綠原酸協(xié)同抗氧化機理的電化學和光譜-色譜學研究

楊剴舟， 翟曉娜， 王佳良， 柴 智， 任發(fā)政， 冷小京，2*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 食品質(zhì)量與安全北京實驗室， 北京 100083

2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團隊， 北京 100083

3. 北京茱古拉咖啡有限公司， 北京 100085

綠原酸協(xié)同抗氧化機理的電化學和光譜-色譜學研究

楊剴舟1，3， 翟曉娜1， 王佳良1， 柴 智1， 任發(fā)政1， 冷小京1，2*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 食品質(zhì)量與安全北京實驗室， 北京 100083

2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團隊， 北京 100083

3. 北京茱古拉咖啡有限公司， 北京 100085

利用循環(huán)伏安法、 油水分配系數(shù)和紅外光譜(FTIR)、 XRD射線粉末衍射以及圓二色譜(CD)對于綠原酸協(xié)同抗氧化的機理進行了研究， 并通過ABTS自由基清除能力對于綠原酸單體和復配混合物的抗氧化活性進行了測定。 結(jié)果表明， 復配綠原酸分子之間抗氧化活性差距越大， 抗氧化活性高的綠原酸含量越高， 協(xié)同效果越好； 協(xié)同過程中并未發(fā)現(xiàn)綠原酸復配混合物氧化電勢的改變， 說明協(xié)同作用時分子間的氧化偶聯(lián)作用并不存在； 轉(zhuǎn)移電量與抗氧化指標之間具有很高的相關(guān)性(0.92)， 協(xié)同作用發(fā)生時體系的實際轉(zhuǎn)移電量高于理論轉(zhuǎn)移電量， 證明了高抗氧化活性綠原酸分子即雙咖啡?？鼘幩岬闹厣?； 油水分配系數(shù)絕對值差為0.13時的綠原酸復配組合具有良好的界面效應和高的協(xié)同效果； 紅外光譜、 XRD射線粉末衍射以及圓二色譜并未發(fā)現(xiàn)綠原酸復配混合物中反映綠原酸分子相互作用和規(guī)則性排列的信息。 因此綠原酸分子之間重生機制和體系的界面效應是綠原酸發(fā)生協(xié)同抗氧化現(xiàn)象的主要原因。

綠原酸； 協(xié)同抗氧化； 循環(huán)伏安法； FTIR； XRD； CD

引 言

綠原酸作為咖啡中最重要的一類多酚類化合物， 以其良好的抗氧化活性、 抗菌消炎、 調(diào)節(jié)機體糖脂代謝和保護心腦血管等功效越來越被人們所熟知[1-3]。 綠原酸是由一系列桂酸如咖啡酸、 阿魏酸及香豆酸等與奎寧酸酯化而形成的多酚類化合物， 其主要成分包括5-咖啡酰奎寧酸(5-CQA)、 4-咖啡?？鼘幩?4-CQA)及3-咖啡?？鼘幩?3-CQA)以及3,4-二咖啡?？崴?3,4-diCQA)、 3,5-二咖啡?？崴?3,5-diCQA)和4,5-二咖啡酰奎尼酸(4,5-diCQA)等(分子結(jié)構(gòu)如圖1所示)[4]。 大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)， 綠原酸尤其是3-CQA具有較廣泛的體外協(xié)同抗氧能力， 如與α-生育酚、 沒食子酸、 兒茶酸、 原兒茶酸、 表兒茶酸、 槲皮素和蘆丁等抗氧化劑復配研究時， 可將體系對DPPH·(1，1’-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS·(2，2’-連氮-二(3，-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)等自由基的清除能力提高3%～45%左右[5-8]。 對于協(xié)同抗氧化現(xiàn)象發(fā)生的機理， 有研究報道稱可能是來自于抗氧化劑之間的重生[9-10]和氧化偶聯(lián)機制[11]， 體系的界面效應[12-13]和抗氧化劑分子間相互作用[14]， 即抗氧化劑分子間通過傳遞e-和H+得到重生以及抗氧化劑復配混合物氧化電勢的降低使得反應更易發(fā)生， 體系中抗氧化劑相分配系數(shù)的差異使得抗氧化劑在界面兩側(cè)自發(fā)排列分布， 抗氧化劑分子之間相互作用使得重生過程有序進行， 而目前對于上述協(xié)同機理的驗證和解釋還缺乏深入系統(tǒng)的研究。

