基于多光譜成像技術(shù)的宮頸脫落細(xì)胞DNA定量分析研究

吳 正，曾立波，吳瓊水

武漢大學(xué)電子信息學(xué)院，湖北 武漢 430079

基于多光譜成像技術(shù)的宮頸脫落細(xì)胞DNA定量分析研究

吳 正，曾立波*，吳瓊水*

武漢大學(xué)電子信息學(xué)院，湖北 武漢 430079

常用的宮頸癌篩查方法有TBS(the bethesda system)分類(lèi)法和細(xì)胞DNA定量分析法兩種，而同時(shí)利用多重染色方法在同一張細(xì)胞涂片上對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行巴氏染色和對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行Feulgen染色進(jìn)行宮頸癌篩查的研究仍然是空白。多重染色篩查方法的難點(diǎn)在于非DNA物質(zhì)的吸光度會(huì)干擾DNA物質(zhì)的吸光度。因此建立了一套多光譜成像系統(tǒng)，并基于吸光度的線性疊加特性，利用多元線性回歸方法建立了吸光度剝離模型，通過(guò)該模型成功地將DNA物質(zhì)的吸光度剝離出來(lái)進(jìn)行DNA定量分析，實(shí)現(xiàn)了兩種常用方法的完美結(jié)合。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證明了，利用模型剝離出的DNA物質(zhì)的吸光度與實(shí)測(cè)的DNA物質(zhì)的吸光度在檢驗(yàn)水平為1%的情況下在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異，而且實(shí)際應(yīng)用測(cè)試中的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也顯示在置信水平為99%的情況下使用該分析方法篩查得到的四倍體細(xì)胞的DNA指數(shù)的置信區(qū)間與癌細(xì)胞的DNA指數(shù)判別區(qū)間沒(méi)有交集，驗(yàn)證了這種基于多光譜成像技術(shù)的多重染色的DNA定量分析方法的準(zhǔn)確性和可行性，在宮頸癌乃至其他癌癥的早期診斷和篩查中有巨大的市場(chǎng)應(yīng)用潛力與廣闊的應(yīng)用前景。

DNA定量分析； 多光譜成像技術(shù)； 多光譜剝離模型； 多元線性回歸

引 言

宮頸癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，對(duì)宮頸癌及癌變的早期診斷是提高宮頸癌治愈率及生存率的關(guān)鍵。目前常用的防癌篩查方法是TBS分類(lèi)法和細(xì)胞DNA定量分析診斷方法[1-2]。許多研究表明，細(xì)胞DNA定量分析診斷方法在早期診斷方面具有更大優(yōu)勢(shì)[3-5]。

目前這兩種方法是分別在不同的涂片上進(jìn)行篩查，于是就會(huì)出現(xiàn)以下情況： 醫(yī)生如果對(duì)TBS分類(lèi)法篩查出的結(jié)果不確定，為了提高準(zhǔn)確性就需要使用DNA定量分析系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)； 而通過(guò)DNA定量分析系統(tǒng)找出的異常細(xì)胞，醫(yī)生又無(wú)法通過(guò)細(xì)胞形態(tài)來(lái)進(jìn)行TBS分類(lèi)，需要醫(yī)生在另外一張涂片上進(jìn)行TBS分類(lèi)。

兩種篩查方法各自獨(dú)立分析，并沒(méi)有在同一張細(xì)胞涂片上同時(shí)進(jìn)行分析，因此我們提出了一種在同一張細(xì)胞涂片上能夠同時(shí)使用以上兩種腫瘤篩查方法的解決方案。這種方法只需要一次取材，一次制片，對(duì)細(xì)胞核使用Feulgen染色，對(duì)細(xì)胞質(zhì)使用巴氏染色，這樣在既可以通過(guò)Feulgen染色后的DNA進(jìn)行定量分析來(lái)篩查癌變細(xì)胞，同時(shí)染色的細(xì)胞質(zhì)可以進(jìn)行細(xì)胞學(xué)形態(tài)分析。以DNA定量分析技術(shù)為主，細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析為輔，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，顯著提高診斷準(zhǔn)確率。該方法能完美實(shí)現(xiàn)DNA定量分析方法和傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)合，大大減輕醫(yī)生的工作量。

