MicroRNA-124a對(duì)SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制研究

張　芬

(同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 上海 200092)

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MicroRNA-124a對(duì)SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制研究

張芬

(同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 上海 200092)

摘要：探究microRNA-124a(miR-124a)對(duì)脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)繼發(fā)性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制.取90只健康成年Wistar大鼠建立SCI模型，隨機(jī)分為3組，第1組術(shù)后僅注射生理鹽水，為未治療組；第2組術(shù)后注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-D-NSCs)治療，為正常移植組；第3組術(shù)后注射攜帶miR-124a的骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞(miR-124a-BMSCs-D-NSCs)，為轉(zhuǎn)染移植組.另選取60只健康成年Wistar大鼠作為對(duì)照組，僅給予假手術(shù)處理.采用HE染色觀察大鼠的組織形態(tài)學(xué)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠的miR-124a表達(dá)情況，并對(duì)損傷灶進(jìn)行顯微測(cè)量計(jì)算，比較脊髓功能恢復(fù)的BBB評(píng)分情況及脊髓組織損傷大小的情況.結(jié)果顯示，SCI后，脊髓組織中miR-124a基因表達(dá)顯著降低，脊髓神經(jīng)功能也明顯降低，miR-124a-BMSCs-D-NSCs能夠有效地改善SCI，減少脊髓損傷組織范圍及體積，還能改善中樞神經(jīng)的功能.

關(guān)鍵詞：microRNA-124a； 脊髓損傷； 神經(jīng)功能； 作用機(jī)制

0引言

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，也是一種危害較大的急性病損.脊髓損傷后，其損傷部位節(jié)段以下的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能將出現(xiàn)明顯的障礙，甚至發(fā)生永久性喪失，發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率為13.3～45.9萬(wàn)人/年.2012年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示我國(guó)SCI患者約為100萬(wàn)人，且正于每年1萬(wàn)人的速率增長(zhǎng)，故臨床上應(yīng)對(duì)SCI引起足夠的重視[1].SCI后脊髓難以進(jìn)行組織修復(fù)，且功能重建也較為困難，這不僅與神經(jīng)元微弱的再生能力密切相關(guān)，還與脊髓損傷后快速出現(xiàn)的阻礙軸突再生的膠質(zhì)疤痕有關(guān).因此，對(duì)SCI治療的關(guān)鍵在于恢復(fù)和重建神經(jīng)功能，這也成為目前一直困擾醫(yī)學(xué)界的核心問(wèn)題[2].最近20年來(lái)，臨床上新發(fā)現(xiàn)了一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，即microRNAs(miRNAs).這一調(diào)節(jié)因子可廣泛表達(dá)于多種組織中，作為一種內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,對(duì)3′端非編碼區(qū)的保守性極高，可在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)起到很好的調(diào)控作用[3].MicroRNA是內(nèi)源的單鏈非編碼RNA(18～25個(gè)核苷酸)，在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[4—5].自從1993年第一個(gè)miRNA(line4)的發(fā)現(xiàn)，在生物體中，數(shù)千的miRNAs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn).miRNAs具有組織特異功能，能夠總體調(diào)控基因的表達(dá)，且可調(diào)控的人類蛋白編碼基因較多，至少有20%～30%的編碼基因可被調(diào)控[1]，miRNAs在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的種類更多、含量更高，呈高表達(dá).近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者[6—9]對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如創(chuàng)傷性腦損傷、SCI、腦卒中等的大量基因芯片實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs能夠有效地調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖[10]和凋亡過(guò)程，從而調(diào)節(jié)脊髓損傷、脊髓可塑性及脊髓損傷后的病理改變.miRNAs 包含的種類較多，如miRNA-9、 miRNA-21、miRNA-124、miRNA-155等，其中神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)最為富含的是microRNA-124a(miR-124a)，即miRNA-124的一種亞型.在細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中，miR-124a的表達(dá)水平可發(fā)生較大的變化[11—14].目前，學(xué)者對(duì)中樞神經(jīng)中miRNA-124表達(dá)情況的研究多集中在果蠅、小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)和人類相關(guān)組織中，較為局限，盡管在大鼠動(dòng)物中的研究尚較少[15]，但大鼠更適宜建立SCI模型.miR-124a作為神經(jīng)系統(tǒng)特異的microRNA，能夠?qū)ι窠?jīng)元的細(xì)胞周圍、細(xì)胞分化及脊髓發(fā)育等一系列重要生理活動(dòng)起到很好的調(diào)控作用，但尚未明了miR-124調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)病理?yè)p傷的機(jī)制.有研究發(fā)現(xiàn)，miR-124a是miRNAs中的一種能夠作為脊髓損傷的有效干預(yù)性治療靶點(diǎn)，但多數(shù)學(xué)者的報(bào)道尚存在一定的爭(zhēng)議[16]，本文進(jìn)一步探究了miR-124a對(duì)SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制.

