究。GABA囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體(VGAT)及谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體(VGLUT)是參與GABA能與谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)包裝的重要囊泡蛋白，在GABA能與谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮重要作用[5]。本研究分別在前額葉皮層、海馬、紋狀體中提取突觸體，并針對(duì)抑郁癥發(fā)病后突觸體中VGAT與VGLUT的水平變化進(jìn)行探討，為研究抑郁癥發(fā)病中GABA能與谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)的變化提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10周齡C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量22～25 g;24周齡CD1雄性退役種鼠22只。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，3～4只小鼠一籠，自由攝食、飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑VGAT單克隆抗體(抗鼠)、VGLUT單克隆抗體(抗鼠)購于Synaptic system公司，HRP-羊抗鼠二抗購于英韋創(chuàng)津公司，BCA試劑盒購于Thermo scientific，蛋白酶抑制劑購于羅氏公司。

1.2方法

1.2.1社會(huì)失敗模型根據(jù)Nestler教授提供的方法[6]，在該模型中，單籠飼養(yǎng)的被測(cè)小鼠與一只完全不熟悉的帶有攻擊性的CD1小鼠放在一起10 d，每天10 min攻擊時(shí)間，其余時(shí)間用一個(gè)刻有漏洞的塑料蓋板分開。對(duì)照小鼠與其相同品系但不熟悉的小鼠放在一起，每天接觸10 min，后用刻有漏洞的塑料隔板分開。其行為學(xué)指標(biāo)通過社會(huì)回避實(shí)驗(yàn)測(cè)定。社會(huì)回避實(shí)驗(yàn)的方法如下：首先將小鼠放入一50 cm×50 cm×20 cm的塑料盒中，盒子一側(cè)中央放置一個(gè)透明有孔的有機(jī)玻璃盒子，高15 cm。有機(jī)玻璃盒周圍劃出接觸區(qū)域，而對(duì)面角落的區(qū)域則劃為角落區(qū)域。記錄2.5 min內(nèi)小鼠在接觸區(qū)域的停留時(shí)間，記為T1，然后將小鼠放回原鼠籠休息1 min，用70%的乙醇擦拭塑料盒，以去除小鼠的氣味。然后將CD1小鼠放于有機(jī)玻璃盒中，將實(shí)驗(yàn)小鼠再次放回盒內(nèi)，記錄2.5 min內(nèi)小鼠在接觸區(qū)域的停留時(shí)間，記為T2。以T2與T1的比值作為檢測(cè)指標(biāo)，當(dāng)比值大于1時(shí)，將小鼠定為對(duì)該刺激不敏感的小鼠，反之當(dāng)比值小于1時(shí)，定為對(duì)該刺激敏感的小鼠。

1.2.2突觸小體的提取根據(jù)社會(huì)回避實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)照組、對(duì)抑郁癥敏感組和對(duì)抑郁癥不敏感組的小鼠，每組各4只。根據(jù)Duman教授提供的方法[7]，被選取的小鼠分別斷頭取腦，在冰上快速分離前額葉皮層、海馬、紋狀體。取出的組織塊放在溶液(0.32 mol/L蔗糖，20 mmol/L HEPES緩沖液，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L 氟化鈉，1 mmol/L 礬酸鈉及0.1 g/L蛋白酶抑制劑)中研磨，其勻漿液在 4 ℃,2 800 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min。取其上清液再次離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min。棄上清液，沉淀用溶液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L 氯化鈉，1% Triton X-100,0.1% SDS，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L偏礬酸鈉，5 mmol/L氟化鈉及0.1 g/L蛋白酶抑制劑)溶解并超聲。蛋白濃度通過BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)。

1.2.3Western blot電泳將提取的突觸小體的樣品與上樣緩沖液混合，放入沸水中加熱10 min。取20 μg蛋白上樣，通過10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。取脫脂奶粉封閉1 h，一抗(稀釋比例1∶1 000)4 ℃過夜。次日，膜通過TBST溶液清洗3遍后，加入二抗孵育1 h，再次用TBST溶液清洗并轉(zhuǎn)移至暗室內(nèi)通過顯影儀顯影。蛋白豐度使用FluorChemTM軟件分析測(cè)定。