雖然這種分析方法能夠在同一張涂片上實(shí)現(xiàn)兩種分析方法的結(jié)合，但是這種多重染色方法也帶來(lái)了一個(gè)難題，即吸光度干擾的問(wèn)題。傳統(tǒng)的DNA定量分析系統(tǒng)只使用一個(gè)特定波段的單色光，而且染色物質(zhì)只有DNA一種。而復(fù)染方式中含有的染色物質(zhì)不止DNA一種，那些其他物質(zhì)在該特定的光譜波段的上也有吸收。因此，建立了多光譜成像系統(tǒng)，通過(guò)采集各吸光物質(zhì)的多光譜圖像，得到了各物質(zhì)的吸光度特征參數(shù)，以此建立了多光譜成像系統(tǒng)的吸光度剝離模型，成功地從總吸光度中剝離出了DNA物質(zhì)的吸光度，提高了DNA定量分析的準(zhǔn)確度。

1 原 理

1.1 細(xì)胞DNA含量定量分析原理

細(xì)胞DNA定量分析主要是通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量或者染色體倍數(shù)的測(cè)定來(lái)判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)和病理改變。Feulgen DNA染色是一種能專(zhuān)一顯示脫氧核糖核酸的染色方法，細(xì)胞核染色后的顏色深淺與DNA含量有關(guān)。根據(jù)Lambert-Beer定律，吸光度正比于物質(zhì)的含量，物質(zhì)的含量越多，吸收光越多，光的透射越低。令入射光束強(qiáng)度為I0，正常細(xì)胞的組織涂片的透射光束強(qiáng)度為In，正常細(xì)胞的DNA的量濃度為cn，正常細(xì)胞的DNA的吸光度為An，待測(cè)細(xì)胞涂片的透射光束強(qiáng)度為Id，待測(cè)細(xì)胞的DNA的量濃度為cd，待測(cè)細(xì)胞的DNA的吸光度為Ad，對(duì)于相同的測(cè)試系統(tǒng)有相同的入射光束強(qiáng)度I0和相同的光程b，而相同的檢測(cè)物質(zhì)有相同的摩爾吸光系數(shù)ε，那么根據(jù)Lambert-Beer定律有

(1)

將式(1)中等式進(jìn)行相除可得

(2)

式中，DI表示DNA指數(shù)，也是表征癌變程度的醫(yī)學(xué)參數(shù)，正常細(xì)胞的DI大約等于1，處于增殖分裂的細(xì)胞的DI大約等于2，異常的癌變細(xì)胞的DI遠(yuǎn)大于2。

1.2 多光譜成像系統(tǒng)構(gòu)成和剝離模型原理與建立

1.2.1 硬件系統(tǒng)構(gòu)成

圖1所示為基于液晶可調(diào)諧濾光片(liquid crystal tunable filter，LCTF)的多光譜成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。該系統(tǒng)主要由LCTF、顯微光學(xué)系統(tǒng)和成像CCD相機(jī)三部分構(gòu)成。

Fig.1 Schematic diagram of multispectral imaging system

其中LCTF是根據(jù)液晶的電控雙折射效應(yīng)和偏振光的干涉原理制成的新型光器件，作為濾光片，它具有帶寬窄、功耗低、調(diào)諧范圍寬、驅(qū)動(dòng)電壓低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)移動(dòng)部件等優(yōu)點(diǎn)，在多光譜成像領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛[6-7]。本實(shí)驗(yàn)的分光器件LCTF，選用美國(guó)CRI公司的VariSpecTM(VIS-07-35-STD)，工作光譜范圍為400～720 nm，半峰全寬為10 nm，工作孔徑為20 nm，透射率曲線如圖2(a)所示。CCD相機(jī)選用德國(guó)VDS公司的vosskuhier系列的COOL-1300Q型單色面陣?yán)鋮sCCD相機(jī)。該相機(jī)的分辨率為1 280×1 024，像素大小為2/3英寸，噪聲低，在400～700 nm范圍內(nèi)有比較高的光譜響應(yīng)度，如圖2(b)。顯微光學(xué)系統(tǒng)選用日本Olympus BX41顯微鏡，該顯微鏡使用先進(jìn)的UIS2光學(xué)系統(tǒng)，能夠在整個(gè)視場(chǎng)獲得平坦、均勻、高對(duì)比度的圖像，而且可以輕松連接數(shù)字成像裝置。

Fig.2 Component performance of the imaging system

1.2.2 成像系統(tǒng)的光路中的傳遞函數(shù)