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

選取140只正常成年雄性Wistar大鼠，大鼠體重在190～250 g之間，平均體重為(227.2±8.2)g，其中80只大鼠經(jīng)改良Allen’s法建立SCI模型，另60只大鼠給予假手術(shù)處理，分別為觀察組和對(duì)照組.

選取10只4周齡雄性Wistar大鼠，用于提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stroma cells， BMSCs).

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

儀器：臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)、Milli-Q 純水儀(Milipore公司)、凝膠成像系統(tǒng)(YNGENE公司)、Bio-Rad C1000 實(shí)時(shí) PCR 儀(Bio-Rad公司)、M651型手術(shù)顯微鏡(Leica公司).

試劑:TRIZOL Reagent (Invitrogen公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB)(Sigma公司)、NcodeTMVILOTMmiRNA cDNA Synthesis Kit(Invitrogen公司)、SYBR? Premix Ex TaqTMII Kit(Takara 公司)、以及氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(均為上海生工生物工程有限公司).

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR的引物：英濰捷基有限公司.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠SCI模型的構(gòu)建根據(jù)改良Allen’s制作大鼠脊髓夾傷動(dòng)物模型，模型構(gòu)建過(guò)程如下：先采取10%水合氯醛(3 mL/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉完成且效果滿意后，將大鼠取俯臥位置于手術(shù)臺(tái)上，四肢遠(yuǎn)端用皮繩固定于臺(tái)上，并采用軟墊將胸部墊高.定位手術(shù)切口位置，以T10棘突作為切口中心，以中心為起點(diǎn)沿脊柱向兩側(cè)切開(kāi)背側(cè)的皮膚及肌肉，并分離開(kāi)，使脊柱T8節(jié)段清晰地暴露出來(lái).在顯微鏡下，手術(shù)去除T8脊椎的椎板，再將特制的鑷子沿椎板腹側(cè)深入兩側(cè)的脊髓，并夾住脊髓，持續(xù)20 s后松開(kāi)并取出鑷子，將肌肉、皮膚逐層進(jìn)行縫合，術(shù)后人工輔助SCI大鼠排尿.

1.3.2干細(xì)胞的制備及移植從大鼠骨髓提取BMSCs[17],收集培養(yǎng)并純化第3代BMSCs[18].經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，75%的BMSCs處于G1期，以1×108細(xì)胞/L的密度進(jìn)行接種，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)鑒定符合干細(xì)胞的增殖規(guī)律，通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)的方法對(duì)細(xì)胞表面抗原表型的CD34和CD44進(jìn)行鑒定[19]，結(jié)果顯示CD34為陰性，而CD44為陽(yáng)性，進(jìn)而證實(shí)了分離的細(xì)胞為BMSCs，可開(kāi)展下一步的實(shí)驗(yàn).隨后加入生物誘導(dǎo)培養(yǎng)液[20—22]，模擬人體內(nèi)環(huán)境，誘導(dǎo)9 d[23]，促使上述分離純化的BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，同樣采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)顯示對(duì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陰性，神經(jīng)絲蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性，細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞活性，即得到BMSCs-D-NSCs.