抗氧化反應作為氧化還原反應的一種， 反應過程中涉及到e-和H+的傳遞， 而電化學尤其是循環(huán)伏安法可以對氧化反應過程中的氧化電勢和轉(zhuǎn)移電量進行系統(tǒng)完整的分析， 并且有研究發(fā)現(xiàn)與抗氧化指標之間具有很高的相關(guān)性[15]， 因此可以對抗氧化劑的協(xié)同重生理論進行合理準確的解釋。 XRD粉末衍射、 紅外光譜和圓二色譜作為分析分子結(jié)構(gòu)和分子間相互作用常用的光譜色譜手段， 可以對綠原酸分子之間在復配前后可能存在的一系列相互作用進行分析鑒定。 因此本實驗采用ABTS自由基清除能力對六種同源綠原酸衍生物進行抗氧化實驗和協(xié)同實驗研究， 然后分別采用循環(huán)伏安法、 油水分配常數(shù)和紅外光譜、 XRD射線粉末衍射以及圓二色譜對綠原酸協(xié)同抗氧化的機理進行驗證和解釋。

圖1 咖啡中主要的綠原酸異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

六種綠原酸單體(3-咖啡?？鼘幩?3-CQA)， 4-咖啡?？鼘幩?4-CQA)， 5-咖啡?？鼘幩?5-CQA)， 3,4-二咖啡酰奎寧酸(3， 4-CQA)， 3,5-二咖啡酰奎寧酸(3， 5-CQA)， 4,5-二咖啡?？鼘幩?(4,5-CQA)， 購買于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司， 純度≥98%。 β-類胡蘿卜素(≥97%)購買于合肥博美生物科技有限公司。 α-亞油酸(≥97%)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(≥98%)購買于美國sigma公司。 其他試劑為色譜純或分析純。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計(Cary 50 spectrophotometer， 美國Varian 公司)； 紅外光譜儀(GX， 美國Perkin-Elmer公司)； Advance X射線衍射儀(D8, 德國Bruke公司)； 圓二色譜儀(Pistar n-180， 英國Applied Photophysics 公司)； 電化學工作站(CHI 620C， 上海辰華儀器有限公司)； 液相色譜(LC-20AT， 日本島津)； 冷凍干燥機(LGJ-10B， 北京四環(huán)科學儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 綠原酸溶液的配制

將上述六種綠原酸溶液溶解于0.2 mol·L-1的Britton-Robinson的緩沖液中， 其中緩沖液的pH 為7.4， 離子強度采用電導率儀固定到0.1。

1.3.1 ABTS自由基清除能力測定[16]

分別配置7 mmol·L-1ABTS溶液和 2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液， 將兩者混合后置于避光處16～24 h制備ABTS自由基溶液， 采用超純水對ABTS自由基溶液稀釋至在波長734 nm下的吸光度在0.70±0.20備用； 分別取10 μL的綠原酸緩沖液和990 μL的ABTS自由基溶液于避光離心管中反應4 min, 并于波長734 nm下測定吸光度， 超純水作為空白對照。 ABTS自由基清除率(%)=(A0-A)/A0×100%， 其中A0是空白對照反應后的吸光度，A是綠原酸緩沖液反應后的吸光度。 實驗結(jié)果取三次平行實驗的平均值。

1.3.2 協(xié)同實驗設計[17]

協(xié)同實驗設計基于等輻射分析理論， 并作出一定的改進。 首先采用ABTS自由基清除能力和β-胡蘿卜素漂白抑制能力對不同濃度綠原酸溶液的抗氧化活性測定并通過曲線擬合得到IC50， 然后對任意兩種綠原酸溶液在9個比例(0.1～0.9)下進行兩兩復配并測定抗氧化活性， 通過對復配后綠原酸溶液的理論抗氧化值和實際抗氧化值進行比較得出協(xié)同程度， 具體計算公式如下。 協(xié)同度=AB/(A+B) ， 其中AB是任意兩種綠原酸的混合物。 如果協(xié)同度大于1則表明兩種綠原酸之間發(fā)生了協(xié)同作用， 如果等于1則表明發(fā)生的加和作用， 如果小于1則表明發(fā)生了拮抗作用。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析[18]

將綠原酸緩沖液通過冷凍干燥方法除去水分得到干燥的粉末放置于干燥器中待用， 取少量綠原酸干燥樣品和光譜純KBr研磨均勻后制成透明薄片測定。 紅外光譜采用Spectromeer GX FTIR紅外光譜儀測得， 掃描信號累加16次， 光譜分辨率4 cm-1， 測量范圍4 000～400 cm-1。