2結(jié)果

2.1小鼠的社會(huì)回避行為小鼠被分為8只對(duì)照組小鼠和22只造模小鼠，通過社會(huì)失敗模型，剔除死亡小鼠后，將造模組小鼠分為對(duì)抑郁癥敏感組及對(duì)抑郁癥不敏感組。在社會(huì)回避行為實(shí)驗(yàn)中，對(duì)抑郁癥敏感組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，在接觸區(qū)域的停留時(shí)間顯著降低且在角落區(qū)域的停留時(shí)間顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A:小鼠分為對(duì)照組、敏感組和不敏感組。B、C：小鼠經(jīng)過造模后，對(duì)抑郁癥敏感組的小鼠與對(duì)照小鼠相比，當(dāng)有CD1存在時(shí)在中間區(qū)域停留時(shí)間縮短，在角落區(qū)域停留時(shí)間顯著增加。*：P<0.05，與對(duì)照組相比。

圖1小鼠的社會(huì)回避行為

圖2　抑郁癥中前額葉皮層突觸小體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化

圖3　抑郁癥中海馬突觸小體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化

2.2皮層、海馬及紋狀體突觸囊泡蛋白表達(dá)的變化在前額葉皮層、海馬中與對(duì)照組和對(duì)抑郁癥不敏感組比較，對(duì)抑郁癥敏感組VGLUT1及VGAT的表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)抑郁癥不敏感組與對(duì)照組相比其VGAT及VGLUT1水平的表達(dá)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、3。

在紋狀體，雖然對(duì)抑郁癥敏感組的小鼠VGAT及VGLUT1的表達(dá)水平均有增加(P<0.05)，但是對(duì)抑郁癥不敏感的小鼠這些蛋白表達(dá)也顯著增加(圖4)。

圖4　抑郁癥中紋狀體突觸小體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化

3討論

大腦興奮的傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)紊亂是近年來抑郁癥的研究熱點(diǎn)。但是，目前的研究大多數(shù)基于腦組織的全蛋白的提取，并不能確切反映突觸中各種興奮性和抑制性遞質(zhì)的變化。與前人的工作相比，作者在造模后對(duì)提取的突觸蛋白進(jìn)行檢測(cè)，這使得樣本更加單純，并且提高了結(jié)果的特異性。前額葉皮層與海馬均與多個(gè)腦區(qū)有突觸的聯(lián)系，是抑郁癥發(fā)病的最關(guān)鍵腦區(qū)，紋狀體是本研究的對(duì)照腦區(qū)。

VGLUT在突觸系統(tǒng)中介導(dǎo)谷氨酸的傳遞，有3種存在形式：VGLUT1、2、3[8]。其中VGLUT1主要分布于大腦皮層、海馬、小腦中，VGLUT2主要分布于皮層下及部分多巴胺神經(jīng)元中[9-10]，而VGLUT3則主要分布與特定的神經(jīng)元中，如5-羥色胺能神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元及GABA能和部分谷氨酸能神經(jīng)元等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥發(fā)病中，谷氨酸水平升高，NMDA受體過度激活；NMDA受體拮抗劑開他敏可產(chǎn)生快速的抗抑郁效應(yīng)[7]。前額葉皮層和海馬是抑郁癥發(fā)病的兩個(gè)重要腦區(qū)；作者選用VGLUT1探索前額葉皮層及海馬的VGLUT表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)抑郁癥發(fā)病中該蛋白水平的上調(diào)。這提示抑郁癥發(fā)病中興奮性傳遞升高，并可能因此引起神經(jīng)傳遞的紊亂。