通過(guò)查詢基因庫(kù)，合成引物前鏈和反義鏈引物，擴(kuò)增Rno-miR-124a，使用相同的限制性內(nèi)切酶來(lái)酶切PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP.得到酶切產(chǎn)物后，使用T4連接酶在16 ℃連接酶切片段.使用感受態(tài)細(xì)胞體外進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取克隆，進(jìn)行質(zhì)粒小提，并測(cè)序鑒定.轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)293T細(xì)胞[24]，使其密度達(dá)到85%左右.使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，進(jìn)一步進(jìn)行病毒制備得到含有miR-124a的病毒液.對(duì)病毒液體進(jìn)行離心濃縮，密度達(dá)到1.5×107pfu/mL左右，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下，用病毒液轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，在相同條件下，更換新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染36 h,檢測(cè)轉(zhuǎn)染率(顯微鏡中綠色熒光蛋白細(xì)胞的比例)達(dá)到85%.獲取病毒上清液感染BMSCs，并利用qRT-PCR測(cè)定miR-124a轉(zhuǎn)染BMSCs后及誘導(dǎo)成NSCs后的表達(dá)情況.結(jié)果顯示miR-124a的表達(dá)量、轉(zhuǎn)染后BMSCs的表達(dá)量是轉(zhuǎn)染前的29-fold.并進(jìn)一步觀察BMSCs-D-NSCs分化為神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的情況，其中 BMSCs-D-NSCs組的神經(jīng)元的分化比例為(31.4±3.53)%，膠質(zhì)細(xì)胞比例為(49.9±3.03)%；miR-124a-BMSCs-D-NSCs組的神經(jīng)元分化比例為(51.5±3.81)%，膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例為(40.1±1.88)%.

將SCI模型大鼠分為3組，分別為未治療組、BMSCs-D-NSCs組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs組.在SCI大鼠模型制備后的第7天，將BMSCs-D-NSCs和miR-124a-BMSCs-D-NSCs液進(jìn)行離心，使用1 mL的注射器抽取懸浮液，從而制備成為細(xì)胞懸液(1×106細(xì)胞/mL)，兩種懸液分別經(jīng)鼠尾靜脈注射給BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組，未治療組注射生理鹽水1 mL.

1.3.3取材用于RT-PCR的檢測(cè)的取材方法如下：在原手術(shù)切口上切開(kāi)皮膚，使脊髓階段暴露出來(lái)，截取SCI大鼠模型損傷區(qū)段的新鮮脊髓組織，對(duì)照組大鼠取相同脊髓區(qū)段的新鮮脊髓組織，將從兩組大鼠中取出的脊髓組織置于冰上，并剝離脊髓表面的硬脊膜及剔除脊髓中的血管，完成后立即放入液氮罐內(nèi)保存，并轉(zhuǎn)移至冰箱(-80 ℃).用于制備石蠟切片進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)的取材參考文獻(xiàn)[25]的研究，采用4%多聚甲醛灌注取材的方法.

1.3.4標(biāo)本組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)脊髓組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，染色過(guò)程依次經(jīng)過(guò)：脫蠟-蘇木素染色5 min-鹽酸乙醇分化30 s-自來(lái)水浸泡1 min-伊紅液染色2 min-固定封片，最后在顯微鏡下對(duì)脊髓組織及細(xì)胞情況進(jìn)行觀察.