1.3.4 X射線粉末衍射分析[19]

室溫下采用Bruck D8 Advance型多晶X射線衍射儀對綠原酸粉末進行晶態(tài)分析， X射線源為陶瓷X光管Cu 靶， X射線波長為1.540 6 ?， 電壓為40 kV, 電流為40 Ma， 掃描角度(2θ)為5～80°， 掃描速度0.1 s/步， 步長0.01°。 粉末衍射后的衍射數(shù)據(jù)與衍射數(shù)據(jù)國際中心(international centre for diffraction data， ICDD)中的衍射數(shù)據(jù)進行比對， 確定綠原酸粉末的晶體特征和結(jié)構(gòu)信息。

1.3.5 圓二色譜分析

圓二色譜(CD)是測定有機化合物絕對構(gòu)型的常用方法， 利用在特定波長范圍上的Cotton效應的正、 負與旋光譜的左、 右旋一樣， 對手性對映體的特征進行宏觀標識。 綠原酸的最佳吸收波長為325 nm， 因此在CD光譜紫外區(qū)(200～400 nm)對綠原酸樣品進行測試， 每點掃描時間為2.5 μs， 狹縫寬設置為1 nm， 重復描5次。

1.3.6 循環(huán)伏安法分析[15]

采用三相電極體系的電化學工作站對綠原酸的氧化還原行為進行分析， 其中玻碳電極作為工作電極， Ag/AgCl電極作為參比電極， 鉑絲電極作為輔助電極。 玻碳電極每次使用前分別采用1, 0.3和0.05 μm的納米氧化鋁進行拋光打磨， 采用離子濃度為0.1, pH 7.4和濃度為0.2 mol·L-1的Britton-Robinson緩沖液作為電解液， 每次檢測前的樣品采用超聲脫氣30 s。 循環(huán)伏安法掃描參比Ag/AgCl電極以400 AgCl mV·s-1的掃描速率從-0.2 V開始到不同的反轉(zhuǎn)電勢進行掃描， 反轉(zhuǎn)電勢的范圍為0.2～1.2 V， 其中氧化峰下的積分面積(Q)代表氧化過程中的電量轉(zhuǎn)移量， 氧化電勢(Epa)代表抗氧化劑的抗氧化能力。 每個樣品重復掃描3次取平均值。

1.3.7 綠原酸油水分配系數(shù)測定[20]

為了使萃取前后的水相和油相的性質(zhì)保持不變， 水相采用正辛醇進行飽和， 油相采用水飽和了的正辛醇。 將100 mL 超純水和100 mL正辛醇在分液漏斗中充分混合后靜置24 h， 然后分從上面吸取油相和從下面流出水相待用。 稱取3 mg的綠原酸樣品溶解于10 mL正辛醇飽和的水溶液中， 取其中4 mL進行液相色譜檢測。 另取4 mL轉(zhuǎn)移到試管中， 加入4 mL水飽和了的正辛醇， 在恒溫搖床中振蕩2 h， 然后靜置30 min， 吸盡上層正辛醇， 離心取下層水溶液進行液相色譜檢測。 液相色譜檢測條件如下[21]： 流動相A為含有1%色譜純甲酸的超純水， 流動相B為色譜純乙腈； 梯度洗脫參數(shù)為A/B=95∶5(0 min)到75∶25 (60 min)； 流速為1.0 mL·min-1； 進樣量為10 μL， 檢測波長為325 nm。 綠原酸的油水分配系數(shù)計算公式如下： logP=log(A正辛醇/A水)， 其中A正辛醇和A水分別為綠原酸在油相和水相中的含量， 采用液相色譜峰面積積分值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化實驗

采用ABTS自由基清除能力對綠原酸的抗氧化活性進行評價， 并進行曲線擬合求出自由基清除效果達到50%的綠原酸濃度(IC50)， 實驗結(jié)果如表1所示。

表1 六種綠原酸異構(gòu)體ABTS自由基清除能力

Regression equation:y=0.360 8x+2.223 3，R2=0.99 (3-CQA);y=0.347 5x+2.122 1，R2=0.99 (4-CQA);y=0.369 3x+2.203 1，R2=0.98 (5-CQA);y=0.787 8x-2.390 7，R2=0.99(3.4-DICQA);y=0.772 3x-2.725 7，R2=0.99 (3.5-DICQA);y=0.879x+1.668 2，R2=0.99 (4.5-DICQA)