GABA是大腦中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要由谷氨酸脫羧酶合成[12]。除了作為神經(jīng)遞質(zhì)的功能外，它還是神經(jīng)發(fā)生及神經(jīng)修復(fù)中重要的營(yíng)養(yǎng)因子，并且參與調(diào)節(jié)氧化還原電位[13-14]。GABA與谷氨酸共同維持神經(jīng)興奮的平衡，這是避免情緒障礙等發(fā)生的關(guān)鍵。目前的研究普遍認(rèn)為，在抑郁癥發(fā)病中，谷氨酸濃度升高，GABA濃度降低并因此引起興奮的失調(diào)。在本研究中并未發(fā)現(xiàn)VGAT水平的下降，這與以往的研究并不沖突，本樣本來自突觸，故VGAT不能代表總的GABA水平。對(duì)前額葉皮層和海馬的研究結(jié)果提示抑郁癥發(fā)病時(shí)負(fù)責(zé)GABA突觸傳遞的囊泡蛋白VGAT水平顯著增加，這可能是機(jī)體為了對(duì)抗谷氨酸受體的激活而采取的保護(hù)性措施。

經(jīng)過社會(huì)失敗造模后，小鼠紋狀體內(nèi)VGLUT1及VGAT表達(dá)均增加，而對(duì)抑郁癥敏感組和對(duì)抑郁癥不敏感組小鼠蛋白表達(dá)水平相比則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示，在抑郁及抗抑郁過程中紋狀體內(nèi)VGLUT1和VGAT表達(dá)變化均增加，不具有腦區(qū)特異性。

本研究認(rèn)為，經(jīng)過社會(huì)失敗造模后，小鼠前額葉皮層、海馬等腦區(qū)突觸前活動(dòng)增多、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，使得突觸中VGLUT1及VGAT表達(dá)均增高。這提示，在抑郁癥發(fā)病中興奮性與抑制新神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多，并可能引起突觸功能紊亂，在臨床工作中維持相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)的水平有可能有助于抗抑郁治療。作者將對(duì)這些結(jié)論再進(jìn)行深入探討，探索治療抑郁癥的新突破點(diǎn)。

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(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校：1.病理生理學(xué)教研室；2.醫(yī)療系；3.生理學(xué)教研室，河南漯河 462002)

Expression of GABA and glutamate vesicular transporter in depressed mice*

Wu Qiong1,Song Jingfang2,Zhang Xiaoling1,Cai Hongyang1,Chang Quanzhong3△

(1.Department of Pathophysiology;2.Department of Medicine;3.Department of Physiology, Luohe Medical College,Luohe,Henan 462002,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of vesicular GABA transporter and vesicular glutamate transporter 1 in depression.MethodsMice was divided into control group and defeat group stochastically.By social defeat model and social avoidance,the defeat group was divided into two groups:susceptible group and unsusceptible group.Synaptic proteins were extracted respectively from the 3 groups.We detected the expression abundance of VGAT and VGLUT1 by Western blot.ResultsCompared with the control group,in susceptible group, the residence time in the contact area was significantly reduced, and the residence time in the corner area was significantly increased, with statistical difference(P<0.05).In the prefrontal cortex and hippocampus,Compared with the control group and the unsusceptible group,the expression levels of VGLUT1 and VGAT were increased in the susceptible group(P<0.05).there were no statistically significant in VGLUT1 and VGAT leveles between control group and the unsusceptible group(P>0.05).In the striatum,although the expression levels of VGAT and VGLUT1 were increased in susceptible group,but in unsusceptible group, the expression of these proteins also increased significantly.ConclusionThe prefrontal cortex and hippocampus excitability and inhibitory vesicle transport were changed in depression,which may relate to the transcription disorder.

[Key words]depression;GABA transporter;vesicular glutamate transporter

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.009

* 基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目基金(15B180012)；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校博士啟動(dòng)基金(2014-DF-004)。

作者簡(jiǎn)介：吳瓊(1985-)，副教授，博士，主要從事抑郁癥發(fā)病機(jī)制研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：253043893@qq.com。

[中圖分類號(hào)]R749.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1470-03

(收稿日期：2015-10-25修回日期：2015-12-30)