1.3.5RT-PCR檢測(cè)miR-124a及計(jì)算方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書上的操作提取microRNA.隨后以此為模板進(jìn)行RT-PCR對(duì)miR-124a的測(cè)定.實(shí)驗(yàn)中使用Takara 公司的SYBR? Premix Ex TaqTMII Kit，以U6 snRNA為內(nèi)參對(duì)照基因，引物序列由英濰捷基有限公司合成.引物序列如下：U6 snRNA引物信息英濰捷基公司對(duì)此保有解釋權(quán)，miR-124a的引物信息為：UAAGGCACGCGGUGAAUGCC.

miR-124a的相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法是使用相對(duì)定量法：2-△△Ct用于表示miR-124a在脊髓的損傷組織的表達(dá)量和正常脊髓組織中表達(dá)量的倍數(shù).△△Ct=損傷脊髓組織(CtmiR-124a-CtU6 snRNA)-正常脊髓組織(CtmiR-124a-CtU6 snRNA).

1.3.6原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-124a采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-124a的表達(dá)情況.先處理石蠟切片，再進(jìn)行預(yù)雜交、雜交，雜交操作如下：先用2×SSC 沖洗切片15 min，再加入4×SSC/50%去離子甲酰胺，在37 ℃下進(jìn)行15 min的孵育，將50 μL的預(yù)雜交液加入每張切片中并放入濕盒內(nèi)，于42 ℃下進(jìn)行2 h 孵育；將每張片中的預(yù)雜交液去除，加入50 μL的雜交液并放濕盒中，于42 ℃下雜交12～18 h.雜交完畢后，用2×SSC洗滌約1～2 min，然后加入2×SSC/50%去離子甲酰胺，并于42 ℃下孵育10 min；再加入1×SSC/50%去離子甲酰胺，于37 ℃下孵育30 min；緊接著加入 4×SSC/10 mmol DTT，1 h后再加入 0.1×SSC 40 ℃，放置30 min，連續(xù)加入兩次.

其中miR-124a的探針序列為：G+GCA+TAC+A+C+CG+CGT+GCC+TTAA-DIG( “+”表示經(jīng)過(guò)LNA的修飾；DIG表示地高辛，用于標(biāo)記探針.)

1.4BBB評(píng)分法

根據(jù)BBB (Basso-Beattie-Bresnahan score, BBB)評(píng)分法[26]標(biāo)準(zhǔn)判斷SCI損傷大鼠和正常大鼠術(shù)后不同時(shí)相的脊髓神經(jīng)功能情況.檢測(cè)并計(jì)算術(shù)后各個(gè)時(shí)相SCI損傷大鼠和正常大鼠脊髓中miR-124a的相對(duì)表達(dá)量，再對(duì)SCI大鼠中未治療組、正常移植組和轉(zhuǎn)染移植組3組大鼠術(shù)后不同時(shí)相的神經(jīng)功能BBB評(píng)分結(jié)果.

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文中所有數(shù)據(jù)都是采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0來(lái)進(jìn)行分析的，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示計(jì)量資料.t檢驗(yàn)用來(lái)比較兩組間計(jì)量資料的差異，ANOVA中的LSD法用來(lái)比較3組間BBB評(píng)分的差異，P<0.05認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1正常大鼠及SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相的脊髓功能BBB評(píng)分情況

本文中參照改良的Allen’s建立SCI模型大鼠，為了檢測(cè)建立的大鼠SCI模型，對(duì)對(duì)照組和觀察組進(jìn)行BBB評(píng)分.結(jié)果顯示，觀察組大鼠術(shù)后各個(gè)時(shí)相的BBB評(píng)分均明顯低于對(duì)照組大鼠，兩組大鼠各個(gè)時(shí)相的BBB評(píng)分比較差異顯著(P<0.05)；觀察組大鼠隨著時(shí)相的延長(zhǎng)，BBB評(píng)分不斷升高，至術(shù)后7 d，BBB評(píng)分升高較其他時(shí)相更明顯，說(shuō)明神經(jīng)系統(tǒng)有一定的自我修復(fù)功能(圖1).

2.2正常大鼠及SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織的HE染色結(jié)果

基于上述BBB評(píng)分情況，進(jìn)一步采用HE染色的方法來(lái)觀察大鼠的組織形態(tài)(圖2).