從表1可以看出， 六種綠原酸對于ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增加， 單咖啡酸奎寧酸(3-CQA， 4-CQA， 5-CQA)的抗氧化活性顯著低于雙咖啡?？鼘幩?3,4-DICQA， 3,5-DICQA， 4,5-DICQA)， 這主要是由于雙咖啡?？鼘幩岜葐慰Х弱？鼘幩峋哂懈嗟姆恿u基來清除自由基； 單咖啡酸奎寧酸IC50大約是雙咖啡?？鼘幩岬囊话?， 這正好與兩者的酚羥基個數(shù)比值相一致， 因此可推斷綠原酸的抗氧化活性與綠原酸的酚羥基個數(shù)成正比， 這個結(jié)論與Xu等[22]的在甲醇作為溶劑體系下對兩大類綠原酸的抗氧化活性研究結(jié)果相一致。

2.2 協(xié)同實驗

采用ABTS自由基清除能力抗氧化實驗中得到的六種綠原酸的IC50值進行復配協(xié)同實驗研究， 實驗結(jié)果如圖2所示。 研究發(fā)現(xiàn)， 三種單咖啡?？鼘幩嶂g兩兩復配在復配比例從0.1～0.9區(qū)間內(nèi)都出現(xiàn)了弱的拮抗效應(0.93～0.99)， 而與三種雙咖啡?？鼘幩釓团鋾r， 出現(xiàn)了從拮抗效應到加和效應再到協(xié)同效應的現(xiàn)象， 其中3-CQA對三種雙咖啡?？鼘幩嵩趶团浔壤笥?.5時相比較于4-CQA和5-CQA具有更高的協(xié)同效應(1.15)， 而5-CQA的協(xié)同效應最差(1.02)； 三種雙咖啡?？鼘幩嶂g進行復配時， 只有3，4-DICQA+3，5-DICQA在復配比例大于0.3時出現(xiàn)了明顯的協(xié)同效應， 而3,4-DICQA+4,5-DICQA和3,5-DICQA+4,5-DICQA在復配比例0.1～0.9范圍內(nèi)均出現(xiàn)加和效應。 Heo等[5]采用清除ABTS自由基能力對3-CQA和三種黃酮類化合物進行復配后抗氧化活性進行評價， 研究發(fā)現(xiàn)3-CQA在濃度為28.25×10-5mol·L-1時對三種黃酮具有很高的協(xié)同抗氧化活性(1.09～1.19)， 而在本研究中出現(xiàn)最高協(xié)同度時的3-CQA 濃度為13.0×10-5mol·L-1， 可能是由于作者采用的甲醇溶劑體系與本研究中的水體系的差異所引起的。 賈貴東等[7]在采用清除DPPH自由基能力對3-CQA和蘆丁的復配體系進行評價時， 也發(fā)現(xiàn)在3-CQA 處于低濃度時對于蘆丁出現(xiàn)了良好的協(xié)同抗氧化活性。 由于上述雙咖啡?？鼘幩岷忘S酮類物質(zhì)的抗氧化活性均高于3-CQA， 因此綠原酸發(fā)生協(xié)同作用時不僅與抗氧化劑之間的復配比例有關(guān)， 還與兩種抗氧化劑的抗氧化活性差異度有關(guān)。 由于3-CQA+3,5-DICQA和5-CQA+3,5-DICQA是綠原酸協(xié)同抗氧化實驗中整體協(xié)同度的兩個極端， 因此選擇這兩組來進行下一步協(xié)同抗氧化機理的探討。

圖2 六種綠原酸異構(gòu)體二元復配體系ABTS自由基清除能力相互作用變化規(guī)律

Take 3-CQA for example, fraction 0.1 refers to the amount of 3-CQA (1/10) to another five CQAs isomers (9/10) in the binary compound combination. Data are expressed as the mean of 3 separate experiments ±SDs

2.3 協(xié)同實驗電化學研究

采用循環(huán)伏安法對3-CQA+3,5-DICQA和5-CQA+3,5-DICQA兩個綠原酸復配體系的電化學氧化特性進行研究， 通過氧化電勢和轉(zhuǎn)移電量對氧化偶聯(lián)理論和重生理論進行研究。 氧化偶聯(lián)理論是指兩種抗氧化劑復配后降低了彼此的氧化電位， 從而使抗氧化劑能更好越過氧化反應能壘， 有利于反應的發(fā)生[11]。 3-CQA+3,5-DICQA和5-CQA+3,5-DICQA不同復配比例下的循環(huán)伏安圖譜如圖3所示。 從圖3中可以看到， 不同復配比例下的綠原酸混合物均具有兩個氧化峰， 不同的氧化峰代表著綠原酸分子上不同位置羥基的氧化， 其中第一個氧化峰來自于咖啡酸基團上的酚羥基的氧化， 第二個氧化峰則來自于奎寧酸糖環(huán)上羥基的氧化[15，23]， 氧化電勢分別為0.45和0.75 V， 不同復配比例下的綠原酸混合物的氧化電勢并沒有顯著性差別， 因此可以推斷出氧化偶聯(lián)理論并不是解釋綠原酸協(xié)同抗氧化產(chǎn)生的機理。

