處理的牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響的研究

楊禾豐　胡瑜　孫晶晶　郭維華　田衛(wèi)東　李松.昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，昆明 65003；.口腔再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)），成都 6004

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處理的牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響的研究

楊禾豐1,2胡瑜1孫晶晶2郭維華2田衛(wèi)東2李松1
1.昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，昆明 650031；2.口腔再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)），成都 610041

[摘要]目的采用體外研究的方法評(píng)價(jià)處理的牙本質(zhì)基質(zhì)（TDM）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖及成骨分化的影響。方法將獲取的牙本質(zhì)顆粒進(jìn)行梯度脫礦處理，制備TDM浸提液。分離培養(yǎng)人BMSCs后，將BMSCs培養(yǎng)于TDM浸提液中，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，培養(yǎng)7 d后提取細(xì)胞總蛋白采用Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白：Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runx2）的表達(dá)情況。結(jié)果TDM浸提液培養(yǎng)后，與空白對(duì)照組及羥磷灰石/β-磷酸三鈣組相比，細(xì)胞增殖明顯；培養(yǎng)7 d后，TDM組的ColⅠ、Runx2蛋白的表達(dá)量明顯增高。結(jié)論TDM可以促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨向分化，提示其應(yīng)用于骨組織工程的可行性。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；分化；牙本質(zhì)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81360163);Doctoral Foundation of Kunming Medical University (2015D03).Correspondence: Li Song, E-mail: lisong59@sohu.com.

骨移植材料被廣泛地應(yīng)用于口腔領(lǐng)域，修復(fù)由牙周炎、創(chuàng)傷、腫瘤、先天性疾病等引起的頜骨組織缺損，以滿足維持牙槽骨的形態(tài)、功能及美學(xué)要求[1-2]。同種異體骨、異種骨、合成骨替代材料等是目前應(yīng)用較為廣泛的骨移植材料，但均存在一定的缺點(diǎn)[3]。牙齒，尤其是牙本質(zhì)具有與骨相似的有機(jī)和礦化物構(gòu)成成分[4]，并且獲得相對(duì)較易，較其他骨移植材料經(jīng)濟(jì)，甚至可以獲得自體的牙齒組織，從而避免生物安全性問題。因此，牙齒作為一種移植材料受到研究者的關(guān)注。本課題組將牙本質(zhì)基質(zhì)制備成根形支架，經(jīng)過系列處理后，用于牙根的再生[5-6]。Ji等[7]的研究發(fā)現(xiàn)在種植窩中植入處理的牙本質(zhì)基質(zhì)（treated dentin matrix，TDM）后，表面出現(xiàn)骨吸收陷窩，與周圍牙槽骨出現(xiàn)骨固連。據(jù)此推測(cè)，TDM可望成為一種骨移植替代材料。本研究旨在探討TDM對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖及成骨向分化的影響，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

改良α-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國(guó)），Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、油紅O、茜素紅（Sigma公司，美國(guó)），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），anti-Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，ColⅠ）抗體、anti-ALP抗體、anti-Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（runt-related transcription factor-2，Runx2）抗體、anti-STRO-1抗體（Abcam公司，美國(guó)），anti-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司），山羊抗小鼠/兔二抗、TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），CO2培養(yǎng)箱（Binder公司，德國(guó)），生物安全柜（Thermo公司，美國(guó)），高速手機(jī)（NSK公司，日本），超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司），高通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司）。

1.2BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1BMSCs的培養(yǎng)BMSCs由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，取自孕6月流產(chǎn)胎兒股骨骨髓，產(chǎn)婦及家屬對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將獲贈(zèng)的凍存BMSCs（P2代）于37 ℃水浴復(fù)蘇后，1 000 r·min-1離心5 min，去上清，加入含10% FBS的α-DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度后接種，培養(yǎng)4 h換液去除未貼壁細(xì)胞后，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3 d換液。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%時(shí)，按1︰3的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2BMSCs免疫熒光檢測(cè)取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，PBS清洗后4%多聚甲醛固定10 min，滴加0.5%TritonX-100處理15 min，1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30 min，滴加1%BSA稀釋的anti-STRO-1抗體（1︰100），以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，于37 ℃孵育2 h，加入TRITC標(biāo)志的熒光二抗，避光37 ℃孵育1 h，5 μg·mL-14’,6-二脒基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI]復(fù)染細(xì)胞核2 min，置于熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.3BMSCs多向分化能力檢測(cè)將BMSCs制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×105個(gè)，接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，將培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)液（在含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中添加10 mmol·L-1β-磷酸甘油鈉、10-8mol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1抗壞血酸、0.01 μmol·L-125-二羥維生素D3）、成脂誘導(dǎo)液（在含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中添加1 μmol·L-1地塞米松、10 μmol·L-1胰島素、0.5 mmol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌、0.2 mmol·L-1吲哚美辛）誘導(dǎo)BMSCs向成骨和成脂方向分化，每2 d換液，誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定，并分別用Gomori改良鈣鈷法、茜素紅鈣鹽染色法、油紅O染色法進(jìn)行染色，檢測(cè)BMSCs的多向分化能力。

