部分臨床藥物的拉曼光譜研究

董 赫，劉 傳，戴長建

天津理工大學理學院, 天津 300384

部分臨床藥物的拉曼光譜研究

董 赫，劉 傳，戴長建*

天津理工大學理學院, 天津 300384

針對目前臨床藥物拉曼光譜的缺乏和藥物檢測領(lǐng)域的現(xiàn)狀，利用拉曼光譜技術(shù)對抗生素、抗組織胺、血凝酶和止吐劑等幾類常用臨床藥物進行了拉曼光譜的測量和研究。通過觀測上述具有良好拉曼活性的藥物樣品拉曼光譜，不僅確定了樣品拉曼峰的位移、強度和線寬，還探索了其包絡(luò)的線形等光譜特性。通過分析和比較拉曼光譜圖，找出各藥物間的異同; 對于那些由于拉曼活性低或拉曼光譜的復(fù)雜樣品，雖然暫時無法識別，但也進行了嘗試性的測量或提出了測量建議。研究表明: 小分子藥物的光譜特征很明顯，拉曼峰分布較廣, 對其進行光譜識別簡單易行; 而大分子都表現(xiàn)出較弱的光譜特征峰, 常常伴隨復(fù)雜的包絡(luò)，不僅導(dǎo)致了對其光譜識別的困難, 也很難準確確定特征峰位置。對于不同藥物，提出了用拉曼光譜測量和分析其藥物成分的可行性，并通過分析其拉曼光譜的特性, 為醫(yī)學工作者識別和分析藥物成分提供了實驗證據(jù)。不僅為建立藥物的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)。還使業(yè)界看到了快速識別和檢測藥物的前景，從而促進拉曼光譜技術(shù)在藥物檢測上的運用。

拉曼光譜；抗生素；止吐劑；光譜分析

引 言

通過被測物質(zhì)對光的散射，拉曼光譜可探測到其分子振動的信息，以便識別其振動模式是基于化學鍵的伸縮還是彎曲。雖然拉曼散射的強度通常很弱，但它即可對樣品進行無接觸、無損傷的測量，又具有分析速度快[1]，對極性基團靈敏[2]，不受水分子干擾[3]等優(yōu)點而成為人們青睞的分析物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)的重要方法[4]。

盡管對藥物和食品的檢測有多種方法，如：色譜法[5]和紅外光譜法[6]等，但它們都有檢測成本高、不適合水溶液樣品等缺點。本工作曾采用拉曼光譜技術(shù)對碳系、油類材料進行過研究，可以較容易將其拓展到一些研究較少的材料，如：處方藥物等。為此，對抗生素、止吐劑、血凝酶等十幾種常用處方藥進行了拉曼光譜的測量和分析。通過分類和比較其共性和異性，不但能獲得其光譜信息，還為運用該技術(shù)檢測處方藥奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 原理

處于振動基態(tài)的分子在光子的作用下，先被激發(fā)到較高的振動激發(fā)態(tài)，再回到較低的振動激發(fā)態(tài)。因此，根據(jù)能量守恒原理，被分子散射的光子能量等于激發(fā)光的能量減去上下兩個振動能級的能量差。換言之，當散射光與激發(fā)光的頻率不相等時，該散射就稱為拉曼散射，其頻率改變的大小就稱之為拉曼位移[7]。拉曼位移只與物質(zhì)分子的振動和轉(zhuǎn)動能級有關(guān)，其大小主要由發(fā)色基團的不同吸收峰所體現(xiàn)，而與入射光性質(zhì)無關(guān)。實驗的原理是，利用藥物分子散射峰的拉曼位移大小、數(shù)目和強度的不同，可以獲取和分析其分子振動和轉(zhuǎn)動方面的信息，并進而對其進行識別。

1.2 裝置和方法

實驗裝置為半導(dǎo)體激光拉曼光譜儀，由自行設(shè)計、組裝的激光器系統(tǒng)、散射光產(chǎn)生系統(tǒng)、外光路系統(tǒng)、信號采集系統(tǒng)構(gòu)成。半導(dǎo)體激光器的輸出波長為532.8 nm，工作電流為1 A。光柵儀的掃描步長為0.1 nm，波段為300～800 nm。在進行波長修正、基線漂移校正和光路調(diào)節(jié)之后，還需設(shè)置測量參數(shù)，比如：響應(yīng)閾值為80，工作電壓為900 V，積分時間為100 ms。