圖3 最優(yōu)和最差的ABTS自由基清除能力二元復配協(xié)同體系的循環(huán)伏安圖，

不同復配比例下的傳遞電量和抗氧化活性以及協(xié)同抗氧化效果如圖4所示。 從圖4-A1可知， 隨著3-CQA和5-CQA含量的增加， 綠原酸混合體系的抗氧化活性逐漸增加， 轉(zhuǎn)移電量也逐漸增加， 兩者具有較好的線性相關(guān)性， 相關(guān)性系數(shù)分別高達0.91(3-CQA+3,5-DICQA)和0.88(5-CQA+3,5-DICQA)， 因此說明ABTS自由基清除能力抗氧化評價方法和轉(zhuǎn)移電量具有高度的統(tǒng)一性， 抗氧化的過程就是電子傳遞猝滅自由基的過程。 Di等[15]在用循環(huán)伏安法對14種黃酮類物質(zhì)的電化學行為和ABTS自由基清除能力抗氧化評價方法進行比對研究發(fā)現(xiàn)兩者具有高度的相關(guān)性， 相關(guān)性系數(shù)高達0.85， 與本研究結(jié)論相一致， 因此可以采用轉(zhuǎn)移電量的變化代替抗氧化活性來解釋協(xié)同現(xiàn)象發(fā)生的機理。 從圖4(A2)可知， 隨著3-CQA和5-CQA含量的逐漸增加， 綠原酸相互作用從拮抗作用到加和作用中再到協(xié)同作用， 3-CQA對于3,5-DICQA的協(xié)同效果明顯好于5-CQA， 此外轉(zhuǎn)移電量的協(xié)同度和抗氧化活性的協(xié)同度變化也具有高度一致性(0.92, 0.92)。 按照理論計算， 在不同復配比例下的綠原酸的酚羥基摩爾總數(shù)是固定不變的， 因此轉(zhuǎn)移電量和抗氧化活性也是固定的， 但是轉(zhuǎn)移的電量和抗氧化活性卻出現(xiàn)了一直增加的趨勢， 這表明在此過程中出現(xiàn)了自由基誘導下的綠原酸相互之間作用， 發(fā)生了綠原酸分子之間的重生現(xiàn)象。 Zhu等[10]采用低密度脂蛋白抗氧化評價方法對綠茶兒茶酚和α-生育酚的協(xié)同抗氧化抗氧化活性研究時發(fā)現(xiàn)， 當體系中單獨存在α-生育酚時， α-生育酚含量隨著誘導時間的增加逐漸下降， 而隨著綠茶兒茶酚在不同時間點的加入后， α-生育酚含量下降趨勢減緩并接著出現(xiàn)緩慢增加的趨勢， 這說明在抗氧化過程中出現(xiàn)了α-生育酚的重生。

圖4 綠原酸異構(gòu)體二元復配體系Q值(轉(zhuǎn)移電量)和抗氧化活性及其協(xié)同度在不同復配比例下的變化規(guī)律， Q值代表綠原酸異構(gòu)體的抗氧化活性， 通過扣除樣品相應電勢下空白緩沖液的氧化峰面積積分來表示

Fig.4 The profiles of Q values and antioxidant activity (A1) and their synergistic effect (A2) of the binary compound combination of CQAs isomers under different proportion at the reverse potentials ranging from 0.2 to 1.2 V. The Q values that represented the antioxidant activity of CQAs through the integral area under anodic wave subtracting the blank buffer at corresponding potentials

圖5 3-CQA/5-CQA和3，5-DICQA不同比例下(低、 中、 高)二元復配體系猝滅自由基的示意圖，

Fig.5 The schematic illustration of 3-CQA or 5-CQA+3,5-DICQA quenching the free radical under different proportion(low, middle and high from left to right). Inner water phase and outer water phase simulated the dispersions diversity of 3-CQA and 5-CQA with 3,5-DICQA in the water system

