銀納米顆粒對(duì)膽固醇熒光的增強(qiáng)效用研究

王靜靜，吳 瑩，劉 瑩，蔡廷棟，孫 松

江蘇師范大學(xué)物理與電子工程學(xué)院，江蘇 徐州 221116

銀納米顆粒對(duì)膽固醇熒光的增強(qiáng)效用研究

王靜靜，吳 瑩，劉 瑩*，蔡廷棟，孫 松

江蘇師范大學(xué)物理與電子工程學(xué)院，江蘇 徐州 221116

在傳統(tǒng)熒光光譜技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合金屬納米顆粒的增強(qiáng)熒光技術(shù)，探索提高熒光光譜技術(shù)檢測(cè)人全血溶液中膽固醇含量的精度和分辨率的方法。實(shí)驗(yàn)研究方面，采用波長(zhǎng)為407 nm的激光作為激發(fā)光，照射加入一定量銀納米顆粒作為熒光增強(qiáng)劑的人全血溶液，研究了銀納米顆粒對(duì)人全血溶液在可見(jiàn)光波段的熒光增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，膠體狀態(tài)的銀納米顆粒可以顯著增強(qiáng)低濃度的人全血溶液熒光光譜的強(qiáng)度，且不同位置熒光發(fā)射峰的熒光增強(qiáng)效率隨銀膠加入量的增加均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，但不同峰位置的最強(qiáng)增強(qiáng)效率對(duì)應(yīng)的銀膠加入量不同。理論分析方面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及膽固醇分子和銀納米顆粒在溶液中的分布情況，建立了分子間距模型，并根據(jù)模型計(jì)算得出膽固醇分子和銀納米粒子之間的最佳增強(qiáng)熒光效果間距在12.19～25 nm范圍內(nèi)，這個(gè)結(jié)果和其他文獻(xiàn)中的理論值吻合較好。綜上所述，使用銀納米顆?？蓪?shí)現(xiàn)全血溶液熒光的增強(qiáng)，研究結(jié)果為提高檢測(cè)血液中多種物質(zhì)的靈敏度和精度提供了有價(jià)值的參考作用。

光譜學(xué)；熒光增強(qiáng)；銀納米微粒；膽固醇；全血溶液

引 言

膽固醇是人體血液中脂類(lèi)物質(zhì)的主要成分之一，是參與合成細(xì)胞膜和維生素D、膽汁酸及多種激素的重要物質(zhì)，對(duì)維持人體正常的生理功能具有重要意義。健康的機(jī)體需要膽固醇含量適中，精確測(cè)量或者動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液中膽固醇的含量非常重要?，F(xiàn)在臨床常用的監(jiān)測(cè)血液中膽固醇含量的方法有很多，如酶反應(yīng)法、氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜質(zhì)譜法[1]。但傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)均不能兼具操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、對(duì)樣品無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，因此亟需尋找一種集這幾種優(yōu)點(diǎn)于一體的檢測(cè)方法。

熒光光譜分析技術(shù)具有高靈敏度、高精度、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用到血液成分檢測(cè)分析的研究中。但傳統(tǒng)的熒光光譜檢測(cè)方法在檢測(cè)一些物質(zhì)時(shí)仍然存在一定的局限性，通過(guò)查閱文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)由于在較高濃度的血液熒光光譜實(shí)驗(yàn)中，血紅蛋白等物質(zhì)在600 nm左右具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰[2-4]；在較低濃度的血液熒光光譜實(shí)驗(yàn)中，水在473 nm有很強(qiáng)的發(fā)射峰。這兩個(gè)峰都是很強(qiáng)的發(fā)射峰，有可能掩蓋了血液中其他生物分子的熒光，如蘭秀風(fēng)等采用波長(zhǎng)為410 nm的激光作為激發(fā)光，對(duì)含有不同量膽固醇的血清進(jìn)行光譜實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高膽固醇血清在560 nm處有很明顯的熒光發(fā)射峰，且發(fā)射峰的強(qiáng)度隨膽固醇濃度的變化呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化。而大量全血溶液的熒光光譜試驗(yàn)[2-4]中在560 nm處的峰并不明顯，這會(huì)直接影響利用熒光光譜技術(shù)檢測(cè)血液中膽固醇含量的監(jiān)測(cè)結(jié)果。