R(λk)=A(λk)ω(λk)+n(λk)

(3)

式中，n(λk)表示中心波長(zhǎng)為λk時(shí)的噪聲。當(dāng)光源關(guān)閉時(shí)，可認(rèn)為暗背底響應(yīng)R(λk0)=n(λk)。當(dāng)光源打開(kāi)時(shí)，式(3)可近似為理想情況，即

R(λk)-R(λk0)=A(λk)ω(λk)

(4)

當(dāng)載玻片為空白玻片時(shí)，可認(rèn)為此時(shí)的I(λk)=A0(λk)，則根據(jù)式(4)有

(5)

式中，R0(λk)表示空白背景的CCD相機(jī)的響應(yīng)值，Rd(λk)表示載玻片上有被測(cè)物質(zhì)時(shí)的CCD相機(jī)的響應(yīng)值，則被測(cè)物質(zhì)的吸光度A可表示為

(6)

Fig.3 The transfer functions in the optical path of the multispectral imaging system

1.3 工作流程

該多光譜成像系統(tǒng)的工作流程是：

(1)獲取暗背底的多光譜圖像： 關(guān)閉光源，將LCTF的中心波長(zhǎng)以10 nm為間距從490 nm調(diào)諧到680 nm，在每個(gè)波段下，通過(guò)CCD采集一幅圖像，共計(jì)20幀圖像。暗背底圖像中包含的是CCD圖像傳感器的暗電流噪聲以及環(huán)境散射光在CCD圖像傳感器上的響應(yīng)等。式(4)中的R(λk0)表示暗背底在CCD上的響應(yīng)。

(2)獲取空白背景的多光譜圖像： 顯微鏡載物臺(tái)上放置沒(méi)有細(xì)胞組織涂片的載玻片，打開(kāi)光源并調(diào)整到合適的強(qiáng)度，以上述同樣的方式獲取一組多光譜圖像。式(5)中的R0(λk)表示空白背底在CCD上的響應(yīng)。

(3)獲取樣品的多光譜圖像： 載玻片更換為含有染色細(xì)胞的涂片，以同樣的方式調(diào)諧LCTF，獲取一組多光譜圖像。式(5)中的Rd(λk)表示樣品在CCD上的響應(yīng)。

獲取以上三組多光譜圖像數(shù)據(jù)后，就可以根據(jù)式(6)計(jì)算每個(gè)像素點(diǎn)的吸光度。

1.4 多光譜圖像的吸光度剝離原理及模型建立

根據(jù)吸光度的加和性可知，某一波長(zhǎng)的單色光，在通過(guò)吸收介質(zhì)時(shí)，如果吸收介質(zhì)中同時(shí)含有n種吸光物質(zhì)，只要這些吸光物質(zhì)的各組分沒(méi)有直接相互作用，則吸收介質(zhì)對(duì)光的總吸光度A等于介質(zhì)中各組分吸光度Ai之和

(7)

若有m個(gè)波段的單色光，中心波長(zhǎng)分別為λ1，λ2，…，λm，則式(7)可擴(kuò)充為

(8)

A=T×c

(9)

根據(jù)多元線性回歸方法求得式(9)中向量c的最小二乘解為

c=(TT×T)-1×TT×A

(10)

式中，(TT×T)-1為n階方陣TT×T的逆矩陣。

在多重染色方法中，主要有三種染色吸光物質(zhì)： 伊紅物質(zhì)、DNA和亮綠物質(zhì)，即n=3。采用相對(duì)測(cè)量策略的方式，選取分別使用三種染色方法單獨(dú)進(jìn)行染色正常細(xì)胞的組織涂片，令： 純Feulgen染色法染色的涂片中，各物質(zhì)的濃度向量c=[0 0 1]T，純亮綠染液染色的涂片中各物質(zhì)的濃度向量為[0 1 0]T，純伊紅染液染色的涂片中各物質(zhì)的濃度向量為[1 0 0]T。

(11)

使用同樣的方法確定特征矩陣的另外2組m個(gè)參數(shù)，不同的是載玻片中分別只含有亮綠物質(zhì)和伊紅物質(zhì)。多光譜圖像是由20個(gè)波段的圖像組成，從490～680 nm，以10 nm為間隔，即m=20，根據(jù)式(11)測(cè)量的以上三種染色物質(zhì)的吸光度曲線如圖4所示，圖中曲線A表示伊紅物質(zhì)，曲線B表示DNA，曲線C表示亮綠物質(zhì)，每種物質(zhì)的吸光度都進(jìn)行了歸一化處理。三種物質(zhì)都有明顯的吸光度峰值區(qū)域，且相互交叉不嚴(yán)重，有利于吸光度剝離模型的建立。