綠原酸在不同比例下的混合物猝滅自由基的過程如圖5所示。 由圖5可知， 當3-CQA(5-CQA)處于低濃度時， 由于3,5-DICQA在水中分散度相比較于前者較小， 因此3-CQA和自由基處于一相， 3,5-DICQA則聚集成為另一相， 此外體系中3,5-DICQA的含量相對較高， 存在一部分3,5-DICQA通過雙水相界面去重生3-CQA， 出現(xiàn)高抗氧化活性的抗氧化劑去重生低抗氧化活性的抗氧化劑， 發(fā)生拮抗效應； 當3-CQA處于中濃度時， 抗氧化劑的含量與體系中的自由基數(shù)量達到飽和， 雙水相界面效應不會影響自由基與3,5-DICQA的接觸程度， 因此出現(xiàn)加和效應； 當3-CQA處于高濃度時， 存在一部分的3-CQA去重生3,5-DICQA， 出現(xiàn)低抗氧化活性的抗氧化劑去重生高抗氧化活性的抗氧化劑， 發(fā)生協(xié)同效應。 Nogala等[24]采用AAPH誘導的脂質(zhì)過氧化對槲皮素、 蘆丁和生育三烯酚之間的復配抗氧化活性進行研究時發(fā)現(xiàn)， 抗氧化劑的活性， 抗氧化劑的濃度， 體系中的分散度直接決定了復配抗氧化劑的協(xié)同抗氧化效果； 低濃度時低抗氧化活性的槲皮素和蘆丁可以重生較高抗氧化活性的生育三烯酚發(fā)生協(xié)同效應； 高抗氧化活性的抗氧化劑越分散于自由基產(chǎn)生的一相， 低抗氧化活性的抗氧化劑越位于兩相界面時， 協(xié)同效果越好。

表2 六種綠原酸異構(gòu)體的油水分配系數(shù)

3-CQA對于3,5-DICQA的協(xié)同抗氧化效果和協(xié)同度都明顯優(yōu)于5-CQA， 但是兩者的抗氧化活性并不具有顯著性差異， 這說明綠原酸分子之間分散度的差異是影響協(xié)同抗氧化活性的另外一個原因。 對于六種綠原酸的油水分配系數(shù)P進行了測定， 結(jié)果如表2所示。 從表2中可以看出， 六種綠原酸衍生物的分散度(水體系)大小順序為3-CQA>4-CQA>5-CQA>3,5-DICQA>3,4-DICQA>4,5-DICQA， 3-CQA相比較與5-CQA， 與3,5-DICQA更容易形成雙水相分散體系， 界面效應產(chǎn)生的自發(fā)性分配使得猝滅自由基的過程更具有秩序性， 減少反應發(fā)生的隨機性因素， 使得具有更好的協(xié)同效應， 這從4-CQA和3,5-DICQA的協(xié)同作用也可以得到論證實。 此外， 綠原酸復配混合物之間的分散度差異并不是越大越好， 應該維持在一定的范圍內(nèi)。 六種綠原酸的油水分配系數(shù)絕對差值如表3所示， 結(jié)合圖2分散度對于協(xié)同抗氧化活性的影響進行分析， 研究發(fā)現(xiàn)， 3-CQA， 4-CQA和5-CQA對于三種雙咖啡?？鼘幩釁f(xié)同度整體最好的分別是3,5-DICQA， 3,4-DICQA和3,4-DICQA， 而整體協(xié)同度最好的復配組合的油水分配系數(shù)的絕對差值平均值為0.13±0.01， 而低于或者高于這一絕對值范圍的復配組合的整體協(xié)同度均較差， 可能具有這一分散度差值的綠原酸組合具有最合適的界面效應， 更有益于協(xié)同反應的發(fā)生。

表3 六種綠原酸異構(gòu)體的油水分配系數(shù)差值

2.3 協(xié)同實驗光譜學分析

對于協(xié)同抗氧化機理的研究， 有報道稱[14]除了氧化偶聯(lián)理論， 重生理論和界面效應外， 黃酮多酚類物質(zhì)分子之間也可能通過π—π堆積和氫鍵形成穩(wěn)定的復合物， 從而使得抗氧化劑之間的重生更易發(fā)生， 因此通過色譜和光譜手段對影響協(xié)同抗氧化機理的分子間相互作用進行探討。