當入射激光照射到樣品上發(fā)生散射，具有不同波長的散射光經(jīng)光學聚焦系統(tǒng)聚焦進入單色儀入射狹縫。經(jīng)光柵分光后，由光電倍增管(PMT)將光信號轉(zhuǎn)換并放大成電信號，通過模數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換后的數(shù)字信號由數(shù)據(jù)采集軟件輸入到計算機中，去除光度噪聲后生成被測樣品的光譜數(shù)據(jù)供存儲和處理。

針對瑞利散射的信號強度遠大于拉曼散射信號(前者約為后者的102～103倍)情況，實驗采用一個凹陷濾波器選擇性衰減瑞利峰的強度，以便大幅增強拉曼散射峰的相對強度。實驗中，需對凹陷濾波器的角度進行精細調(diào)節(jié)，反復(fù)優(yōu)化使其達到最佳效果。先旋轉(zhuǎn)其方位角，使基準線處于水平方向；然后調(diào)控其張角θ，使其在30°～ 50°之間反復(fù)優(yōu)化，直至尋找到一個能使瑞利散射峰最弱而拉曼散射最強的位置。若被測藥物有顯著的特征峰，則可通過其強度和頻移等來分析其特征和信息；若其缺乏特征時，則可進一步通過其包絡(luò)位置和線形等特征和信息來識別。

實驗所采用的被測樣本主要為用于腫瘤臨床診療的成品針劑。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和藥性分成3組：(1)抗生素類：主要起殺菌和消炎作用；(2)止吐劑：主要起止咳、排痰和鎮(zhèn)吐作用；(3)特殊功能藥物，其功效不盡相同。部分樣品見圖1。

Fig.1 Some samples used in the experiment

上述藥物都密封冷藏于冰箱中，測量時用蒸餾水將其稀釋至1 mg·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，確保實驗結(jié)果的準確可靠。

2 結(jié)果與討論

實驗對上述抗生素等三類藥物，共計15種樣品進行了拉曼光譜測量，并按照類別進行了舉例和比較。在提供了樣本的基本信息(如：名稱和藥理作用等)之后，給出了實驗測得的拉曼光譜圖，并討論了其光譜特征。

2.1 抗生素類藥物

地西泮：它屬于苯二氮卓類的抗焦慮藥，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇和中樞性肌肉松弛作用。首先對地西泮進行了拉曼光譜的測量, 其結(jié)果見圖2。

由圖2可見，532.8 nm的瑞利峰右側(cè)存在4個較為明顯的拉曼散射峰，其波長相對532.8 nm分別移動了12.5，25，44.5和98 nm，對應(yīng)的拉曼頻移分別為：430，841，1 446和2 914。另一方面，這4個拉曼散射峰的強度都很弱，它們與瑞利峰的強度比分別為0.002 6，0.002 7，0.002 1和0.001 2，這表明：地西泮的拉曼活性很低。為了，凸現(xiàn)拉曼散射峰，故在圖2中不展示瑞利峰的頂端。

Fig.2 Raman spectrum of diazepam

奧硝唑：其在體內(nèi)多以具有細胞毒作用的原藥和具有細胞毒作用的中間代謝活性產(chǎn)物作用于厭氧菌、阿米巴原蟲、賈第鞭毛蟲和毛滴蟲細胞的DNA，使其螺旋結(jié)構(gòu)斷裂或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制而至其死亡，達到抗菌抗原生質(zhì)的目的。研究中對奧硝唑采用了兩種測量方式，光譜見圖3(a)和(b)。

Fig.3 Raman spectra of Dexamethasone (a) with and (b) without notch filter

結(jié)果表明，當使用濾波器衰減瑞利峰時，難免會使拉曼峰也被衰減見圖3(a)，從而導(dǎo)致峰被部分掩蓋。也不用濾波器測量，結(jié)果見圖3(b)。顯然從圖3中可以看出，當采用凹陷濾波器時，盡管部分散射峰被掩蓋了，但仍能看清拉曼包絡(luò)的位置和寬度等光譜特征。

以瑞利散射峰的位置作為拉曼頻移零點，繪制出其余四種藥物的拉曼光譜見圖4。該測量過程未加凹陷濾波器。

從圖4可以看出，這四種藥物的譜線雖然相似，但它們在低頻區(qū)的差異相對顯著。由于這些差異主要由相同發(fā)色基團旁的不同助色基團導(dǎo)致，所以可以通過各拉曼峰頻移的大小來識別和區(qū)分。實驗利用上述方法測量了多種抗生素藥物的光譜數(shù)據(jù)，表1列出了部分實驗結(jié)果。