Fig.4 The absorbance curves of three kinds of materials

在獲取了特征矩陣T的總共3×20個(gè)參數(shù)后，就可以計(jì)算出得到了矩陣TT×T的逆矩陣(TT×T)〗-1。根據(jù)式(11)就可以根據(jù)通過(guò)多光譜成像系統(tǒng)獲得的吸光度向量A，計(jì)算出成像在CCD相機(jī)上各像素點(diǎn)的對(duì)應(yīng)區(qū)域的各待測(cè)物質(zhì)的濃度向量c。將計(jì)算出的濃度向量c代入到式(8)中的中心波長(zhǎng)為580 nm時(shí)的等式中，有

(12)

2 結(jié)果與討論

多光譜成像系統(tǒng)的成像波段數(shù)為20個(gè)，從490～680 nm，以10 nm為間隔。雖然多光譜成像系統(tǒng)中的LCTF的工作波段是400～720 nm，但是從實(shí)際獲取的圖像上，我們觀察到400～480 nm共計(jì)9個(gè)波段上的圖像噪聲大，成像質(zhì)量不佳，因此排除； 而且實(shí)際采用的20個(gè)波段的圖像數(shù)據(jù)也已經(jīng)足夠用于剝離模型的建立。

本方法的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法主要有以下三個(gè)：

(2)目測(cè)比較。將通過(guò)模型計(jì)算出的DNA物質(zhì)的吸光度矩陣還原成灰度圖像進(jìn)行目測(cè)，并與其他圖像進(jìn)行比較，觀察是否將細(xì)胞核部分完全剝離出來(lái)，是否將細(xì)胞質(zhì)中吸光物質(zhì)的吸光度消除。

(3)實(shí)際應(yīng)用測(cè)試。利用同一張細(xì)胞涂片分別使用本方法和單波段的DNA定量分析系統(tǒng)單獨(dú)進(jìn)行分析，比較測(cè)試結(jié)果。

H0：μD=0，H1：μD≠0

Table 1 Test results of image of cell tissue only stained with Feulgen reagent

實(shí)驗(yàn)2的目測(cè)比較結(jié)果，如圖5所示，其中圖5(a)是分別以中心波長(zhǎng)為530，580和680 nm時(shí)獲取的原始圖像為B，G和R合成的偽彩色圖像，圖5(b)是以計(jì)算出的DNA的濃度乘以其在580 nm時(shí)的特征參數(shù)得到吸光度后，根據(jù)此時(shí)的背景的灰度值還原后的圖像。從圖像中我們可以明顯的觀察到剝離后的圖像中很“干凈”，即非細(xì)胞核部分的吸光度基本上都被剝離了，因此這些區(qū)域的灰度值非常接近背景的灰度值。剝離后的只含DNA的圖像非常適合于進(jìn)行DNA定量分析。而且合成的偽彩色圖像中，細(xì)胞質(zhì)的輪廓都很清晰，也便于醫(yī)生進(jìn)行TBS分類(lèi)分析。

實(shí)驗(yàn)3的實(shí)際應(yīng)用測(cè)試結(jié)果，圖6所示，其中圖6(a)為使用單波段的DNA定量分析系統(tǒng)計(jì)算出的DNA指數(shù)散點(diǎn)圖和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，圖6(b)是利用多光譜成像技術(shù)和吸光度剝離模型計(jì)算出的吸光度計(jì)算出的DNA指數(shù)散點(diǎn)圖和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。從散點(diǎn)圖上看，使用本方法的散點(diǎn)圖要比單波段分析的要寬一些； 從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上來(lái)看，使用單波段DNA定量分析系統(tǒng)檢出的二倍體細(xì)胞數(shù)量百分比為99.917%，DI的平均值為1.011，標(biāo)準(zhǔn)差為0.069，標(biāo)準(zhǔn)差率為6.8%，而四倍體的數(shù)量百分比為0.028%，DI的平均值為2.068，標(biāo)準(zhǔn)差為0.118，標(biāo)準(zhǔn)差率為5.7%； 使用本方法檢出的二倍體數(shù)量百分比為98.550%，DI的平均值為1.026，標(biāo)準(zhǔn)差為0.075，標(biāo)準(zhǔn)差率為7.3%，而四倍體的數(shù)量百分比為0.037%，DI的平均值為2.001，標(biāo)準(zhǔn)差為0.132，標(biāo)準(zhǔn)差率為6.6%。