2.3.1 紅外光譜

2.3.2 X射線粉末衍射

通過X射線粉末衍射可以對綠原酸單體和復配后凍干樣品的晶體情況進行表征， 進而確定綠原酸在復配前后分子之間排列是否具有規(guī)則性排列， 對分子排列學說進行驗證。 由圖7觀察可知， 綠原酸的XRD譜圖中除幾個尖銳峰外整體體現(xiàn)為無定型形態(tài)， 利用MDI JAD軟件對XRD譜圖進行分析， 可得尖銳峰表征氯化鈉分子的晶體， 而綠原酸分子在復配前后并未形成排列有序的晶體結(jié)構(gòu)， 綠原酸分子均為雜亂無章的無定形態(tài)， 因此并不支持分子排列理論對于協(xié)同抗氧化機理的解釋。 吳玲玲等[19]對綠原酸標樣進行X射線粉末衍射發(fā)現(xiàn)在2θ為15°～30°范圍內(nèi)出現(xiàn)大量的尖銳峰， 通過計算比對分析得到綠原酸屬于斜方晶系， 具有排列有序的晶體結(jié)構(gòu)， 而本實驗中的綠原酸樣品為溶解于緩沖液后再進行冷凍干燥制得， 因此可能制備過程并不有利與晶體結(jié)構(gòu)的生長， 因此并未出現(xiàn)文獻報道的晶體結(jié)構(gòu)。

圖6 綠原酸異構(gòu)體及其二元復配體系的紅外光譜譜圖

圖7 綠原酸異構(gòu)體及其二元復配體系XRD譜圖

2.3.4 圓二色譜

圓二色譜作為研究有機化合物構(gòu)型和構(gòu)象的常用方法， 主要是基于有機化合物在平面偏振光下特有的旋光特性即圓二色性， 分子之間如果發(fā)生相互作用必然會引起圓二色性的改變， 因此圓二色譜也可以作為分子之間相互作用研究的檢測方法。 綠原酸單體和復配混合物的圓二色譜如圖8所示。

從圖8-A1和8-A2可以看出， 3-CQA和5-CQA與3,5-DICQA并不具有類似的圓二色性， 3,5-DICQA在363 nm處出現(xiàn)負的科頓效應， 在295和325 nm處出現(xiàn)正的科頓效應， 而3-CQA和5-CQA在最大吸收波長325 nm附近并沒有明顯的科頓效應， 僅在220 nm處存在較弱的正的圓二色性。 對比復配后的綠原酸混合物的圓二色譜發(fā)現(xiàn)原有的旋光特性未發(fā)生改變， 圓二色性信號的強弱與濃度呈現(xiàn)一定相關(guān)性， 因此在復配前后綠原酸分子間并未出現(xiàn)比如氫鍵等非共價鍵相互作用， 協(xié)同抗氧化的機理主要來自于綠原酸分子間的重生機制和體系的界面效應。

圖8 綠原酸異構(gòu)體及其二元復配體系CD譜圖

A1： CD spectra of 3-CQA, 3,5-DICQA and their binary compound combination; A2： CD spectra of 5-CQA, 3,5-DICQA and their binary compound combination

3 結(jié) 論

采用循環(huán)伏安法、 油水平衡常數(shù)和FTIR， XRD粉末衍射以及圓二色譜對綠原酸二元復配體系的協(xié)同抗氧化機理進行了研究， 綠原酸之間抗氧化活性差距越大， 高抗氧化活性的綠原酸含量越高， 兩者之間的油水平衡常數(shù)維持在0.13左右時的二元復配組合具有更高的協(xié)同抗氧化效果。 重生理論和抗氧化劑之間的界面效應是發(fā)生協(xié)同抗氧化作用的主要機理， 低抗氧化活性的綠原酸通過電子傳遞重生抗氧化活性高的綠原酸， 不同分散度的綠原酸在體系有序自動分布使得協(xié)同反應更有利進行， 此外并未在協(xié)同作用中發(fā)現(xiàn)綠原酸之間的氧化偶聯(lián)作用和分子之間的非共價鍵相互作用。

[1] Clifford M N. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79: 362.

[2] Sroka Z, Cisowski W. Food and Chemical Toxicology, 2003, 41(6): 753.

[3] Ong K W, Hsu A,Tan B K H. Biochemical Pharmacology, 2013, 85(9): 1341.

[4] Mullen W, Nemzer B, Ou B, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(8): 3754.

[5] Heo H J, Kim Y J, Chung D, et al. Food Chemistry, 2007, 104(1): 87.

[6] Palafox-Carlos H, Gil-Chávez J, Sotelo-Mundo R R, et al. Molecules, 2012, 17(11): 12657.