Fig.4 Raman spectra of the antibiotics

Table 1 Experimental data of the popular antibiotics

由表1可見，總能找到藥物之間的部分差異。如: 雖然奧硝唑和硫酸慶大霉素的3組特征峰的位置很接近，但其相對強度卻有顯著差異。換言之，即使在它們的拉曼頻移相近時，上述的光譜特性仍可作為識別不同藥物的依據(jù)。

2.2 止吐劑藥物

采用同樣的方法分析鹽酸異丙嗪、鹽酸托烷司瓊、鹽酸甲氧氯普胺、鹽酸昂丹司瓊和鹽酸氨溴索這五種藥物，它們都屬于止吐鎮(zhèn)吐劑和排痰藥物，在臨床具有重要運用，而且該類藥物結(jié)構(gòu)特點都具有許多苯環(huán)，并拓展了大量C—H，C—C和C—N鍵的基團。光譜特征數(shù)據(jù)見表2。

從表2數(shù)據(jù)中看出，止吐劑藥物特征拉曼峰分布非常廣，如鹽酸甲氧氯普胺的拉曼頻移，大到9 055 cm-1, 小到451 cm-1。查閱文獻可知，在低頻區(qū)峰對應(yīng)C—C骨架的搖擺、伸縮振動，在高能區(qū)則對應(yīng)C—H鍵的伸縮振動[7]。而1 400～1 300 cm-1波段為CH2變形振動，C—O—H彎曲和C—C伸縮振動區(qū)。CH鍵出現(xiàn)在1 350～650 cm-1的頻即指紋區(qū)，所有有機化合物在此波段都有吸收帶出現(xiàn)，而且分子結(jié)構(gòu)的細微變化都能在此表現(xiàn)得十分靈敏，但該區(qū)光譜較少有特征性[8]，所以在前三種藥物加裝濾波器后檢測，以線型來大致作為特征，發(fā)現(xiàn)他們都具有兩個包絡(luò)，一個延伸50 nm, 一個延伸100 nm，而且位置極為相近，必然他們具有非常相似的主鏈和助色基團所導(dǎo)致。

2.3 特殊功能藥物

對低分子肝素鈉、鹽酸多巴胺、鹽酸利多卡因、順鉑(凍干型)和尖吻蝮蛇血凝酶進行測量分析，該類藥物功能差異很大，其中血凝酶在臨床醫(yī)學具有非常重要的作用。首先，比較五種藥物的光譜特征，見表3。

Table 2 Spectral data of antiemetics

Table 3 Spectral data summary of special function drugs

可以看出，這些藥物的拉曼頻移多處于3 000～10 000 cm-1的范圍內(nèi)，其主要與藥物分子主鏈端復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，如O—S雙鍵、C—O鍵和磷酸基團等，其中2 800～3 000 cm-1為C—H伸縮振動，3 200～3 000 cm-1為N—H伸縮振動。

其次，尖吻蝮蛇血凝酶是從中國尖吻蝮蛇屬毒蛇液中分離得到的酶性止血劑，為天然蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。從數(shù)據(jù)對比中可以看到，順鉑和血凝酶這兩種大分子藥物在特征峰位置上十分相似，當儀器分辨率有限時，其具有的諸多發(fā)色基團以及側(cè)鏈的不同構(gòu)象，對振動峰位置產(chǎn)生復(fù)雜影響，使得區(qū)分比較困難。如：血凝酶作為一種蛋白質(zhì)，其含有的二硫鍵，有三種構(gòu)象，在510 cm-1的譜線屬于扭曲-扭曲-扭曲構(gòu)象，在525 cm-1的為扭曲-扭曲-反式構(gòu)象，540 cm-1附近的為反式-扭曲-反式構(gòu)象，各種多構(gòu)象鍵互相交雜影響，導(dǎo)致拉曼活性低的樣品光譜中出現(xiàn)無法尋找特征峰的包絡(luò)，最終無法準確識別藥物。