Fig.5 The pseudo-color image (a) and the image obtained by the absorbance unmixing model process (b)

Fig.6 Comprison of the result of two different methods

查表得到t0.005(3)=5.840 9，則置信水平為(1-α)=0.99的置信區(qū)域?yàn)閇1.616 2.386], 因此在置信水平為0.99的情況下，DI均值最大可能也只是2.386小于2.5的判斷標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)出現(xiàn)誤判的情況。

通過(guò)比較以上數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論： 雖然使用本方法的分析結(jié)果的離散程度比使用單通道DNA定量分析的要稍微大一點(diǎn)，這是由于后者只使用了一個(gè)光譜波段的原因，誤差源更少，精度更高，但是本方法在篩選癌細(xì)胞方面仍然是符合要求的。

3 結(jié) 論

通過(guò)在同一張涂片上使用多重染色方法，即對(duì)細(xì)胞核使用Feulgen染色和對(duì)細(xì)胞質(zhì)使用巴氏染色，通過(guò)建立多光譜成像系統(tǒng)和多光譜吸光度剝離模型，成功將DNA物質(zhì)的吸光度剝離出來(lái)進(jìn)行DNA定量分析，實(shí)現(xiàn)了在同一張涂片上DNA定量分析和TBS分類(lèi)分析的完美結(jié)合。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和測(cè)試結(jié)果證明了這種方法的準(zhǔn)確性和可行性，這種分析方法不僅可以通過(guò)細(xì)胞的形態(tài)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，還可以進(jìn)行DNA定量分析，兩種分析方式同時(shí)結(jié)合在一張涂片上，極大的提高了宮頸癌癌變的診斷率。而且該分析方法不僅是在宮頸癌的早期診斷中有重大意義，在其他類(lèi)型癌癥的的診斷中也有廣闊的應(yīng)用前景。

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*Corresponding authors

Study of Cervical Exfoliated Cell’s DNA Quantitative Analysis Based on Multi-Spectral Imaging Technology

WU Zheng，ZENG Li-bo*，WU Qiong-shui*

School of Electronic Information，Wuhan University，Wuhan 430079，China

The conventional cervical cancer screening methods mainly include TBS (the bethesda system) classification method and cellular DNA quantitative analysis, however, by using multiple staining method in one cell slide, which is staining the cytoplasm with Papanicolaou reagent and the nucleus with Feulgen reagent, the study of achieving both two methods in the cervical cancer screening at the same time is still blank. Because the difficulty of this multiple staining method is that the absorbance of the non-DNA material may interfere with the absorbance of DNA, so that this paper has set up a multi-spectral imaging system, and established an absorbance unmixing model by using multiple linear regression method based on absorbance’s linear superposition character, and successfully stripped out the absorbance of DNA to run the DNA quantitative analysis, and achieved the perfect combination of those two kinds of conventional screening method. Through a series of experiment we have proved that between the absorbance of DNA which is calculated by the absorbance unmixxing model and the absorbance of DNA which is measured there is no significant difference in statistics when the test level is 1%, also the result of actual application has shown that there is no intersection between the confidence interval of the DNA index of the tetraploid cells which are screened by using this paper’s analysis method when the confidence level is 99% and the DNA index’s judging interval of cancer cells, so that the accuracy and feasibility of the quantitative DNA analysis with multiple staining method expounded by this paper have been verified, therefore this analytical method has a broad application prospect and considerable market potential in early diagnosis of cervical cancer and other cancers.

DNA quantitative analysis; Multi-spectral imaging; Multi-spectral unmixing model; Multiple linear regression

Feb. 2, 2015; accepted Jun. 15, 2015)

2015-02-02，

2015-06-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2011BAF02B02)資助

吳 正，1987年生，武漢大學(xué)電子信息學(xué)院博士研究生 e-mail: wuzheng@whu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: lbzeng@whu.edu.cn； qswu@whu.edu.cn

TP391

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0496-06