[7] JIA Gui-dong, YANG Jian-xiong, WANG Li， et al(賈貴東, 楊建雄, 王 莉, 等). Journal of Shaanxi Normal University·Natural Science Edition(陜西師范大學學報·自然科學版), 2010, (5): 61.

[8] Sim W L S, Han M Y,Huang D. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(9): 3409.

[9] Graversen H B, Becker E M, Skibsted L H, et al. European Food Research and Technology, 2008, 226(4): 737.

[10] Zhu Q Y, Huang Y, Tsang D, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(5): 2020.

[11] HU Xiu-fang, MAO Jian-mei(胡秀芳, 毛建妹). Journal of Tea(茶葉), 2000, 26(2): 66.

[12] Panya A, Kittipongpittaya K, Laguerre M L, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(41): 10320.

[13] Yin J, Becker E M, Andersen M L, et al. Food Chemistry, 2012, 135(4)： 2195.

[14] Peyrat-Maillard M, Cuvelier M,Berset C. Journal of the American Oil Chemists' Society, 2003, 80(10): 1007.

[15] Zhang D, Chu L, Liu Y, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(18): 10277.

[16] Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26(9): 1231.

[17] Thoo Y Y, Abas F, Lai O-M, et al. Food Chemistry, 2013, 138(2): 1215.

[18] Fang R, Jing H, Chai Z, et al. European Food Research and Technology, 2011, 233(2): 275.

[19] WU Ling-ling, HAN Muo, GE Er-ning, et al(吳玲玲, 韓 墨, 葛爾寧, 等). Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae(中國實驗方劑學雜志), 2010, 17: 96.

[20] Han R M, Tian Y X, Becker E M, et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 2384.

[21] Stalmach A, Mullem W, Nagai C, et al. Brazilian Journal of Plant Physiology, 2006, 18(1): 253.

[22] Xu J G, Hu Q P, Liu Y. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(40): 11625.

[23] HE Jian-bo, DU Jia-qi, YUAN Sheng-jie(何建波， 獨家啟， 袁圣杰， 等). Food Science(食品科學)， 2009， (9)： 37

[24] Nogala-Kalucka M, Dwiecki K, Siger A, et al. Acta Alimentaria, 2013, 42(3): 360.

*Corresponding author

Study on the Synergistic Antioxidant Mechanism of Chlorogenic Acids (CQAs) with Electrochemical and Spectroscopy Property

YANG Kai-zhou1,3, ZHAI Xiao-na1, WANG Jia-liang1, CHAI Zhi1, REN Fa-zheng1, LENG Xiao-jing1,2*

1. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

2. Beijing Innovation Team of Modern Agricultural Industry Technology System, Beijing 100083, China

3. Beijing Zhugula Coffee Co., Ltd., Beijing 100085, China

The synergistic antioxidant mechanism of chlorogenic acids (CQAs) was studied in this paper through cyclic voltammograms (CV), oil-water partition coefficient (P), FT-IR, XRD and circular dichroism (CD). The antioxidant capability of CQAs isomers and their mixture was determined by using ABTS free radical quenching ability assay. The results showed that the bigger the antioxidant activity disparity between the CQAs molecules was, the higher the content of high antioxidant activity CQAs was, the better the synergistic effect of the CQAs combination mixture became; The oxidation potential (Epa) of CQAs combination mixture kept constant in the synergistic experiments, which indicted the oxidative coupling interaction don't exist between the CQAs; The charge transferred (Q) and antioxidant activity exhibited high correlation (0.92); the practicalQwas higher than the theoreticalQin the synergistic process and this confirmed that the CQAs (dicaffeoylquinic acids) regeneration of high antioxidant activity happened; the CQAs mixture with the absolute difference value of oil-water partition coefficient of 0.13 gave the good interface effect and high synergistic degree; the interaction and the regular arrangement between the CQAs combination were not discovered through FT-IR, XRD and CD. Therefore, the regeneration mechanism of CQAs molecules and the interface effect of reaction system were the main cause of the phenomenon of the synergistic antioxidant of CQAs.

Chlorogenic acids; Synergistic Antioxidant; Cyclic Voltammetry; FTIR; XRD; CD

Apr. 3, 2015; accepted Aug. 11, 2015)

2015-04-03，

2015-08-11

國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B04)； 國家自然科學基金項目(31171771)資助

楊剴舟, 1986年生， 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院博士研究生 e-mail： beyondykz1986@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： lengxiaojingcau@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)08-2405-09