最后，再多考慮藥物之間的包絡(luò)線型，嘗試至少能辨別出二者為不同的藥物。各藥物線型數(shù)據(jù)展示于表4。

雖然部分藥物的拉曼峰數(shù)據(jù)差異小，但它們在包絡(luò)數(shù)量，延伸長度上還有微弱的不同。如對順鉑和血凝酶兩種藥，拉曼峰位置沒有差異，但包絡(luò)位置有5 nm左右的區(qū)別，相對強度也有3×10-4的差異，雖然不能準確判斷為何種藥物，但至少可以判斷出所測樣本為不同的兩種藥物。

Table 4 Spectral data of some drugs

針對拉曼活性低的樣本，常采用表面增強拉曼光譜技術(shù)(SERS)來提高樣本拉曼信號，研究表明，吸附在粗糙金屬如銀、金、銅等表面的樣品分子[1]，其散射截面要比普通樣品分子高數(shù)倍，因此，表面增強拉曼譜的信號比常規(guī)拉曼譜強數(shù)倍。該技術(shù)常使用銀膠或銀鏡作為SERS的基底[9]，確實可以辨別出更多的拉曼峰和譜線精細信息。但該基底對于樣品的使用會有一定限制，如：僅用超純水沖洗的銀鏡表面殘留物會對樣品增強拉曼譜產(chǎn)生微擾[10]。使分辨率不高的民用儀器雪上加霜，而且本研究測量的樣本會與有還原性的物質(zhì)反應(yīng)，所以沒有采用該方法。

在測量的過程中發(fā)現(xiàn)，有的物質(zhì)在低頻區(qū)斯托克斯線明顯，而有的在高頻區(qū)反斯托克斯線明顯. 利用拉曼峰在瑞利峰兩側(cè)多對稱分布的特性，以瑞利峰為中心向兩側(cè)波段靈活尋找對稱峰，最終確定拉曼位移，也是操作上可取的方法。

3 結(jié) 論

研究了15種臨床藥物的拉曼光譜特性，不但分析通過討論他們的拉曼頻移和活性，還發(fā)現(xiàn)，上述藥物的拉曼頻移普遍較大，但活性卻普遍較低。通過不同藥物的拉曼光譜的對比，發(fā)現(xiàn)：部分樣品在330～370和610～710 nm范圍內(nèi)都存在一個很寬的包絡(luò)，且具有類似的線形；不同藥品的特征峰的數(shù)目和相對強度都具有明顯的差異，還對已有的分析方法進行了有力的補充。本文提供了許多采用拉曼光譜技術(shù)檢測藥物的實驗證據(jù)，通過對臨床藥物的識別和檢測，展現(xiàn)了拉曼光譜的快速、準確、簡單和低成本等優(yōu)越性和普適性。上述研究結(jié)果不但能增強業(yè)界對采用拉曼光譜分析和檢測藥物的認識，還為建立臨床藥物的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)。

致謝：青島大學的李心如、廈門大學的薛森和山東中醫(yī)藥大學的李佳祎給予了建議和幫助并表示感謝。

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Study on Raman Spectra of Some Clinical Medicine

DONG He, LIU Chuan, DAI Chang-jian*

College of Science, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384, China

Aiming at the shortage of the Raman spectra of drugs and the current situation of drug testing, we have applied Raman spectroscopic technique to several kinds of medicine, such as antibiotics, antihistamine, hemocoagulase and antiemetics. The spectral properties for the samples with high Raman activity are investigated by observing their Raman spectra to yield the shift，intensity, and line width of the Raman peaks，as well as the line shape of Raman envelope. For those samples with weak Raman activity or complex structures that are hard to be identified，we have also made some tentative measurements or raise some suggestions for future measurement. Comparing the similarities or differences among many Raman spectra of drugs, it is evident that drugs with small molecule have apparent spectral characteristics, by which to recognize them is very feasible, while those with large molecule usually have weak peaks or complex envelope in their spectra, leading to a difficult recognition and uncertain peak positions. This work not only proposes to identify chemical ingredients of drugs by observing and analyzing their Raman spectra, but also provides experimental evidences for medical workers doing so. The present results lay the foundation for establish the database of Raman spectra for drugs, and point out the prospect for rapid identification and detection of drugs, promoting the application of Raman spectroscopy technology on drug detection to a certain extent.

Raman spectroscopy；Antibiotics；Antiemetics；Spectral analysis

Oct. 24, 2014; accepted Jan. 28, 2015)

2014-10-24，

2015-01-28

國家自然科學基金項目(11174218)資助

董 赫, 1992年生, 天津理工大學理學院物理系本科生 e-mail: 496995344@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: daicj@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0109-05

*Corresponding author