圖1　正常大鼠和SCI損傷大鼠術(shù)后不同時(shí)相的脊髓功能BBB評(píng)分Fig.1　The BBB score of normal rats and SCI rats at different phases

圖2A為正常大鼠脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，圖2B為SCI損傷后6 h脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，圖2C為SCI損傷后12 h脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，圖2D為SCI損傷后24 h脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，圖2E為SCI損傷后3 d脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu),圖2F為SCI損傷后7 d脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu).(黑色箭頭指示紅細(xì)胞，白色箭頭指示炎癥細(xì)胞).

從圖2可以看出，正常大鼠脊髓組織的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)隨著時(shí)間的增加，出現(xiàn)不同程度的變化.HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后6 h，脊髓組織水腫廣泛出現(xiàn)；術(shù)后12 h～24 h，脊髓組織出現(xiàn)明顯壞死；術(shù)后3 d，脊髓組織灰白質(zhì)神經(jīng)元大片溶解、壞死，并伴有大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；術(shù)后7 d，脊髓組織廣泛嚴(yán)重壞死.

圖2　正常大鼠及SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織的HE染色結(jié)果(20×)

2.3正常大鼠及SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織中miR-124a的相對(duì)表達(dá)量

圖3　正常大鼠及SCI損傷大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織中miR-124a的相對(duì)表達(dá)量Fig.3　The expression of miR-124a in each time phase after the operation

為了觀察SCI模型大鼠術(shù)后miR-124a的表達(dá)情況，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR定時(shí)檢測(cè)上述SCI模型大鼠各個(gè)時(shí)相脊髓組織中miR-124a的含量.結(jié)果顯示觀察組大鼠各個(gè)時(shí)相脊髓組織中miR-124a的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組各個(gè)時(shí)相的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示有明顯差異(P<0.05)；觀察組大鼠術(shù)后7 d脊髓組織中miR-124a的表達(dá)量最高，明顯高于其他時(shí)相，不同時(shí)相的miR-124a的表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)，表明在SCI的不同病理階段，miR-124a的表達(dá)量不同.同時(shí)miR-124a表達(dá)變化與BBB評(píng)分的升高趨勢(shì)(圖1)基本一致，推測(cè)miR-124a高表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)的重建有關(guān).

2.4正常大鼠及SCI模型大鼠術(shù)后不同時(shí)相脊髓組織中miR-124a的分布

采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-124a的分布，其中以胞漿的染色作為細(xì)胞定位的指標(biāo).陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果為胞漿被染成藍(lán)紫色，陰性反應(yīng)為胞漿未被染成藍(lán)紫色(圖4).

圖4中，A為正常大鼠，B為SCI損傷后6 h，C為SCI損傷后12 h，D為SCI損傷后24 h，E為SCI損傷后3 d，F(xiàn)為SCI損傷后7 d.

圖4　原位雜交檢測(cè)miR-124a的表達(dá)結(jié)果(25×)

結(jié)果顯示，正常大鼠的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，為強(qiáng)陽(yáng)性，脊髓損傷7 d后同樣呈強(qiáng)陽(yáng)性.而脊髓損傷6 h、12 h、24 h、3 d后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，表現(xiàn)為弱陽(yáng)性.這一結(jié)果也與熒光定量PCR的結(jié)果類似.

2.53組SCI模型大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能BBB評(píng)分情況

3組SCI模型大鼠術(shù)后1 w的神經(jīng)功能BBB評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后2 w，正常移植組和轉(zhuǎn)染移植組大鼠的BBB評(píng)分均明顯高于未治療組(P<0.05)，正常移植組和轉(zhuǎn)染移植組大鼠的BBB評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后4 w、6 w，3組大鼠的BBB評(píng)分存在顯著差異(F=5.136、5.743，P<0.05)，其中正常移植組、轉(zhuǎn)染移植組的BBB評(píng)分高于未治療組，轉(zhuǎn)染移植組高于正常移植組(見(jiàn)圖5).結(jié)果表明BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組均能促進(jìn)SCI的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù).