大量研究表明[5-6]，納米量級(jí)的金屬顆粒在特殊的表面等離子體共振作用下可以增強(qiáng)粒子表面的局域電磁場(chǎng)，影響吸附于顆粒表面及周?chē)鸁晒鈭F(tuán)的自由空間條件，進(jìn)而可以增強(qiáng)一些物質(zhì)的熒光光譜、表面等離子體共振譜或表面增強(qiáng)拉曼散射譜，增強(qiáng)的光譜效應(yīng)可顯著提高光譜檢測(cè)的靈敏度。應(yīng)用金屬納米粒子實(shí)現(xiàn)的熒光光譜增強(qiáng)技術(shù)發(fā)展迅速，并在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，Lakowicz等[7]利用納米尺寸的銀島接近DNA分子，實(shí)現(xiàn)了DNA熒光峰的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此我們?cè)跓晒夤庾V技術(shù)的基礎(chǔ)上引入金屬納米微粒增強(qiáng)熒光的技術(shù)，希望可以消除或減弱600 nm左右和473 nm處的強(qiáng)發(fā)射峰對(duì)膽固醇熒光的影響。基于銀納米顆粒對(duì)全血溶液的熒光增強(qiáng)，研究了血液中膽固醇的熒光增強(qiáng)效果，計(jì)算了利用銀納米熒光增強(qiáng)膽固醇血液熒光的最佳距離范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

實(shí)驗(yàn)中采用化學(xué)還原法制備得到銀膠(AgNPs)，以檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)作為還原劑還原硝酸銀溶液(AgNO3)，檸檬酸鈉同時(shí)兼做穩(wěn)定劑。實(shí)驗(yàn)中使用的檸檬酸鈉和AgNO3溶液均為分析純。實(shí)驗(yàn)得到的銀膠中銀納米顆粒的均一性較好，形貌近似圓形，半徑(r)大小在20～30 nm范圍內(nèi)，平均半徑大小約為24.5 nm。

實(shí)驗(yàn)所用血樣來(lái)自醫(yī)院檢驗(yàn)科的健康成人體檢血樣，置于血常規(guī)管(K2EDTA)中低溫保存。人全血溶液配制中，采用同一人的同一次采集的血樣樣本，以醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)生理鹽水作為溶劑。在加入銀膠的熒光增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中，為了消除加入銀膠溶液對(duì)血樣濃度的影響，固定每份樣品的體積為2 mL，具體配制方法如表1。

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器為Edinburgh Instruments公司生產(chǎn)的FLS920型多功能型光譜儀，激發(fā)光光源為輸出波長(zhǎng)407 nm的PDL800-B型皮秒脈沖半導(dǎo)體激光器。掃描450～750 nm范圍內(nèi)的樣品發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 正常全血溶液的熒光光譜

采用波長(zhǎng)為407 nm的激發(fā)光激發(fā)正常全血溶液，獲得熒光光譜圖如圖1所示。為了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中共整理出6份不同濃度的全血溶液的熒光光譜：0.4%，0.8%，1.5%，4%，7%和10%的全血溶液，其中這6份血樣來(lái)自同一人的同一次采血。由圖1可知，當(dāng)全血溶液濃度較低時(shí)(濃度小于1%)，熒光光譜中會(huì)出現(xiàn)4個(gè)很明顯的峰，峰值分別位于473，515，560和596 nm左右。而當(dāng)全血溶液的濃度較高時(shí)，熒光光譜在515，560和600 nm左右有3個(gè)比較明顯的峰，且600 nm左右的峰最強(qiáng)，其他兩個(gè)很弱。另外，在600 nm左右的熒光發(fā)射峰隨著血液濃度的增大，發(fā)射峰強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱并發(fā)生明顯的紅移，在血液濃度由0.4%增至10%的過(guò)程中，其峰位置由596 nm移至629 nm。這處發(fā)射峰的寬度范圍也很大，從577～700 nm。有文獻(xiàn)表明鋅卟啉在590 nm處有一個(gè)發(fā)射峰，原卟啉在630和690 nm處有兩個(gè)發(fā)射峰[8]。因此600 nm附近較強(qiáng)的熒光峰應(yīng)該是由這一范圍內(nèi)多個(gè)熒光發(fā)射峰的疊加而成。隨著血液濃度的增加，不同位置的熒光發(fā)射峰的增減幅度不同，導(dǎo)致其峰強(qiáng)度相互疊加的結(jié)果發(fā)生了紅移。