1.3TDM對(duì)BMSCs作用的體外研究

1.3.1TDM浸提液的制備臨床收集因正畸治療需要拔除的前磨牙或阻生牙，患者對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。使用高速手機(jī)、金剛砂車針去除牙冠，拔除牙髓組織，沿牙根輪廓磨除牙骨質(zhì)及部分牙本質(zhì)，超聲振蕩清洗20 min重復(fù)3次，液氮冷凍2～3 h后，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥8 h（-50 ℃，真空度＜20 Pa）；使用高通量組織研磨儀進(jìn)行研磨（1 200 r·min-1，1 min，重復(fù)3～5次），將所獲得的TDM顆粒進(jìn)行梯度脫礦：17%、10%、5%EDTA分別脫礦5～10 min，PBS清洗3次。按照ISO 10993要求制備浸提液，以每20 g加入100 mL α-MEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2條件下浸提5 d，0.22 μm濾器過濾后添加10%FBS。

1.3.2TDM浸提液對(duì)BMSCs增殖的影響將BMSCs接種至96孔板中，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，待貼壁后吸出原培養(yǎng)基，每孔加入普通培養(yǎng)基、TDM浸提液、羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）/β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）浸提液（由四川大學(xué)生物材料國(guó)家工程研究中心提供，其中HA︰β-TCP為30︰70，浸提方法與TDM浸提液相同）150 μL培養(yǎng)1～7 d，檢測(cè)前每孔加入100 μL新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8，在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育3 h時(shí)，帶有450 nm濾光片的酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（optical density，OD）值，根據(jù)所測(cè)OD值，繪出生長(zhǎng)曲線。

1.3.3TDM浸提液對(duì)BMSCs成骨分化的影響 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代BMSCs，按每毫升1×105個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔板中，使用普通培養(yǎng)基（空白對(duì)照）、TDM浸提液、HA/β-TCP浸提液進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液，培養(yǎng)7 d。按全蛋白提取試劑盒操作步驟進(jìn)行，RIPA（強(qiáng)）裂解液提取BMSCs總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，4×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液按1∶3比例加入蛋白，煮沸8 min。取50 μg蛋白進(jìn)行8%和10%SDS-PAGE，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶非特異性封閉1 h；加入一抗︰anti-ColⅠ（1︰1 000）、anti-Runx2 （1︰1 000）以及GAPDH（1︰10 000），4 ℃過夜，加入山羊抗小鼠/兔二抗（1︰3 000稀釋）室溫孵育1 h，采用Immobilon? Western Chemiluminescent HRP Substrate進(jìn)行顯影，ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。結(jié)果采用ImageJ2X進(jìn)行目的蛋白灰度的分析，以目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示相對(duì)目的蛋白水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測(cè)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光抗原檢測(cè)

BMSCs生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)5～7 d即可傳代，傳代培養(yǎng)至第4代后細(xì)胞形態(tài)基本上趨于一致，胞體大，折光性好，細(xì)胞呈長(zhǎng)條梭狀（圖1左）。BMSCs免疫熒光染色顯示，STOR-1呈陽性，發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞核DAPI復(fù)染發(fā)出藍(lán)色熒光（圖1右），提示培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來源并具有干細(xì)胞特性。

圖1　BMSCs的生長(zhǎng)狀況Fig 1　Growth condition of BMSCs

2.2BMSCs向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化

經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d后，Gomori改良鈣鈷法染色可見，胞漿中可見灰黑色至深黑色ALP顆粒（圖2A）；茜素紅鈣鹽染色顯示紅色的礦化結(jié)節(jié)形成，呈散在分布，周邊界限不清（圖2B）。經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)14 d后，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)密集紅染的脂肪小滴（圖2C）。