2.63組 SCI模型大鼠術(shù)后4 w脊髓組織損傷灶范圍大小情況

參考文獻(xiàn)[27]的計(jì)算方法，將組織切片經(jīng)顯微測(cè)量計(jì)算后，結(jié)果顯示，相對(duì)于未治療組，正常移植組SCI大鼠脊髓組織損傷灶減少的體積為(3.36±0.23)%，轉(zhuǎn)染移植組SCI大鼠脊髓組織損傷灶減少的體積為(6.39±0.33)%，兩組大鼠脊髓組織空洞減少比例的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖6).

圖5　3組SCI模型大鼠術(shù)后各個(gè)

圖6　與治療組相比，正常移植組與

3討論

miRNA是調(diào)節(jié)脊髓發(fā)育和可塑性的重要因子，其在脊髓組織中特異性表達(dá)，且呈高度表達(dá)，能夠嚴(yán)格調(diào)控脊髓的發(fā)育.多數(shù)關(guān)于脊髓發(fā)育過(guò)程中miRNA表達(dá)變化的研究顯示，miRNA的差異性表達(dá)與脊髓的發(fā)育密切相關(guān)[27].多數(shù)國(guó)外學(xué)者通過(guò)RT-PCR、原位雜交等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成年小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中存在較多種類的miRNA表達(dá)，且呈高度表達(dá)的miRNA與CNS的特定功能密切相關(guān)[28—32].在CNS中研究最多的miRNA是miR-124.miR-124在脊髓組織和其他非神經(jīng)組織中表達(dá)的含量存在顯著差異，在脊髓組織中的含量較非神經(jīng)組織高出100倍，具有CNS組織特異性.miR-124對(duì)脊髓發(fā)育的影響主要是通過(guò)Sox9這一靶分子實(shí)現(xiàn)的，其另一個(gè)靶分子小C端磷酸酶1具有抑制神經(jīng)元性基因表達(dá)的作用，miR-124通過(guò)這一靶分子可對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的分化成熟起到很好的促進(jìn)作用[33].miR-124具有3種亞型，其中以miR-124a最為常見(jiàn)，并參與CNS的發(fā)育、損傷及腫瘤等進(jìn)展.

文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn)，miR-124a在SCI損傷小鼠模型中的表達(dá)與時(shí)間存在明顯的依賴性，其表達(dá)的下調(diào)可能是由于神經(jīng)細(xì)胞死亡導(dǎo)致.利用基因芯片技術(shù)與RFPCR技術(shù)對(duì)缺氧缺血腦損傷小鼠損傷前后腦組織中miR-124a的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，與正常的腦組織相比，缺氧缺血性腦損傷小鼠腦組織中miR-124a的表達(dá)明顯上調(diào)，提示缺血缺氧條件可促進(jìn)miR-124a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，使腦損傷得到修復(fù).文獻(xiàn)[34]等還發(fā)現(xiàn)，阻斷CNS中miR-124a的表達(dá)后，神經(jīng)再生出現(xiàn)明顯的延遲.上述研究均表明miR-124a在CNS損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，可作為有效靶點(diǎn)干預(yù)CNS損傷.本文對(duì)正常大鼠及SCI損傷大鼠脊髓組織中的miR-124a表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，SCI損傷大鼠術(shù)后各個(gè)時(shí)相的miR-124a表達(dá)量均明顯下調(diào)，且SCI損傷大鼠各個(gè)時(shí)相的miR-124a表達(dá)量存在一定差異，以術(shù)后7 d最高(P<0.05)，上述結(jié)果表明在正常脊髓組織內(nèi)大量表達(dá)的miR-124a在SCI后可出現(xiàn)明顯下調(diào)，這與CNS中大量細(xì)胞損傷有關(guān).