Fig.1 Fluorescence spectra of human blood solution by different concentration

采用同樣的方法也測(cè)量了蒸餾水和生理鹽水的熒光光譜，如圖2所示。從圖2可以看出，473 nm處的發(fā)射峰應(yīng)該是來(lái)自于水，通過(guò)計(jì)算得出473 nm位置的波數(shù)為3 428 cm-1，調(diào)研發(fā)現(xiàn)水分子O—H鍵伸縮振動(dòng)的拉曼散射峰在3 430 cm-1[9]左右，說(shuō)明473 nm處的發(fā)射峰是水分子O—H鍵伸縮振動(dòng)的拉曼峰。

Fig.2 Fluorescence spectra of distilled water and physiological saline

綜上所述，低濃度的全血溶液具有較豐富的熒光發(fā)射峰，且膽固醇在560 nm處的熒光發(fā)射峰較明顯，因此實(shí)驗(yàn)中主要采用低濃度的全血溶液進(jìn)行熒光增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 人全血溶液的熒光增強(qiáng)光譜研究

2.2.1 人全血溶液的吸收光譜

實(shí)驗(yàn)中也測(cè)量了銀膠的吸收光譜如圖3所示。從圖3可以看出，銀膠在350～550 nm范圍內(nèi)有一吸收帶，峰位置在430 nm處，為銀膠的表面等離子體共振波長(zhǎng)，分析認(rèn)為制備銀納米顆粒大小不均勻，銀納米顆粒的吸收峰隨顆粒尺寸的增加發(fā)生了紅移形成這一較寬的吸收帶。

Fig.3 Absorption spectra of colloidal silver solution

測(cè)量0.4%全血溶液的吸收光譜如圖4所示。從圖4可以看出，全血溶液有5個(gè)吸收峰，份別位于277，344，417，542和577 nm處，其中417 nm處最強(qiáng)，約為3.14%；542和577 nm處很弱，僅有1.6%左右。調(diào)研發(fā)現(xiàn)高膽固醇血清在560 nm處有很明顯的熒光發(fā)射峰[10]，且發(fā)射峰的強(qiáng)度隨濃度的變化呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)560 nm處有一個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度隨膽固醇濃度的變化呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化，因此認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)中560 nm處的峰為全血溶液中膽固醇的熒光發(fā)射峰，而不是全血溶液在542和577 nm處的吸收造成的假峰。

Fig.4 Absorption spectra of 0.4% blood solution

2.2.2 人全血溶液的熒光增強(qiáng)光譜

為了詳細(xì)研究加入不同量的銀納米顆粒對(duì)全血溶液中膽固醇成分熒光增強(qiáng)效果，特對(duì)加入不同量銀膠的0.4%全血樣品進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，熒光增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中樣品具體制備方法參照表一。進(jìn)行熒光光譜測(cè)量時(shí)，同組實(shí)驗(yàn)中采用相同的掃描參數(shù)。

Table 1 Sample preparation table for fluorescence enhancement test of 0.4% whole blood solution

樣品編號(hào)銀膠/mL生理鹽水/mL全血原液/μL樣品總量/mL101.9928220.41.5928230.51.49282……………151.70.29282161.80.19282171.90.09282

獲得表1中1—17號(hào)樣品的熒光增強(qiáng)光譜圖如圖5(為了觀察清晰，這里只列出部分光譜)，其中光譜峰位于473，515，560，597 nm的四個(gè)峰位置幾乎沒(méi)有變化，但是相對(duì)圖5中0.4%全血溶液光譜的幾個(gè)峰的相對(duì)強(qiáng)度發(fā)生明顯地變化。

Fig.5 Contrast figure of enhanced 0.4% whole blood solution fluorescence

2.3 分析

為了清晰表達(dá)銀膠加入量與熒光增強(qiáng)效果的關(guān)系，圖6給出了560 nm處的熒光增強(qiáng)率隨將銀膠加入量變化關(guān)系曲線。其中熒光增強(qiáng)倍率是通過(guò)式(1)得到的，公式中IA為加入一定銀膠量的全血樣品在560 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度，IB為純0.4%全血溶液在560 nm處的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度。

(1)

Fig.6 Relationship between fluorescence enhancement effect of cholesterol and the amount of colloidal silver