2.3TDM浸提液對(duì)BMSCs增殖的影響

使用CCK-8試劑盒對(duì)BMSCs的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，將連續(xù)7 d測(cè)得的OD值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，3組細(xì)胞在第2天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～7 d進(jìn)入平臺(tái)期。與空白對(duì)照組及HA/β-TCP浸提液相比，TDM浸提液促進(jìn)了BMSCs的增殖。HA/β-TCP組則并未展現(xiàn)出明顯的促進(jìn)增殖的作用（圖3）。

圖2　BMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化情況　× 100Fig 2　Osteogenic and adipogenic differentiation potentials of human BMSCs　 × 100

2.4TDM浸提液對(duì)BMSCs成骨分化的影響

使用浸提液培養(yǎng)BMSCs 7 d后，采用Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白ColⅠ、Runx2的表達(dá)，并以目的蛋白/GAPDH的灰度比值對(duì)相對(duì)目的蛋白水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TDM組的ColⅠ、Runx2的表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組及HA/β-TCP組（P<0.05）（圖4）。

圖3　BMSCs的增殖情況Fig 3　Proliferation of BMSCs

圖4　Western blot檢測(cè)Col-Ⅰ和Runx2的表達(dá)Fig 4　Expression of Col-Ⅰand Runx2 by Western blot analysis

3　討論

骨組織工程的構(gòu)建涵蓋了骨組織替代材料修復(fù)骨缺損的3個(gè)關(guān)鍵要素：細(xì)胞的成骨性、生長(zhǎng)因子的骨誘導(dǎo)性以及支架材料的骨傳導(dǎo)性?；诠墙M織自身的再生能力以及臨床使用的便捷性，目前的骨組織工程傾向于無細(xì)胞支架材料的研發(fā)[8]。其中一個(gè)重要的思路是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的模擬，包括天然的脫細(xì)胞外基質(zhì)，如脫礦骨基質(zhì)以及負(fù)載成骨相關(guān)因子的合成材料的開發(fā)。TDM的物質(zhì)構(gòu)成與骨組織相類似[4]，同時(shí)含有大量的非膠原蛋白及具有生物活性的成骨/成牙相關(guān)的生長(zhǎng)因子[5,9]，在作為支架材料的同時(shí)構(gòu)建了相應(yīng)的誘導(dǎo)微環(huán)境。因此有學(xué)者[10-11]將各種形式的TDM應(yīng)用于骨組織缺損的修復(fù)。

Reis-Filho等[12]將10%EDTA脫礦3個(gè)月的人TDM植入SD大鼠拔牙窩模型，發(fā)現(xiàn)在植入7、14、21 d時(shí)拔牙窩中的新骨形成明顯增加，植入7和14 d，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)亦明顯增高。隨后的研究亦采用相同的脫礦TDM及大鼠模型表明新骨形成增加，在植入10 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)拔牙窩中有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2、BMP-4表達(dá)的細(xì)胞明顯增多[13]。然而，目前研究采用的往往是長(zhǎng)時(shí)間脫礦牙本質(zhì)或是煅燒牙本質(zhì)，導(dǎo)致其中蛋白成分不同程度的破化，并且機(jī)械強(qiáng)度降低。本課題組采用梯度脫礦的較為溫和的方法處理TDM，使表面部分脫礦膠原解離，牙本質(zhì)小管暴露，有利于成牙/成骨相關(guān)因子的釋放，并盡可能的保留這些蛋白的活性[5-6]，這些研究展現(xiàn)了其應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域的良好潛質(zhì)。

作為骨組織工程的支架材料，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化是其關(guān)鍵的功能之一。BMSCs與機(jī)體內(nèi)的骨形成和損傷后的修復(fù)密切相關(guān)，也是被廣泛應(yīng)用于骨組織工程的重要種子細(xì)胞[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)以BMSCs為干預(yù)對(duì)象，初步探討TDM對(duì)其增殖、分化的影響，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。目前BMSCs鑒定的常用方法為標(biāo)志物的檢測(cè)、成纖維細(xì)胞集落生成單位（colony forming unit-fibroblast，CFU-F）的形成以及多向分化能力的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物STRO-1，并在體外的誘導(dǎo)條件下具有向成骨及成脂細(xì)胞分化的能力與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