目前，臨床上認(rèn)為有效治療SCI的方法是神經(jīng)干細(xì)胞移植，神經(jīng)干細(xì)胞移植后分化產(chǎn)生的多種細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等，可填補(bǔ)脊髓損傷區(qū)域內(nèi)缺失的神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)功能修復(fù)十分有幫助.SCI損傷后小鼠的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能均明顯減退，甚至永久性喪失.在SCI大鼠脊髓損傷處植入的干細(xì)胞可很快被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)十分有幫助，有效改善了SCI損傷大鼠的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能.本文還對(duì)正常大鼠及SCI損傷大鼠術(shù)后不同時(shí)間的神經(jīng)功能BBB評(píng)分進(jìn)行了對(duì)比.數(shù)據(jù)顯示，兩組大鼠術(shù)后不同時(shí)間的BBB評(píng)分存在較大差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明SCI后，大鼠的神經(jīng)功能開(kāi)始顯著降低.miR-124a能夠有效調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化，在后期神經(jīng)元分化成熟過(guò)程中呈高表達(dá).對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞經(jīng)miR-124a轉(zhuǎn)染后，神經(jīng)元細(xì)胞的分化過(guò)程受到明顯促進(jìn)，更利于神經(jīng)功能的恢復(fù).本研究對(duì)比了未治療組、正常移植組(BMSCs-D-NSCs)和轉(zhuǎn)染移植組(miR-124a-BMSCs-D-NSCs)大鼠術(shù)后不同時(shí)間的BBB評(píng)分.結(jié)果顯示，3組大鼠術(shù)后4 w、6 w的BBB評(píng)分兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤以轉(zhuǎn)染miR-124a后神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠的BBB評(píng)分最高，這說(shuō)明SCI后，選擇移植轉(zhuǎn)染miR-124a的神經(jīng)干細(xì)胞較移植普通神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的修復(fù)作用更好，可促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能更好地恢復(fù).

本文中BMSCs-D-NSCs移植組和miR-124a-BMSCs-D-NSCs移植組，都表現(xiàn)出了SCI后對(duì)神經(jīng)功能的修復(fù)作用，且miR-124a-BMSCs-D-NSCs的效果更為顯著.因此，miR-124a在大鼠SCI的治療過(guò)程中，可以明顯地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，為SCI后的細(xì)胞替代治療提供了一個(gè)新思路，這可能是與miR-124a促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化的機(jī)制密切相關(guān).

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Effects of MicroRNA-124a on SCI Secondary Injury and the Underlying Mechanism

ZHANG Fen

(CollegeofLifeScienceandTechnology,ShanghaiTongjiUniversity,Shanghai200092,China)

Abstract:How miR-124a affects the secondary injury of spinal cord injury (SCI) and its related mechanism were studied. SCI model was established by gathering 80 healthy adult Wistar rats, which were divided into three groups. The first group, injected with saline only after operation, was the untreated group. The second group, injected with BMSCs-D-NSCs for treatment after operation, was the normal transplantation group. The third group, injected with miR-124a-BMSCs-D-NSCs for treatment after operation, was the transfected transplantation group. Another 60 healthy adult rats were used as the control group, which only accepted sham-operation. Histomorphology change was observed via HE staining, the miR-124a expression was tested via quantitative real-time PCR, and the lesion site was micro-measured and calculated. The result showed that after SCI, the expression of miR-124a in spinal cord tissue remarkably decreased, so did the spinal cord nerve function. miR-124a-BMSCs-D-NSCs can, decrease the injured area and size of spinal cord and improve the function of CNS.

Key words:microRNA-124a; spinal cord injury; neurological; mechanism

收稿日期:2015-11-09

作者簡(jiǎn)介:張芬(1989—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究，E-mail:93fenzhang@#edu.cn.

中圖分類號(hào)：Q6-33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1671-6841(2016)01-0073-08

DOI:10.3969/j.issn.1671-6841.201511007

引用本文：張芬.microRNA-124a對(duì)SCI繼發(fā)性損傷的影響及相關(guān)機(jī)制研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2016，48(1)：73—80.