從圖6可以看出，當(dāng)加入銀膠量在0.4～1.9 mL范圍內(nèi)，銀膠對(duì)膽固醇在560 nm處的熒光增強(qiáng)效果先增后減，當(dāng)銀膠加入量在0.9 mL左右時(shí)，熒光增強(qiáng)率達(dá)到最大，其增強(qiáng)倍率約為5.3。金屬納米粒子增強(qiáng)熒光的效果受到許多因素的影響[12]，分析發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中涉及到的兩個(gè)主要因素為：一是熒光團(tuán)的吸收峰和發(fā)射峰與金屬納米粒子的表面等離子體共振峰的峰位置關(guān)系；二是熒光團(tuán)與金屬納米粒子之間的距離。下面具體分析這兩因素個(gè)的影響。

金屬納米微粒增強(qiáng)熒光的途徑主要有兩種：(1)金屬納米微粒的表面等離子體共振增強(qiáng)局域電磁場(chǎng)，局域電磁場(chǎng)增加熒光團(tuán)的激發(fā)率。理論上，金屬納米微粒的表面等離子體共振波長(zhǎng)與熒光團(tuán)的吸收帶重合時(shí)，可以獲得較好的熒光增強(qiáng)效果[13]。(2)局域電磁場(chǎng)的存在引起熒光量子產(chǎn)率的增加，提高了熒光分子的輻射衰減率。這種機(jī)制的熒光增強(qiáng)需要金屬納米微粒的表面等離子體共振波長(zhǎng)與熒光分子的發(fā)射帶一致[14]。實(shí)驗(yàn)中，銀膠的吸收峰在430 nm左右，吸收帶為350～550 nm，而低濃度的人全血溶液的最強(qiáng)吸收峰420 nm也在這一范圍內(nèi)(參考圖3和圖4)，即全血溶液的吸收帶與銀納米顆粒的表面等離子體共振波長(zhǎng)有重合，這就為銀納米顆粒增強(qiáng)全血溶液的熒光發(fā)射峰提供了理論依據(jù)。

表面等離子體共振產(chǎn)生的局域電磁場(chǎng)的大小受金屬的種類(lèi)、金屬納米微粒的尺寸和形態(tài)、納米微粒與熒光團(tuán)之間的距離等因素的影響。而在本實(shí)驗(yàn)中，前幾種影響因素均是不變的，只有金屬納米微粒與熒光團(tuán)的距離會(huì)因銀膠加入量的不同而有所變化。金屬微粒與熒光團(tuán)之間的距離影響熒光團(tuán)的躍遷方式[14]，隨著銀膠加入的量的增加或者血樣濃度的增加，銀納米粒子與血液中各種熒光團(tuán)的之間的距離d會(huì)逐步減小。當(dāng)距離d大于30 nm時(shí)，金屬納米粒子對(duì)熒光團(tuán)的影響非常小。當(dāng)d在5～25 nm范圍內(nèi)，易產(chǎn)生有效的熒光增強(qiáng)，其中5 nm

假設(shè)在全血溶液中，膽固醇分子和銀納米顆粒都是均勻分布在溶液中的，建立這種粒子分布模型如圖7，根據(jù)模型計(jì)算最佳增強(qiáng)距離D的范圍。

Fig.7 Cholesterol molecular distribution model diagram

由圖7可以看出，若粒子之間的平均距離為a，則平均每個(gè)粒子占據(jù)的空間體積為A=a3。

已知正常人體血清中膽固醇的含量為3.2～5.7 mmol·L-1，在正常人全血溶液中紅細(xì)胞比積為37%～50%，則通過(guò)計(jì)算可以得到正常人全血溶液中膽固醇的含量為1.6～3.59 mmol·L-1，使M1=1.6 mmol·L-1和M2=3.59 mmol·L-1，則全血溶液中膽固醇分子的密度為

ρ=M×?

(2)

(3)

則膽固醇分子間的平均距離為

(4)

建立膽固醇分子與銀納米顆粒的分布關(guān)系模型如圖8，并計(jì)算膽固醇分子到銀納米顆粒表面的距離d。

Fig.8 Cholesterol molecules and silver nanoparticles distribution model diagram

從圖8可以看出，膽固醇到銀納米顆粒表面的距離可表示為

(5)