本實(shí)驗(yàn)采用TDM浸提液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并以應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)合成支架材料HA/β-TCP進(jìn)行比較。從細(xì)胞增殖結(jié)果來看，TDM對(duì)BMSCs增殖有促進(jìn)作用，提示與TDM釋放的生物活性物質(zhì)有關(guān)。HA/ β-TCP浸提液不抑制BMSCs的增殖，表現(xiàn)出一定的生物相容性，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道相似。ColⅠ是礦化骨組織中唯一的膠原蛋白，構(gòu)成了骨組織結(jié)構(gòu)的蛋白框架，是成骨細(xì)胞表型之一和形成鈣結(jié)節(jié)的基本條件，其表達(dá)的高低直接影響成骨細(xì)胞礦化的功能[17]。Runx2是成骨早期分化中重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多種下游的成骨相關(guān)基因如ALP、骨鈣素（bone gla protein，BGP）等的表達(dá)，決定間充質(zhì)干細(xì)胞成骨方向分化[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相較于其他兩組，經(jīng)過TDM浸提液處理的BMSCs其ColⅠ、Runx2的表達(dá)明顯增高。結(jié)合本課題組前期研究[5]TDM浸提液中含有ColⅠ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）、牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）等因子，提示其促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨向分化，與TDM釋放的生物活性物質(zhì)有關(guān)。其中TGF-β1在前成骨細(xì)胞的增殖分化過程中具有重要的促進(jìn)作用[8]，主要是通過促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的有絲分裂，大量增殖分化為成骨細(xì)胞，增加骨鈣鹽的沉積含量；同時(shí)抑制脂肪細(xì)胞生成；以及促進(jìn)骨細(xì)胞產(chǎn)生ColⅠ，抑制軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原，從而提高BMSCs的成骨效應(yīng)。同時(shí)，ColⅠ、DSP、DMP-1均是與生物礦化密切相關(guān)的蛋白能夠在一定程度上促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化作用。HA/β-TCP誘導(dǎo)成骨的機(jī)制是通過吸附內(nèi)源性BMP蛋白實(shí)現(xiàn)新骨形成，但在本實(shí)驗(yàn)的體外培養(yǎng)條件下ColⅠ、Runx2的表達(dá)并未明顯增高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TDM促進(jìn)了BMSCs的增殖以及成骨向分化，提示TDM作為骨移植材料應(yīng)用于骨組織工程是可行的。但TDM是否是適合的骨移植材料，其降解性、促進(jìn)新骨形成能力還需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，而其免疫原性，具體的作用機(jī)制還需要更為深入的研究。

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（本文編輯杜冰）

Treated dentin matrix enhances proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Yang Hefeng1,2, Hu Yu1, Sun Jingjing2, Guo Weihua2, Tian Weidong2, Li Song1.(1.The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China;2.National Engineering Laboratory for Oral Regenerative Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

[Key words]bone marrow mesenchymal stem cells;proliferation;differentiation;dentine

[Abstract]Objective The effect of treated dentin matrix (TDM) to the proliferation and osteogenesis differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is evaluated in vitro.Methods TDM leaching solution was prepared by dentine particles suffering from gradient demineralization.Human BMSCs were isolated and cultivated, and subsequently cultivated in the TDM leaching solution.The proliferation of BMSCs was detected by CCK-8.The osteogenesis-related proteins, including collagen typeⅠ(ColⅠ) and runt-related transcription factor-2 (Runx2), were extracted and detected by Western blot after a 7-day culture.Results Compared with the control group and hydroxyapatite （HA）/ β-tricalcium phosphate （β–TCP） group， the proliferation of BMSCs cultivated in TDM leaching solution was significantly improved.The expression of ColⅠ and Runx2 obviously increased after the 7-day cultivation in TDM leaching solution.ConclusionTDM can promote the proliferation and osteogenesis differentiation of BMSCs, implying the feasibility of the application in bone tissue engineering.

[中圖分類號(hào)]Q 254

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.013

[收稿日期]2015-11-10； [修回日期]2016-01-10

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81360163）；昆明醫(yī)科大學(xué)博士研究生創(chuàng)新基金（2015D03）

[作者簡(jiǎn)介]楊禾豐，主治醫(yī)師，博士，E-mail：yanghefeng2008@163.com

[通信作者]李松，教授，博士，E-mail：lisong59@sohu.com