已由式(4)得出a=63.788 3～48.720 3 nm，已知r=20～30 nm，利用式(5)得到膽固醇到銀納米顆粒表面的距離d的上下限為：d1=35.24 nm和d2=12.19 nm。因?yàn)榻饘偌{米粒子對(duì)熒光團(tuán)的熒光增強(qiáng)作用在d>25 nm之后逐漸減小，在d>30 nm之后幾乎對(duì)熒光團(tuán)的熒光幾乎沒(méi)有影響，則銀納米顆粒對(duì)膽固醇的最佳增強(qiáng)距離應(yīng)該在12.19～25 nm范圍內(nèi)，熒光增強(qiáng)機(jī)制主要是膽固醇熒光團(tuán)的輻射衰減率被銀納米顆粒增加，也可能存在膽固醇熒光分子的激發(fā)效率得到了提高。

3 結(jié) 論

(1)銀納米顆粒對(duì)人全血溶液具有明顯的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。其中對(duì)人全血溶液中膽固醇熒光峰產(chǎn)生了明顯增強(qiáng)。

(2)全血溶液的吸收帶與銀納米顆粒的表面等離子體共振波長(zhǎng)有很好的重合，血液熒光增強(qiáng)存在銀納米顆粒產(chǎn)生的局域電磁場(chǎng)增加熒光團(tuán)的激發(fā)率的機(jī)制。

(3)適當(dāng)銀膠的加入對(duì)低濃度的血液熒光光譜中的膽固醇熒光發(fā)射峰起到了熒光增強(qiáng)的作用。隨著銀膠加入量的增加，對(duì)膽固醇熒光的增強(qiáng)效果呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)銀膠加入量在0.9 mL左右時(shí)達(dá)到最佳的熒光增強(qiáng)效果。

(4)經(jīng)過(guò)模擬分析和理論計(jì)算得出，銀納米顆粒對(duì)膽固醇的熒光增強(qiáng)距離在12.19～25 nm范圍內(nèi)，熒光增強(qiáng)機(jī)制主要是銀納米顆粒增加了膽固醇熒光團(tuán)的輻射衰減率。

研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步提高膽固醇熒光檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)大熒光技術(shù)的應(yīng)用范圍提供了更多的可能，為金屬熒光增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于提高血液熒光檢測(cè)的研究提供了參考。金屬增強(qiáng)熒光技術(shù)在理論上還有待進(jìn)一步完善和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以通過(guò)建立合理的理論模型、利用數(shù)值計(jì)算等多種手段深入研究金屬增強(qiáng)熒光的規(guī)律，進(jìn)一步擴(kuò)大金屬納米微粒增強(qiáng)熒光的應(yīng)用范圍。

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*Corresponding author

Research on the Fluorescence Enhancement Effect of Silver Nanoparticles on the Cholesterol

WANG Jing-jing，WU Ying，LIU Ying*，CAI Ting-dong，SUN Song

College of Physics & Electronic Engineering, Jiangsu Normal University, Xuzhou, 221116, China

Based on traditional fluorescence spectroscopy and metal nanoparticles-enhanced fluorescence technology, this research explores a method of improving the accuracy and resolution of cholesterol detected by fluorescence spectroscopy in human whole blood solution. In experiment, an adult blood with silver nanoparticles is radiated by a laser pulse with wavelength of 407 nm, the fluorescence enhancement effect of cholesterol in blood is studied. The results show that, colloidal silver nanoparticles can enhance the fluorescence intensity of cholesterol in human blood with low concentration significantly. With the increase of the amount of silver colloids, the enhanced efficiency of fluorescence peaks at different positions increases first, and then decreases. However, the strongest enhanced efficiency of fluorescence peaks is different corresponding to different amount of silver colloids. According to the experimental results and the distribution of cholesterol molecules and silver nanoparticles in solution, molecular spatial distribution model is established by theoretical analyses, and the optimal distance for efficient fluorescence enhancement between cholesterol molecules and silver nanoparticles is calculated, the range is 12.19～25 nm, and the result is in good agreement with the theoretical values in other literatures. In summary, the fluorescence intensity of cholesterol in human blood can be enhanced by colloidal silver nanoparticles, and the results also provide a valuable reference on improving the sensitivity and accuracy of cholesterol detection.

Spectroscopy; Fluorescence enhancement; Silver nanoparticles; Cholesterol; Whole blood

Sep. 29, 2014; accepted Dec. 16, 2014)

2014-09-29，

2014-12-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11104237)資助

王靜靜，女，1988年生，江蘇師范大學(xué)碩士研究生 e-mail：jing1368518@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：liuying70@126.com

O433

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0140-06